בדיקת פוספטאז בתאי CRC: שיטה לבחינת מצב הזרחן של חלבון טאו בתאי סרטן המעי הגס

- חלבון טאו מתמקם באופן היקפי לגרעין בתאי סרטן המעי הגס והחלחולת ומסייע בשמירה על מבנה הגרעין. לרוב, תאים אלה מבטאים חלבון טאו היפרפוספורילציה, מה שגורם לעמידות לתרופות. לפיכך, אנו מנתחים את רמות זרחן טאו על ידי ביצוע בדיקת phosphatase.

התחל על ידי נטילת התא lysate המכיל חלבון הכולל מתאי סרטן המעי הגס האנושי בשני בקבוקונים המסומנים כבדיקה ובקרה. טפל בדגימת הבדיקה עם אנזים phosphatase אלקליין. פוספטאז אלקליין מסיר את קבוצות הפוספט מהטאו, ואילו בקבוקון הבקרה שומר על חלבון טאו פוספורילציה.

לאחר מכן, הפעל הן את הדגימה והן את טאו הבקרה על ג'ל פוליאקרילאמיד כדי להפריד את החלבונים. טאו פוספורילציה נע לאט יותר על הג'ל מאשר חלבון טאו שאינו פוספורילציה. אלקטרובלוט את דגימת החלבון לממברנה מתאימה ולהוסיף נוגדנים ראשוניים המתאימים הן לטאו פוספורילציה והן לטאו רגיל.

לדגור על הכתם למשך הלילה. טפל בכתם באמצעות נוגדן משני מצומד אנזים עיתונאי הנקשר לאזור Fc של נוגדן ראשוני. לבסוף, לפתח את הכתם באמצעות מצע כימילומינסנטי כדי לזהות חלבון טאו מתוך דגימת החלבון הכוללת הקיימת בכתם. בפרוטוקול הבא, נדגים את בדיקת phosphatase כדי להעריך את מצב הזרחן הכולל של טאו בתאי CRC.

- לאחר הכנת דגימות המכילות 20 מיקרוגרם של חלבון כולל, להוסיף שני מיקרוליטרים של חיץ phosphatase אלקליין ו 10 מיקרוליטר של phosphatase אלקל