בידוד איי הלבלב באמצעות זילוח Collagenase: שיטה אנזימטית לבידוד תאי איון הלבלב

- תאי האילט בלבלב מייצרים הורמונים חיוניים המעורבים בתפקודים אנדוקריניים. כדי לבודד איונים, ראשית, אבטחו עכבר שעבר המתת חסד וחשפו בניתוח את חלל הבטן שלו. הברישו הצידה את הכבד והמעיים כדי לאתר ולהדק את צינור המרה המשותף. זהה את האמפולה של Vater, הצינור שנוצר על ידי איחוד של הלבלב צינורות מרה נפוצים.

לאחר מכן, הזריקו תמיסת אנזים קולגנאז לצינור המרה הנפוץ. הזרימה האחורית מהצינור מנפחת בהצלחה את הלבלב, ומקלה על דיסוציאציה הנגרמת על ידי collagenase של רקמות הלבלב. הבלו את הלבלב לתוך צינור המכיל יותר פתרון collagenase. קוצצים באופן מכני את הרקמה ודוגרים כדי לסייע לעיכול הרקמה על ידי הקולגנאז.

לאחר קבלת תרחיף הומוגני, לעצור את העיכול האנזימטי על ידי הוספת תמיסה המכילה חלבונים המעכבים את פעילות collagenase. צנטריפוגה לאיסוף כדורית רקמה. השהה מחדש את הגלולה בתווך שיפוע צפיפות מתאים, שכב מעליה חיץ מתאים וצנטריפוגה ליצירת שכבות מעבר צבע.

אספו איים מהשכבה שנוצרה בין מדיום שיפוע הצפיפות לבין החיץ. לבסוף, בחרו איים בריאים לטיפוח. בפרוטוקול הבא נדגים בידוד של איי לבלב מורין על ידי מתן קולגן ואחריו צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות.

- התחל על ידי הדבקת הגפיים של העכבר במצב שכיבה וריסוס הגוף עם 70% אתנול. בעזרת מלקחיים מזכוכית כיסוי ומספריים כירורגיים מעוקלים, יש לבצע חתך אופקי בעור הבטן בקוטר של כ-3 ס"מ, ולפתוח את העור כדי לחשוף את דופן הבטן. בצע חתך אנכי של 3 עד 4 ס"מ בצפק הבטן כדי לחשוף את הלבלב במלואו, והנח את העכבר מתחת למיקרוסקופ ניתוח.

דחפו את אונת הכבד בצורה מעולה כדי לחשוף את צינור המרה, המופיע כצינור חיוור וורוד, והזיזו בעדינות את המעיים מאזור המותני והאיליאק הימני מימין לחלל הבטן כדי לחשוף את צינור המרה ועורק הכבד. השתמש שורץ מיקרו Serrefines בזהירות להדק את צינור המרה המשותף קרוב ככל האפשר לכבד ולזהות את אמפולה של Vater, אשר ממוקם על פפילה התריסריון נוצר על ידי האיחוד של צינור הלבלב ואת צינור המרה המשותף.

באמצעות מלקחיים של Micro Adson כדי למשוך את צינור המרה המשותף, הכנס מחט בגודל 30 אינץ 'חצי אינץ 'המחוברת למזרק 3 מיליליטר המכיל 3 מיליליטר של תמיסת collagenase P טרייה שהוכנה לתוך האמפולה של Vater, דוחף את המחט לתוך הצינור במקביל לכלי במשך כרבע מאורך הכלי. ברגע שהמחט נמצאת במקומה, ייצבו את המחט בעזרת מלקחיים Micro Adson והזריקו לאט ובהתמדה 3 מיליליטר של תמיסת collagenase P לתוך הצינור. הזריקה נחשבת מוצלחת אם אזורי הראש, הצוואר, הגוף והזנב של הלבלב מנופחים במלואם.

- כניסה נכונה לאמפולה וקנולציה של צינור המרה המשותף הם קריטיים לקציר עיכול מוצלח. פירסינג בדפנות הצינור מפחית את יעילות הבידוד.

