בדיקת שטף חוץ-תאי בספרואידים תלת-ממדיים: שיטה למדידת הפעילות המטבולית של ספרואידים של גידולי לבלב

- תאי סרטן הלבלב מתקשרים עם פיברובלסטים הקשורים לסרטן במיקרו-סביבה של הגידול או TME. אינטראקציות אלה מווסתות את הפעילות המטבולית של התאים הסרטניים ומשפיעות על התקדמות הסרטן.

ספרואידים הם הצברים התאיים שמחזירים את ה-TME במבחנה. לכן, אנו יכולים להשתמש בספרואידים אלה כדי לבחון את השינויים בתפקודים המטבוליים של הגידול על ידי בדיקת שטף חוץ-תאי. בדיקה זו מודדת את הריכוז החוץ תאי של חמצן ופרוטונים כדי לקבוע מטבוליזם אירובי וגליקוליטי, בהתאמה.

התחל על ידי נטילת ספרואידים 3D בגודל מתאים שנעשו על ידי גידול משותף של תאי סרטן הלבלב עם פיברובלסטים הלבלב. כעת, העבירו את הספרואידים לצלחת ניתוח שטף וכסו אותה במחסנית חיישן המכילה תרופות בדיקה. הפעל את הבדיקה במנתח שטף חוץ-תאי.

Flux analyzer מזריק באופן פניאומטי תרופות בדיקה ממחסנית החיישן ללוחית הניתוח בנקודות זמן ספציפיות. בתגובה לתרופות הבדיקה, תאים משחררים פרוטונים וחמצן לתוך תא המיקרו של הצלחת והפלואורופורים הנמצאים בבדיקת החיישן מודדים רמות אלה. לבסוף, באמצעות תוכנה מתאימה, לנתח את הפונקציונליות של spheroids.

בפרוטוקול הבא נדגים שיטה למדידת התפקוד המטבולי של תאי הגידול בלבלב הנמצאים בכדורידים תלת-ממדיים באמצעות בדיקת שטף חוץ-תאי.

יום לפני הבדיקה המטבולית, לחות את מחסנית הבדיקה עם 200 מיקרוליטר של כיול הבדיקה לכל באר בצלחת השירות שסופקה לדגור את צלחת השירות לילה באינקובטור לח 37 מעלות צלזיוס ללא CO2.

למחרת בבוקר, צפו בכדוריות בלוח הגידול תחת מיקרוסקופ אור כדי לבדוק את המורפולוגיה והאחידות הכללית שלהם. מעבירים את לוחית הגידול לכונן אחיזה מגנטי ושאפו בזהירות כ-120 מיקרוליטר מדיום גידול לכל באר.

לשטוף בעדינות את הספרואידים עם 120 מיקרוליטר של מדיום assay מחומם שלוש פעמים. לאחר השטיפה האחרונה, בדקו שוב את הספרואידים תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שהספרואידים לא נשטפו והוסיפו 180 מיקרוליטר של מדיום בדיקה חם לכל באר.

השתמש בקצה רחב ומשועמם כדי לשאוף בזהירות ספרואיד אחד שנשטף מראש מצלחת הצמיחה דוחה התאים ולהעביר בעדינות את הספרואיד ישירות למרכז באר אחת של צלחת בדיקה ספרואידית, המאפשר לכדוריד ליפול לתוך תא המיקרו המרכזי של הבאר על ידי כוח הכבידה.

לאחר שכל הספרואידים הועברו, הניחו את לוחית הבדיקה באינקובטור האוויר הלח שאינו CO2, 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. במהלך הדגירה, כוון את מחסנית החיישן כך שהשורות A עד H יהיו בצד שמאל והנח מדריך טעינה על גבי המחסנית כך שהאות המתאימה ליציאה שיש לטעון תהיה בפינה השמאלית העליונה.

אם הצלחת נטענה באופן שווה, פתח את תוכנת הניתוח ולחץ על תבניות. לחץ פעמיים על תבנית ריקה ולחץ על צור קבוצות. תחת הכרטיסיה מפת לוחות, הקצה קבוצות ללוח הבדיקה המתאים לתכנון הניסוי ובחר את ארבע הבארות הפינתיות כבארות הרקע.

תחת הכרטיסיה פרוטוקול מכשיר, סמן את כיול, שיווי משקל ומחזור מדידות בסיסי. לחצו על 'הזרקות' והגדירו את התרכובת לכל יציאה. שנו את מחזורי המדידה ל- 6. סקור את סיכום הפרוטוקול והקבוצה, ולאחר מכן שמור את תבנית עיצוב המבחן.

בהתבסס על עיצוב הבדיקה כמדריך, השתמש בפיפט רב ערוצי כדי לחלק כל מגיב ישירות לתוך יציאות ההזרקה, מחזיק את מדריכי ההעמסה במקומם עם קצות האצבעות. לאחר טעינת כל הריאגנטים, הסר את מדריך הטעינה והחזק את המחסנית בגובה העיניים כדי לבדוק חזותית את יציאות ההזרקה לטעינה אחידה.

העבר את המחסנית ואת לוחית השירות למנתח השטף החוץ תאי והתחל את הכיול לפני הבדיקה. לאחר הכיול, החלף את לוחית השירות בצלחת הבדיקה המחוממת מראש המכילה את הספרואידים התלת-ממדיים והתחל את הבדיקה. בסיום הבדיקה, יצא את הנתונים לתוכנת ניתוח הנתונים המתאימה.