JoVE Encyclopedia of Experiments
מחקר סרטן
0 צפיות • 4:55 דק' • April 30th, 2023
- אורגנואידים הם מבנים תאיים תלת-ממדיים במבחנה המתארגנים בעצמם כדי לחקות מאפייני רקמה מרכזיים של איבר מוצאם. כדי להתחיל בתיוג, טפלו באורגנואידים שנקטפו עם קוקטייל אנזימים מפרקי חלבון וקולגנוליטי כדי לנתק את התאים לתרחיף. צנטריפוגה להפרדת התאים מסופרנטנט המכיל אנזים. השליכו את הסופרנטנט. ממיסים את גלולת התא באמצעות תווך המכיל וקטורים לנטי-ויראליים. וירוסים רקומביננטיים אלה נושאים את רצף הקידוד של חלבון פלואורסצנטי ירוק או GFP.
הנגיפים מתמזגים עם התאים ומשחררים את החומר הגנטי שלהם ואנזימים נגיפיים מסוימים לתוך הציטופלסמה. התעתיק ההפוך הנגיפי מסנתז את הדנ"א הנגיפי המשלים שנע לתוך גרעין הפונדקאי. האינטגראז הנגיפי מסייע לשלב את הדנ"א הנגיפי המכיל רצף GFP בגנום המארח. גדל תאים מומרים אלה במטריצה חוץ-תאית או צלחת תרבית מצופה ECM. שאפו את התווך והצנטריפוגה לאסוף תאים שאינם מחוברים. השהה מחדש את התאים ב- ECM נוסף.
שכבו את ההשעיה על התרבית הדבקה כדי לקדם את כדאיות התא. לאחר שהמטריצה מתמצקת, מוסיפים מדיום תרבית ודגרים כדי להקל על היווצרות אורגנואידים. התבוננו בתרבית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תאים מותמרים מסנתזים חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים. אורגנואידים הנוצרים מתאים אלה מפגינים חיוביות GFP. הפרוטוקול הבא מדגים התמרה לנטיויראלית GFP לתאי אורגנואידים של סרטן המעי הגס שמקורם בחולה.
- לאחר 7 עד 10 ימי תרבית, נתקו את האורגנואידים באופן מכני באמצעות מגרד תאים סטרילי והעבירו את האורגנואידים לצינורות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 מיליליטר עבור הצנטריפוגה שלהם. לאחר מכן, השהה מחדש את הכדוריות ב 500 מיקרוליטר של PBS עם הקשה עדינה עבור צנטריפוגה נוספת. כדי לנתק את האורגנואידים של סרטן המעי הגס, הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת אנזים פרוטאוליטי וקולגנוליטית לצינורות וערבב עם הקשה עדינה.
לאחר 10 דקות בטמפרטורת החדר, להוסיף 500 מיקרוליטר של בינוני בתוספת 1% FBS לתאים, ובעדינות רבה פיפטה את תרחיף התא מספר פעמים כדי לפרק את האורגנואידים.
- פיפטינג עדין של אורגנואידים CRC אנושיים במהלך המעבר הוא קריטי לשמירה על היווצרות ספרואידים שלמים בתרבית.
- צנטריפוגות את התאים שוב ולהשהות מחדש את הכדוריות ב 100 מיקרוליטר של מלאי LENTIVIRUS 5x GFP ו 400 מיקרוליטר של מדיום תרבית אורגנואידים טריים של סרטן המעי הגס.
- חיוני להדביק את אורגנואידי CRC האנושיים עם טיטר גבוה של GFP lentivirus, במיוחד כדי להשיג יעילות זיהום כמעט 100%.
- להתאים את הנפח בכל צינור כדי להשיג 5 פעמים 10 לתא הגידול המנותק החמישי לכל 500 מיקרוליטר של ריכוז בינוני, וצלחת 500 מיקרוליטר של תאים לכל באר של מטריצה חוץ-תאית מלאכותית מצופה 12 בארות כפי שהודגם . לאחר 18 שעות באינקובטור תרביות התא, העבירו את הסופרנאטנטים הצפים המכילים תאים לצינורות מיקרו-צנטריפוגות בודדות של 1.5 מיליליטר לצנטריפוגה, ולאחר מכן השעיית הכדוריות ב-70 מיקרוליטר מטריצה חוץ-תאית מלאכותית לכל צינור על קרח.
כדי לשפר את יכולת הקיום של תאי סרטן המעי הגס, שכבו את המטריצה החוץ תאית המלאכותית המכילה תאי הגידול על אורגנואידי הגידול בצלחת 12 בארות והניחו את הצלחת באינקובטור תרבית התא למשך 30 דקות. כאשר ציפוי המטריצה החוץ תאי המלאכותי התמצק, יש להאכיל את התרביות במיליליטר אחד של מדיום תרבית אורגנואיד CRC טרי בתוספת FCS 1% ולהחזיר את התאים לאינקובטור תרבית התא למשך שלושה ימים. לאחר מכן, התבונן בתאים הנגועים במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאשר כמעט 100% חיוביות GFP ולהחזיר את התאים לאינקובטור למשך 4 עד 6 ימים נוספים.