- בעזרת מלקחיים מעוקלים ומיקרו אדסון, מוציאים בזהירות את הלבלב המנופח החל מהטחול וממשיך לכיוון הקיבה ולאורך התריסריון. לאחר מכן הניחו את הלבלב בצינור עיכול של 50 מיליליטר המכיל 3 מיליליטר של תמיסת P של collagenase קר כקרח. כדי לקצור את האיונים, ראשית, השתמש מספריים כירורגיים עדינים כדי לחתוך את הלבלב במשך 3 עד 5 שניות לפני הנחת הצינור באמבט מים 37 מעלות צלזיוס ב 100 עד 120 סיבובים לדקה במשך 12 עד 13 דקות.

בסוף הדגירה, נערו בעדינות את הצינור למשך כ -30 שניות כדי לשבש את הרקמה עד שהתמיסה הומוגנית, כפי שאושר על ידי חלקיקי רקמת לבלב עדינים דמויי חול. ברגע שהרקמה מתעכלת, מניחים את הצינור על קרח ומוסיפים 40 מיליליטר של תמיסת עצירה קרה כקרח כדי לסיים את התגובה האנזימטית. לאחר שיבוש עדין של הכדורית, סובבו את רקמת העיכול בצנטריפוגת דלי מתנדנדת ואחריה שתי צנטריפוגות עם 20 מיליליטר של תמיסת עצירה טרייה בכל שטיפה.

לאחר השטיפה האחרונה, יש להשהות מחדש את הגלולה ב-40 מיליליטר HBSS קר כקרח למשך שלוש שטיפות נוספות, ולהשהות מחדש את הגלולה ב-5 מיליליטר של תמיסת שיפוע צפיפות טמפרטורת החדר לאחר השטיפה האחרונה. מערבבים את הצינור לזמן קצר במהירות נמוכה עד לתמיסה הומוגנית לפני הוספת 5 מיליליטר נוספים של שיפוע צפיפות טמפרטורת החדר לצינור. כעת השתמשו בפיפט 10 מ"מ כדי להוסיף בעדינות ובאיטיות 10 מילימטרים של HBSS בטמפרטורת החדר לצינור בצורה טיפתית כדי לאפשר היווצרות שיפוע, והשתמשו בצנטריפוגת דלי מתנדנדת כדי לבודד את אוכלוסיות התאים על ידי הפרדת שיפוע צפיפות.

בסוף הצנטריפוגה, השתמשו בפיפט של 10 מיליליטר, רטוב מראש עם HBSS קר כדי לאסוף 5 עד 10 מיליליטר של שכבת האיון בין שיפוע הצפיפות לבין HBSS. מעבירים את האיים לתוך צינור חדש של 50 מיליליטר המכיל 20 מיליליטר HBSS טרי וקר כקרח, ואוספים את התאים באמצעות צנטריפוגה בצנטריפוגת דלי מתנדנדת. שאפו בזהירות את כל הסופרנאטנט מלבד 3 המיליליטרים האחרונים מבלי להפריע לכדורית, ושטפו את האיים לפחות שלוש פעמים נוספות עם 20 מיליליטר HBSS טרי בכל כביסה.

לאחר השטיפה האחרונה, להחליף את supernatant עם 4 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס סל"ד 1640 בינוני ולסובב בעדינות את הצינור כדי לעקור את הכדורית. מיד לשפוך את האיים לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ, ולשטוף את הצינור עם 5 מיליליטר של סל"ד טרי 1640 בינוני כדי לאסוף את כל האיים שנותרו, איגום את הכביסה עם איים אחרים.

לאחר מכן השתמשו במיקרוסקופ דיסקציה ובקצה פיפטה של 20 מיקרוליטר כדי לבחור איים בריאים כדוריים או מלבניים, זהובים-חומים, עם משטח חלק מצלחת הפטרי להעברה לצלחת פטרי חדשה המכילה 10 מיליליטר של מדיום RPMI 1640 מלא. לאחר איסוף כל האיונים, הניחו את האיים באינקובטור הסטרילי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני באוויר לח למשך הלילה.