אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מחקר סרטן
0 צפיות • 4:28 דק׳ • April 30th, 2023
- טאו הוא חלבון הקשור למיקרוטובולים המעורב בייצוב והרכבת המיקרוטובולים. תאים סרטניים רבים מבטאים חלבון טאו היפרפוספורילציה, שאינו מצליח לשמור על קשירת מיקרוטובולים מאורגנת היטב. כדי לחקור את האינטראקציה בין חלבון טאו למיקרוטובולים, הוסף ליזט תאי סרטני המכיל חלבון טאו ותמיסת עבודה מיקרוטובולית בצינור מיקרופוגה.
חלבוני הטאו הלא-זרחניים הנמצאים בליזט התא נקשרים למיקרוטובולים. כעת, הוסף את הכמות הרצויה של חיץ PEM בצינור כדי לייצב את הפעילות של טובולין, חלבון שמתפלמר לחוטים ליצירת מיקרוטובולים. דוגרים על התערובת למשך הזמן הרצוי.
צנטריפוגה את התערובת כדי לגלול את החלבון הקשור מיקרוטובול. החלבון הבלתי קשור נשאר בסופרנטנט. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור טרי, ותולים מחדש את הגלולה בחיץ מתאים. הוסף חיץ העמסת ג'ל לתרחיף הכדוריות המושעה מחדש והפעל את הדגימות על ג'ל פוליאקרילאמיד כדי להפריד חלבון הקשור למיקרוטובול ואלקטרובלוט על קרום מתאים.
הוסף נוגדנים מתאימים ופתח את הכתם באמצעות מצע כימילומינסנציה כדי לזהות את חלבוני הטאו הקשורים. בפרוטוקול הבא נבצע את בדיקת קשירת המיקרוטובולים לזיהוי חלבונים הקשורים למיקרוטובול.
- לאחר הכנת דגימות טריות, לדגור עליהן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. אולטרה-צנטריפוגות הדגימות בטמפרטורה של 100,000 x גרם ו-25 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. לאחר מכן, העבירו
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים