בדיקת גמישות מוחית חוץ גופית של הלבלב: חקר שינויים בנוירונים במערכת העיכול שנחשפו לתמציות רקמת לבלב אנושיות בריאות וסרטניות

- גנגליון השורש הגבי או DRG הם נוירונים חושיים המעבירים מסרים מהפריפריה למערכת העצבים המרכזית. לעומת זאת, נוירונים מקלעת myenteric מעורבים תנועות פריסטלטיות של המעיים.

במצבים סרטניים כגון סרטן הלבלב, נוירונים אלה משתנים מורפולוגית ותפקודית. כדי לחקור את השינויים במורפולוגיה העצבית, זרעו את התאים העצביים על כיסויים המצופים מראש בחלבון למינין, הונחו בצלחת מרובת בארות, ומעל התאים בתווך הבסיסי העצבי.

חלבון למינין מקדם צמיחת נוירוטים. לדגור על התאים במשך הלילה. לאחר מכן, הוסף את מדיה תמצית רקמת סרטן הלבלב לשלוש הבארות הראשונות ואת רקמת הלבלב בריאה לחלץ מדיה לשלוש הבארות הבאות. דוגרים על הצלחת. כעת, בצעו צביעה אימונוהיסטוכימית באמצעות סמני נוגדנים ספציפיים לנוירונים, אשר נקשרים לנוירונים. הניחו את הכיסוי על מגלשת הזכוכית והניחו את המגלשה מתחת למיקרוסקופ הפוך. מדוד את צפיפות העצבים באמצעות התוכנה.

נוירוני DRG בתרבית בתמצית רקמת סרטן הלבלב מראים בדרך כלל צפיפות עצבית גדולה יותר מאשר בתמצית רקמת לבלב בריאה. לעומת זאת, נוירונים מקלעת מיינטרית יוצרים נוירוטים ארוכים יותר מאשר בתמציות רקמת לבלב בריאות. בפרוטוקול הבא, נבצע בדיקת נוירופלסטיות חוץ גופית על נוירוני DRG ומקלעת מיינטרית של עכבר שזה עתה נולד.

- כדי להכין את התאים לתרבית, השתמש בהמוציטומטר כדי להעריך את המספר הכולל של נוירונים וגליה. לאחר מכן, זרעו את התאים על כיסויים מצופים מראש בקוטר 13 מ"מ בצלחת של 24 בארות. הציפוי בו נעשה שימוש תלוי במטרות הניסוי. לאחר מכן, מעל הבארות עם תווך בסיסי עצבי ולאפשר לתאים להתחבר הבארות, לילה. למחרת, להפשיר את תמצית הרקמה בתוספת מדיה, או את קו התא supernatant בתוספת מדיה.

לאחר מכן, שאפו את מדיום הזריעה מה-DRGs ובצעו שטיפה אופציונלית ועדינה מאוד עם PBS. לאחר מכן, לאט לאט פיפטה תמצית הרקמה בתוספת מדיה או קו התא supernatant הוסיף מדיה על התאים כדי להניב 100 מיקרוגרם למיליליטר. כעת, תנו לתאים לגדול במשך 48 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתמצית הרקמה או במדיה המסופקת על ידי קו התא. לאחר 48 שעות, לשאוף את התקשורת ולתקן 4% paraformaldehyde עבור immunostaining.

עבור צביעה אימונופלואורסצנטית כפולה, השתמש בסמנים ספציפיים לנוירונים וגליה. עבור מורפומטריה, השתמש במיקרוסקופ אור הפוך המצויד במצלמת CCD בשילוב עם תוכנה אוטומטית למדידת צפיפות נוירוניט. באמצעות הגדלה של פי 200, למדוד את צפיפות הנוירוטים של תרביות עצביות על ידי כיסוי רשת של 50 X 50 מיקרון וספירת צפיפות הסיבים לריבוע, הנמדדת בסיבים המצטלבים. חזור על ניתוח זה עבור ארבעה אזורים שונים של צמיחה צפופה ביותר על ארבעה עד חמישה פוטומיקרוגרפים מייצגים על כל כיסוי.

מדוד את צמיחת הנוירוטים, מספר ממוצע של ענפים לכל נוירון, אורך ענף ממוצע וגודל פריקריונלי מתוך 30 נוירונים בודדים שנבחרו באופן אקראי מכל תלוש כיסוי על ידי סימון הנוירוטים והפריקריה.