JoVE Encyclopedia of Experiments
מחקר סרטן
0 צפיות • 4:28 דק' • April 30th, 2023
- טאו הוא חלבון הקשור למיקרוטובולים המעורב בייצוב והרכבת המיקרוטובולים. תאים סרטניים רבים מבטאים חלבון טאו היפרפוספורילציה, שאינו מצליח לשמור על קשירת מיקרוטובולים מאורגנת היטב. כדי לחקור את האינטראקציה בין חלבון טאו למיקרוטובולים, הוסף ליזט תאי סרטני המכיל חלבון טאו ותמיסת עבודה מיקרוטובולית בצינור מיקרופוגה.
חלבוני הטאו הלא-זרחניים הנמצאים בליזט התא נקשרים למיקרוטובולים. כעת, הוסף את הכמות הרצויה של חיץ PEM בצינור כדי לייצב את הפעילות של טובולין, חלבון שמתפלמר לחוטים ליצירת מיקרוטובולים. דוגרים על התערובת למשך הזמן הרצוי.
צנטריפוגה את התערובת כדי לגלול את החלבון הקשור מיקרוטובול. החלבון הבלתי קשור נשאר בסופרנטנט. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור טרי, ותולים מחדש את הגלולה בחיץ מתאים. הוסף חיץ העמסת ג'ל לתרחיף הכדוריות המושעה מחדש והפעל את הדגימות על ג'ל פוליאקרילאמיד כדי להפריד חלבון הקשור למיקרוטובול ואלקטרובלוט על קרום מתאים.
הוסף נוגדנים מתאימים ופתח את הכתם באמצעות מצע כימילומינסנציה כדי לזהות את חלבוני הטאו הקשורים. בפרוטוקול הבא נבצע את בדיקת קשירת המיקרוטובולים לזיהוי חלבונים הקשורים למיקרוטובול.
- לאחר הכנת דגימות טריות, לדגור עליהן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. אולטרה-צנטריפוגות הדגימות בטמפרטורה של 100,000 x גרם ו-25 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. לאחר מכן, העבירו 120 מיקרוליטר מכל סופרנאטנט המכיל טאו לא קשור לצינורות נקיים ומסומנים. הוסף 120 מיקרוליטר של חיץ דגימה 5X לגלולה המכילה טאו כרוך.
לאחר ערבוב יסודי על ידי ערבול ופיפטינג, מעבירים את התערובת לצינורות מסומנים נקיים. לאחר הכנת דגימות בעלות ריכוז חלבון שווה-ערך, יש להוסיף חיץ העמסת ג'ל 4X SDS טרי המכיל DTT של 400 מילימולרי. השתמש בלוק חום לדגור את הדגימות ב 100 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
מערבלים את הדגימות, ולאחר מכן לתת להם להתקרר בטמפרטורת החדר במשך 10 עד 15 דקות. העמיסו 13 מיקרוליטר דגימה לכל באר ואת סולם המשקל המולקולרי על ג'ל פוליאקרילאמיד 10%. חבר את האלקטרודות החיוביות והשליליות של מערכת האלקטרופורזה למקור חשמל, ולאחר מכן הגדר את המתח ל- 70 וולט למשך 20 דקות.
לאחר מכן, להגדיל ל 125 וולט ולהפעיל את הג'ל במשך כ 70 עד 120 דקות עד הדגימות סולם חלבון להגיע לסוף הג'ל. השתמש במערכת electroblotting רטוב כדי להעביר את הג'ל על קרום פוליווינילידן פלואוריד ב 100 וולט במשך כ 100 דקות. יש לדגור על הממברנה כדי לכתם אלבומין בסרום בקר 4% למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לדגור לילה בתמיסת נוגדנים ראשונית ב 4 מעלות צלזיוס.
למחרת, שטפו את הכתם ארבע פעמים עם PBST כאשר כל שטיפה נמשכה שבע דקות. יש לדגור על הכתם השטוף בתמיסת נוגדנים משנית רלוונטית למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש לשטוף עם PBST במשך שבע דקות ולחזור על השטיפה בסך הכל ארבע פעמים. לפתח את הכתם באמצעות ערכת chemiluminescence. יש לכסות בניילון נצמד שקוף ולקבל תמונות באמצעות מערכת הדמיה כימילומינסנציונית.