הערכת מוקדי נזק לדנ"א: לזיהוי מוקדי נזק לדנ"א הנגרמים מקרינה בקו התאים הסרטניים באמצעות צביעת אימונופלואורסנציה

- קרינה מייננת גורמת לסוגים שונים של נזק לדנ"א, כגון שברים חד-גדיליים או SSB ושברים דו-גדיליים או DSB. שברים חד-גדיליים או SSB מתרחשים כאשר הקרינה פוגעת בבסיסים וחותכת את עמוד השדרה של הדנ"א, בעוד ששברי גדיל כפול, DSBs, מתפתחים כאשר שני SSB מתרחשים על גדילי DNA מנוגדים. השלב הראשון של היווצרות DSB הוא זרחן של היסטון H2AX, אשר ניתן לדמיין על ידי צביעה immunofluorescence.

כדי לבצע צביעה אימונופלואורסצנטית, יש להוסיף נוגדנים ראשוניים לדגימה המקובעת על פתק כיסוי המונח בצלחת פטרי. הנוגדנים נקשרים לחלבון היסטון זרחני gamma-H2AX. דגרו על הדגימה ושטפו אותה עם PBS כדי להסיר נוגדנים לא קשורים. לאחר מכן, הוסיפו נוגדנים משניים הנושאים פלואורופורים, המזהים נוגדנים ראשוניים ונקשרים אליהם. הוסף את הכמות הרצויה של כתם פלואורסצנטי DAPI כדי לנטרל את הגרעינים.

הרכיבו בעדינות את הכיסוי על מגלשת זכוכית עם אמצעי הרכבה והתבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מוקדי הגמא-H2AX מופיעים כנקודות פלואורסצנטיות מובהקות בתאי הסרטן המוקרנים. בפרוטוקול הבא, נבצע צביעה אימונופלואורסצנטית של שורות תאי סרטן המעי הגס האנושי המוקרן כדי לזהות מוקדי תיקון DNA הנגרמים על ידי קרינה.

- לאחר הקרנה, להסיר את המדיום מן התאים המחוברים ולשטוף אותם פעם אחת עם 2.5 מיליליטר של PBS. לאחר מכן, לתקן את התאים עם 1 מיליליטר של אתנול 70