צביעה אימונופלואורסצנטית של ספרואידים: טכניקה לניתוח ספרואידים לביטוי ביטוי אנטיגן תוך תאי וחוץ-תאי

- ספרואידים הם מודלים תלת ממדיים של תרביות תאים במבחנה. עבור צביעה immunofluorescent, הראשון, ליצור תרבית spheroid של סוג התא הנדרש בצלחת multiwell. באמצעות מיקרופיפטה עם קצה פתח רחב, לאסוף את הספרואידים, תוך הקפדה על מניעת קרע עקב כוחות גזירה.

לאחר מכן, לתקן ולחדור את הספרואידים כדי להפוך תאים בודדים חדירים. כעת, דגרו עם תמיסה המכילה חלבונים כדי לחסום אתרי אינטראקציה לא ספציפיים של חלבונים על פני התא. טפלו בכדורידים עם קוקטייל נוגדנים ראשוני רצוי. דגירה כדי שהנוגדנים ייקשרו למולקולות המטרה שעל פני התא.

לאחר מכן, תייגו את הספרואידים בתמיסת נוגדנים משנית עם תווית פלואורסצנטית ספציפית לנוגדנים הראשוניים. לבסוף, טפלו בכדורידים עם צבע פלואורסצנטי מתאים קושר DNA כדי להכתים את גרעיני התא. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סורק לייזר, צלם חתכים אופטיים מרובים של הספרואיד במישורים אופטיים שונים.

התמונות שצולמו משקפות גרעינים בעלי תווית ניאון ואנטיגנים מעניינים. מזג את הערימות באמצעות תוכנה רלוונטית כדי לקבל את התמונה הסופית מרוכבת של spheroid 3D. בפרוטוקול הבא, נבצע צביעה אימונופלואורסצנטית של ספרואידים של פיברובלסטים בלבלב ופיברובלסטים הקשורים לסרטן בתרבית בנוכחות ממריץ, TGF בטא 1.

- ראשית, חתכו קצה פיפטה כדי להגדיל את הפתח. לאחר השלמת הדגירה, השתמש בקצה פיפטה חתוך זה כדי לאסוף את הספרואידים לתוך צינור תגובה אחד של 1.5 מיליליטר, לכל תנאי ניסוי או לכל חלבון שיש לנתח. צנטריפוגות את הספרואידים במהירות של פי 1,000 גרם למשך כ-30 עד 60 שניות. בזהירות להסיר את methylcellulose המכיל supernatant על ידי pipetting, לוודא לא להפריע spheroids כדורי.

- יש לנקוט בזהירות מיוחדת בעת העברת הספרואידים לצינורות התגובה. ודא שאין לך כוחות לחץ גזירה על ידי חיתוך הקצה. חשוב גם לאסוף את כל הספרואידים. במהלך שלב הכביסה, ודא שאתה לא מאבד את הספרואידים על ידי שאיפה.

- כדי לשטוף את הספרואידים ב 50 מיקרוליטר של 1X PBS, צנטריפוגה ב 1,000 פעמים גרם במשך 30 עד 60 שניות, ולאחר מכן בזהירות להסיר את PBS על ידי pipetting. בהתאם לחלבון שיש להכתים, תקן את הספרואידים עם 50 מיקרוליטר של 4% paraformaldehyde ב PBS במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.

לשטוף את spheroids עם PBS כפי שתואר לעיל. חדרו לתאים עם 0.1% טריטון X ב-PBS למשך 4 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לשטוף את spheroids ב PBS שלוש פעמים, כפי שתואר לעיל. הוסיפו PBS המכיל 5% FBS ו-2% BSA לספרואידים ודגרו בטמפרטורת החדר למשך שעה כדי לחסום אתרי אינטראקציה לא ספציפיים עם חלבונים.

כעת, לדגור על הספרואידים עם 30 מיקרוליטר של נוגדנים ראשוניים ב-PBS עם 2.5% FBS ו-1% BSA ב-4 מעלות צלזיוס בן לילה. למחרת, שטפו את הספרואידים ב-PBS שלוש פעמים כפי שתואר קודם לכן.

לאחר מכן, לדגור את הספרואידים עם 30 מיקרוליטר של נוגדנים משניים PBS עם 2.5% FBS ו 1% BSA בטמפרטורת החדר במשך 90 דקות. לשטוף את spheroids ב PBS שלוש פעמים כפי שתואר לעיל.

לאחר מכן, לדגור על התאים עם 30 מיקרוליטר של תמיסת צביעה DAPI במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את spheroids ב PBS פעם אחת כפי שתואר לעיל. בעזרת פיפטה פסטר מזכוכית, מניחים את הספרואידים על מגלשת זכוכית בטיפת PBS. השתמש במיקרוסקופ סריקת לייזר כדי לצלם את הספרואידים במיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של פי 10. קח חתך אופטי שונה של הספרואיד במישורים אופטיים שונים של ערימת Z.