זיהום אדנו-קר סגמנטלי: טכניקה ליצירת סרטן מעי גס מבודד באמצעות מודלים של עכברים מהונדסים גנטית

- התחל בלקיחת עכבר מוטנטי מותנה מורדם עם גנום שונה הנושא רצפי זיהוי אנזימים ספציפיים של Cre-recombinase הנקראים LoxP תוספות המאגפות את הגן מדכא הגידול הרצוי להיות מוטציה. חושפים בניתוח את חלל הבטן. אתר את המעי הגס הדיסטלי ומהדק את חלקו העליון. מכניסים טרנסאנלית צינורית רפואית ומקדמים אותה לתוך המעי הגס הדיסטלי. יש לשטוף את המעי הגס במי מלח כדי להסיר כל חומר צואתי. החלף את הצינור. מהדקים את האזור התחתון של המעי הגס לצורך סגמנטציה. ניפוח המקטע באמצעות פתרון דיסוציאציה מתאים לתאים. זה מחורר את מחסום הרירית ומגביר את הנגישות של תאי קריפטה במעי. לשטוף את פתרון הדיסוציאציה.

לאחר מכן, להזריק השעיה adenoviral לתוך קטע המעי הגס. וקטורים נגיפיים מהונדסים אלה מקודדים אנזימי Cre-recombinase. הנגיף נכנס לתא, משחרר את הדנ"א שלו לגרעין ומבטא את האנזימים. החלבונים מזהים את תוספות LoxP בגנום המארח ומזרזים רקומבינציה ספציפית לאתר, ובכך משביתים את הגן מדכא הגידול. מוטציה זו של אובדן תפקוד מקדמת את התקדמות הסרטן. תפרו את החתך ואפשרו לעכבר להתאושש. לפקח כדי לבחון את הצמיחה של גידולים מעי גס מבודדים. הפרוטוקול הבא מראה יצירת מודל עכבר סרטן המעי הגס על ידי זיהום אדנו-קר סגמנטאלי.

- התחילו בהנחת עכבר מורדם במצב שכיבה ומרחו משחה על עיני החיה. הדביקו את העכבר במצב מאובטח ולאחר מכן אשרו את רמת ההרגעה המתאימה על ידי צביטת אצבע. בצע חתך קו אמצע של כ -15 מ"מ בעור הבטן התחתונה. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי לתפוס את שרירי דופן הבטן, ובזהירות לחתוך את השריר עם מספריים כדי לפתוח את חלל הבטן. לאחר זיהוי המעי הגס הדיסטלי, בזהירות להדק את הרקמה עם מהדק עדין כ 15 מ"מ פרוקסימלי לפי הטבעת.

לאחר מכן, להכניס צינור טפלון גמיש transanally, בזהירות לקדם את הצינור עד שהוא מגיע חסימה לומינלית cannulate את הצינור עם צינורית 30 מד. חברו מזרק סטנדרטי של 1 מיליליטר לצינורית ושטפו את המעי הגס בכמה מיליליטרים של מלח רגיל עד שכל החומר הצואתי פונה. לאחר שהמעי הגס הדיסטלי מתרוקן, החליפו את צינור המלח בצינור טפלון חדש והשתמשו במהדק שני כדי לחסום את המעי הגס כ-3 מילימטרים דיסטליים למהדק הראשון.

באמצעות מזרק 1 מיליליטר שני מצויד צינורית 30 מד, בזהירות להזריק 50 עד 80 מיקרוליטר של 0.25% Trypsin-EDTA לתוך קטע המעי הגס מהודק. המעי הגס צריך להתנפח מספיק כדי לשבור את מחסום הרירית מבלי לנקב את קטע הרקמה המהודקת. לאחר 10 דקות, הסר את המהדק הדיסטלי. לאחר מכן, להסיר את צינור טריפסין ולשטוף את המעי הגס הדיסטלי עם 500 מיקרוליטר של מלוחים רגילים.

לאחר החדרת צינור טפלון חדש, מהדק את המעי הגס שוב לנפח את הרקמה עם 50 עד 80 מיקרוליטר של פתרון אדנוויראלי. לאחר 30 דקות, הסר את המלחציים ואת הצינור וסגור את דופן הבטן עם 6-0 תפרים ריצה נספגים במהירות. סגור את העור עם קליפים פצע כירורגי, ולפקח על החיה על כרית חימום עד שהוא התאושש לחלוטין.

כדי לעקוב אחר צמיחת הגידול באמצעות קולונוסקופיה, הניחו את בעל החיים נושא הגידול המרדים במצב שכיבה על כרית חימום, והכניסו את האנדוסקופ למערכת העיכול. יש להזרים בעדינות את האוויר תחת בקרה חזותית כדי להרחיק את המעי הגס. לאחר מכן, דחפו בזהירות את ההיקף קדימה עד שניתן יהיה לזהות את הנגע הרירית במעי הגס הדיסטלי, תוך שמירה על כל תמונה אנדוסקופית כפי שהיא נרכשת להערכה מאוחרת יותר. לאחר קבלת כל התמונות, הסירו לאט את האנדוסקופ והניחו את העכבר על כרית חימום של 38 מעלות צלזיוס עד להתאוששות מלאה.