בדיקת פוספטאז בתאי CRC: שיטה לבחינת מצב הזרחן של חלבון טאו בתאי סרטן המעי הגס

- חלבון טאו מתמקם באופן היקפי לגרעין בתאי סרטן המעי הגס והחלחולת ומסייע בשמירה על מבנה הגרעין. לרוב, תאים אלה מבטאים חלבון טאו היפרפוספורילציה, מה שגורם לעמידות לתרופות. לפיכך, אנו מנתחים את רמות זרחן טאו על ידי ביצוע בדיקת phosphatase.

התחל על ידי נטילת התא lysate המכיל חלבון הכולל מתאי סרטן המעי הגס האנושי בשני בקבוקונים המסומנים כבדיקה ובקרה. טפל בדגימת הבדיקה עם אנזים phosphatase אלקליין. פוספטאז אלקליין מסיר את קבוצות הפוספט מהטאו, ואילו בקבוקון הבקרה שומר על חלבון טאו פוספורילציה.

לאחר מכן, הפעל הן את הדגימה והן את טאו הבקרה על ג'ל פוליאקרילאמיד כדי להפריד את החלבונים. טאו פוספורילציה נע לאט יותר על הג'ל מאשר חלבון טאו שאינו פוספורילציה. אלקטרובלוט את דגימת החלבון לממברנה מתאימה ולהוסיף נוגדנים ראשוניים המתאימים הן לטאו פוספורילציה והן לטאו רגיל.

לדגור על הכתם למשך הלילה. טפל בכתם באמצעות נוגדן משני מצומד אנזים עיתונאי הנקשר לאזור Fc של נוגדן ראשוני. לבסוף, לפתח את הכתם באמצעות מצע כימילומינסנטי כדי לזהות חלבון טאו מתוך דגימת החלבון הכוללת הקיימת בכתם. בפרוטוקול הבא, נדגים את בדיקת phosphatase כדי להעריך את מצב הזרחן הכולל של טאו בתאי CRC.

- לאחר הכנת דגימות המכילות 20 מיקרוגרם של חלבון כולל, להוסיף שני מיקרוליטרים של חיץ phosphatase אלקליין ו 10 מיקרוליטר של phosphatase אלקליין לכל אחד. לאחר מכן, מוסיפים מים מזוקקים כך שהנפח הסופי של כל דגימה הוא 20 מיקרוליטר.

לדגור את הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. בזמן הדגימות דוגרות, הכינו דגימות נוספות באותו ריכוז, אך ללא פוספטאז להשוואה. לאחר שעה, עצור את התגובה על ידי הוספת EDTA בריכוז סופי של 50 מילימולר, או נתרן אורתוונדאט בריכוז סופי של 10 מילימולר.

הוסף חיץ טעינה ג'ל 4X SDS טרי מוכן המכיל DTT 400 מילימולרי. באמצעות בלוק חום, לדגור את הדגימות ב 100 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. מערבבים את הדגימות ולאחר מכן נותנים להם להתקרר בטמפרטורת החדר במשך 10 עד 15 דקות.

לאחר מכן, לטעון 13 מיקרוליטר של הדגימה לכל באר, כמו גם את סולם המשקל המולקולרי על ג'ל 10% polyacrylamide. חבר את מערכת האלקטרופורזה למקור חשמל והגדר את המתח ל- 70 וולט למשך 20 דקות כדי להעביר את דגימות החלבון מג'ל הערימה לג'ל המפשיר.

לאחר מכן, להגדיל ל 125 וולט ולהפעיל את הג'ל במשך כ 70 עד 120 דקות, עד הדגימות סולם חלבון להגיע לסוף הג'ל. באמצעות מערכת אלקטרובלוטינג רטובה, מעבירים את הג'ל לקרום פוליווינילידן פלואוריד במתח של 100 וולט למשך כ-100 דקות.

לאחר מכן, דגרו על הממברנה כדי לכתם אלבומין בסרום בקר 4% במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר. יש לדגור על הכתם למשך הלילה בתמיסת נוגדנים ראשונית בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את הכתם שלוש פעמים ב-PBST, ושטפו במשך שבע דקות בכל פעם.

יש לדגור בתמיסת הנוגדנים המשנית הרלוונטית למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו עם PBST ארבע פעמים, כאשר כל שטיפה נמשכת שבע דקות. לפתח את הכתם באמצעות ערכת chemiluminescence על פי הוראות היצרן.

כסו את הכתם המפותח בניילון נצמד שקוף ולאחר מכן רכשו תמונות כימילומינסנציה של הכתם באמצעות מערכת הדמיה כימילומינסנטית זמינה מסחרית.