בידוד תאי אצינר ראשוני: שיטה לבידוד תאי אצינר מלבלב עכבר

- תא אצינר לבלב הוא תא אקסוקריני המכיל מגוון אנזימי עיכול. לפעמים, בתגובה לאיתות אונקוגני, התא האסינארי הופך לתא דוקטלי. תא צינורי זה יכול מאוחר יותר להפוך לסרטני. לכן, חיוני לבודד את תאי acinar כדי לחקור את תפקידם בהתקדמות סרטן הלבלב.

התחל על ידי בידוד הלבלב מעכבר המתת חסד. מוסיפים את הלבלב לסירת שקילה המכילה תמיסת מלח מאוזנת בתוספת אנטיביוטיקה. טוחנים את הלבלב לחתיכות קטנות באמצעות מספריים ומוסיפים את רקמת הלבלב לצינור. לאחר מכן, להוסיף פתרון collagenase לחתיכות הלבלב בצינור.

Collagenase מעכל את הקולגן שמחזיק את הרקמה יחד כך שהרקמה נשברת לחתיכות עדינות. כעת, הוסיפו מדיה המכילה סרום לצינור והניחו את הרקמה על קרח. זה עוזר לעצור את הפעולה של collagenase.

סנן את הרקמה ואת המדיה פעמיים, והקטנת גודל הרשת של המסנן בהדרגה בכל פעם כדי לקבל תרחיף רקמה עדין. לבסוף, צנטריפוגה את המתלה שנוצר כדי לאסוף את התאים acinar בכדור. הסר את supernatant ולאחסן את התאים acinar לניתוח נוסף. בפרוטוקול הבא נבודד תאי אצינר מהלבלב של עכבר שעבר המתת חסד.

- כדי לנתח את הלבלב מעכבר שעבר המתת חסד, יש להצמיד תחילה את כפות העכבר למכסה הפוליסטירן, לכוון אותו כך שהזנב יפנה אל החוקר, ולרסס את הבטן באתנול 70%. השתמש במלקחיים autoclaved להרים את הפרווה והעור בקו האמצע, ועם מספריים autoclaved, לבצע חתך דרך הפרווה והעור מפתח השופכה לאזור כלוב צלעות הסרעפת. בצע חתכים נוספים משמאל ומימין כדי לחתוך את הפרווה והעור, יצירת תצוגה ברורה של חלל הבטן.

לאחר מכן, לחתוך לתוך רירית הצפק באמצע ימינה ושמאלה, ולמשוך אותו מן האיברים. השתמש במלקחיים כדי להרים את המעיים ולהניע אותם לצד שמאל של העכבר, יצירת מקום לראות את הלבלב הוורוד הבהיר מחובר לטחול הסגלגל האדום כהה. רקמת הלבלב תהיה בעלת מרקם רך וספוגי. חותכים את הלבלב, אשר פועל לאורך הבטן, משתלב עם המעיים.

מפרידים את הטחול מהלבלב ומניחים את הלבלב בצינור 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר HBSS עם 1X פניצילין-סטרפטומיצין ומעבירים אותו למכסה המנוע של הזרימה הלמינרית. יוצקים את תכולת הצינור לסירת שקילה ריקה ומשתמשים במלקחיים כדי לשטוף את הלבלב על ידי ערבולו. לאחר מכן השתמשו במלקחיים כדי להעביר את הלבלב לסירת שקילה שנייה המכילה HBSS עם פניצילין-סטרפטומיצין ושטפו שוב על ידי ערבול.

מעבירים את הלבלב לסירת השקילה השלישית המכילה HBSS עם פניצילין-סטרפטומיצין ומתחילים לחתוך את הלבלב לחתיכות של 5 מ"מ או פחות. כדי לשפוך את תכולת סירת השקילה לתוך צינור טרי של 50 מיליליטר, השתמש תחילה במלקחיים כדי להעביר את חתיכות הלבלב לתוך הנוזל בזמן הטיית הסירה. ברגע שהחלקים כבר לא מחוברים לסירה, שפכו את תכולתה לתוך הצינור. הרימו את כל החתיכות שנותרו עם המלקחיים ושטפו את המלקחיים בצינור.

לאחר צנטריפוגה של הצינור ב-931 פעמים כוח הכבידה ב-4 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות, השתמשו בפיפט 5 מיליליטר כדי להסיר את ה-HBSS וכל שומן צף. מוסיפים 5 מיליליטר של collagenase מדולל HBSS. סגור את הצינור וודא מכסה אטום על ידי עטיפת הצינור בסרט פרפין מפלסטיק. מניחים אותו באינקובטור, רועד ב-220 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, מה שיניב תמיסה עכורה ומעט חתיכות רקמה שנותרו.

כדי לעצור את הדיסוציאציה, הניחו את הצינור על קרח והוסיפו 5 מיליליטר HBSS קר עם 5% FBS. לאחר צנטריפוגה של פי 931 מכוח הכבידה ב-4 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות, מסירים את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה של 5 מיליליטר. השהה מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר HBSS עם 5% FBS וצנטריפוגה שוב ב-931 פעמים כוח הכבידה למשך שתי דקות ב-4 מעלות צלזיוס.

הסר את supernatant באמצעות פיפטה 5 מיליליטר וחזור על שלב זה עם עוד 10 מיליליטר של HBSS עם 5% FBS. לאחר מכן להשעות מחדש את הגלולה ב 5 מיליליטר של HBSS עם 5% FBS. השתמש פיפטה P1000 כדי לסנן את תרחיף התא 1 מיליליטר בכל פעם דרך רשת 500 מיקרומטר לתוך צינור 50 מיליליטר.

כדי לשטוף את כל תאי הלבלב הנותרים דרך הרשת, להוסיף 5 מיליליטר נוספים של HBSS עם 5% FBS. לאחר מכן השתמשו בפיפט P1000 כדי להעביר את המסנן הזה 1 מיליליטר בכל פעם דרך רשת של 105 מיקרומטר לתוך צינור של 50 מיליליטר. הכניסו בעדינות את תרחיף התא הזה לצינור של 50 מיליליטר המכיל HBSS עם 30% FBS, אשר יהווה שכבה של תרחיף תאים בחלק העליון.

צנטריפוגה של תא זה מתלה פי 233 מכוח הכבידה ב-4 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות ומסירה את הסופרנטנט. השהה מחדש את הגלולה המכילה את תאי האצינר בתווך המלא של 1X Waymouth.