JoVE Encyclopedia of Experiments
מחקר סרטן
0 צפיות • 6:26 דק' • April 30th, 2023
- בפלישת הגידול, תאי הגידול ההיקפיים עוברים מעבר אפיתל למזנכימלי או EMT, וכתוצאה מכך פירוק מקומי של המטריצה החוץ תאית או ECM. אנו יכולים לחקור את האינטראקציה של תאי גידול עם ECM במבחנה.
כדי לחקור אינטראקציות אלה, העבירו ספרואיד מוכן שמקורו בתאי גידול בלבלב לצלחת המכילה פיגום קולגן יחד עם בדיקות נותבות פלואורסצנטיות משובצות ואמצעי תרבית. ספרואיד הגידול משחרר פרוטאזות, אשר מפרקים קולגן ומפחיתים את קשיחות ECM, וכתוצאה מכך תנועה חופשית של בדיקות נותבות ב- ECM.
דוגרים על הצלחת למשך הזמן הרצוי. התבוננו בדגימה תחת מיקרוסקופ אור כדי להסתכל על רשת נקודות הדגימה בפיגום הקולגן ולהקליט מהן נתוני וידאו. האזור של המטריצה ליד הספרואיד מראה פירוק קולגן מקסימלי. לכן, הוא הגביר את תנועת הגשוש. לעומת זאת, האזור המרוחק יותר מהספרואיד מראה פחות פירוק קולגן, וכתוצאה מכך תנועה מוגבלת של מולקולות בדיקה.
טכניקה זו של בחינת התכונות הריאולוגיות של ECM על ידי מדידת מסלוליהם של חלקיקי נותב ידועה בשם מיקרו-ריאולוגיה עוקבת חלקיקים או PTM. בפרוטוקול הבא, נבצע בדיקת היווצרות כדור כדי לזהות תאי גזע סרטניים בלבלב ולהעריך את ההשפעה של מטפורמין.
כדי להתחיל, להכין תחנת עבודה בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית עם שני בקבוקונים 2 מיליליטר. בקבוקון 1 יכיל את ספרואיד הגידול, ובקבוקון 2 יהיה בקרה ללא תאים. הכינו תערובת מדוללת של בדיקות נותב פלואורסצנטי בקוטר 1 מיקרון של קרבוקסילט על ידי הוספת 2 בדיקות מלאי חלקים ל-25 חלקים של מים סטריליים.
מוציאים מהמקרר בקבוק של 3.1 מיליגרם למיליליטר קולגן בקר ומניחים אותו על קרח. Aliquot 125 מיקרוליטר קולגן ואחריו 50 מיקרוליטר של תמיסת בדיקה נותב מדולל לתוך בקבוקון 1. מערבולת לזמן קצר כדי להפיץ את הגשושיות.
לאחר מכן, הוסף 235 מיקרוליטר של מדיה מתאימה לתרבית תאים המכילה פנול אדום לנפח כולל של 410 מיקרוליטר ומערבולת קצרה לפני הסרת 205 מיקרוליטר והכנסתו לבקבוקון 2. לאחר מכן, הוסף כ 2 מיקרוליטר של 1 נתרן הידרוקסידי מולארי לבקבוקון 1 כדי להחזיר את התמיסה ל- pH ניטרלי. מערבלים בקצרה כדי לערבב. לאחר מכן, חזור מיד למדף הקרח, כך שהתערובת לא תתחיל לרפא.
מוציאים בעדינות 40 מיקרוליטר מדיה מהבאר המכילה את הספרואיד הגידולי. שמור על זה 40 microliters בעת ביצוע השלב הבא. בדוק את הבאר כדי לראות אם הספרואיד הוסר בשלב הקודם. אם לא, מחזירים את 40 המיקרוליטרים לבאר וחוזרים על השלב הקודם.
אם כן, הוסיפו את 40 המיקרוליטרים המכילים את הספרואיד לבקבוקון 1. מערבבים בעדינות בקבוקון 1 לפני העברת התערובת במנות של 60 מיקרוליטר לשלוש בארות נפרדות של צלחת בת 96 בארות. בדוק כל באר במיקרוסקופ לאחר הוספת התערובת כדי לקבוע איזו באר מכילה את הספרואיד.
לאחר מכן הוסיפו כ-2 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסידי מולארי אחד ו-40 מיקרוליטר של מדיה של תרבית תאים לבקבוקון 2, ומערבולות לפני שתציטטו 60 מיקרוליטר של תערובת זו לבאר ריקה בצלחת 96 בארות ותיוג שלה כבקרה נטולת תאים. מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס כדי לרפא למשך שעה לפחות.
כדי לבנות רשת של נקודות דגימה, ראשית, להעביר את צלחת הדגימה משלב האינקובטור לשלב המיקרוסקופ. המתינו 10 דקות עד שהדגימה תתאזן לטמפרטורת החדר אם שלב מחומם אינו זמין. התבונן בדגימה עם עדשות אובייקטיביות בעלות עוצמה נמוכה כדי לוודא שהיא שלמה ומוכנה להדמיה. קבעו את מיקום הגידול בתוך הבאר, ותיעדו זאת בתמונת אור משודרת לצורך שיתוף פעולה מרחבי לאחר מכן.
בדרך כלל, 20 נקודות דגימה בכל באר המפוזרות בטבעות קונצנטריות סביב הספרואיד יפיקו תוצאות מפורטות כראוי. הזז את הבמה לכל מיקום רצוי והשתמש בתוכנת התממשקות למיקרוסקופ כדי להקליט את קואורדינטות x ו- y.
העבירו את המיקרוסקופ לעדשה אובייקטיבית בעלת עוצמה גבוהה, ובחרו את קוביית המסנן המתאימה לאורך גל העירור של הגשושיות הנותבות. באמצעות רשימת הנקודות שנוצרו, עבור לנקודה הראשונה ברשת. כוונן את המיקוד כדי למצוא את החלק התחתון של הבאר לפני שתעלה כדי למצוא שדה ראייה המכיל מספר גשושיות עוקבות ממוקדות.
התבונן בהיסטוגרמה של העוצמה וכוונן את עוצמת החשיפה ואת זמן החשיפה כדי לספק את הטווח הדינמי הגדול ביותר האפשרי תוך הבטחה שהתמונה לא תהפוך רוויה. השג רצף וידאו בקצב פריימים של 20 עד 30 אלפיות שנייה לפריים ושמור בעזרת מוסכמה מתאימה למתן שמות. במהלך ההקלטה, אין לגעת במיקרוסקופ או בשולחן.
חזור על ההקלטה עבור כל נקודת דגימה ברשת. לאחר מכן המשיכו לחזור על התהליך לבניית רשת עבור כל באר בניסוי וחזרו על התהליך כולו עבור כל נקודת זמן לאורך תקופת הניטור האורכי.