בדיקת ארגון ציטו-שלד והדבקה מוקדית: שיטה מבוססת אימונופלואורסנציה לחקר הידבקות תאים והתפשטותם על מצעים

- מורפולוגיית המצע משפיעה מאוד על התנהגות התאים הסרטניים ועל תגובות גרורתיות. רשת דינמית של שלד אקטין מספקת תמיכה מבנית לתאים ומתווכת את התנועה התאית. קומפלקסים חלבוניים גדולים הקשורים לממברנה הנקראים הידבקויות מוקדיות מחברים את השלד הציטו-תאי עם המטריצה החוץ תאית, ומסייעים להתפשטות תאים.

כדי להתחיל להכתים, לקחת תרבית תאים סרטניים, ולטפל בהם עם paraformaldehyde כדי לתקן ולחדור את התאים. כעת, לדגור על התאים עם מגיב משפר אותות המכיל חלבונים כדי להכין את התאים כדי להפחית את צביעת הרקע. הוסף נוגדנים ראשוניים אנטי וינקולין הנקשרים לוינקולין, אחד החלבונים בתוך קומפלקס ההיצמדות המוקדית.

לאחר מכן, לדגור על הדגימה עם נוגדן משני מצומד בצבע פלואורסצנטי המכוון לנוגדן הראשוני. לבסוף, טפל בתאים עם צימודים פלואורסצנטיים מתויגים phalloidin כי להיקשר באופן סלקטיבי חוטי אקטין של השלד cytoskeleton. התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי כדי לחקור את האותות הפלואורסצנטיים שלהם.

תאים בעלי מורפולוגיה מפוזרת היטב מציגים סיבי אקטין מוגדרים ומציגים הידבקויות מוקדיות מובחנות ומוארכות המכילות וינקולין. לעומת זאת, תאים בעלי פיזור גרוע אינם בעלי חוטי אקטין מוגדרים, אך מציגים הידבקויות מוקדיות המכילות וינקולין. בפרוטוקול הבא, נדגים בדיקת immunofluorescence לחקר שלד ציטו-שלד וארגון הידבקות מוקדית בתאי סרטן המעי הגס הראשוניים.

- לקחת את המצעים כדי להיות immunostained על מכסה המנוע הלמינרי ולהסיר את מדיה תרבות. לאחר מכן, שטפו את המצע במי מלח חוצצי פוספט, או PBS, וקבעו את התאים עם 4% פרפורמלדהיד ב-PBS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את המצעים עם PBS במשך חמש דקות בסך הכל שלוש פעמים. לאחר מכן, לדגור על המצע עם 500 מיקרוליטר של משפר אות במשך 30 דקות לפני שטיפה עם PBS.

לאחר מכן, לדגור על התאים עם נוגדן חד שבטי אנטי וינקולין בדילול של 1 עד 250 ב- PBS למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את המצעים עם PBS במשך חמש דקות בסך הכל שלוש פעמים. דגרו על הדגימות עם נוגדן משני Alexa Fluor 488 עז נגד עכבר IgG בדילול של 1 עד 200 ב-PBS בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, שטפו שוב את המצעים עם PBS במשך חמש דקות בסך הכל שלוש פעמים.

כדי לדמיין את מבנה F-actin, לדגור על התאים עם tetramethylrhodamine-phalloidin מצומדים בריכוז של 50 מיקרוליטר למיליליטר במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את המצע שוב כמו קודם. לבסוף, המשך לצלם את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ לייזר סורק קונפוקלי.

• Focal Adhesion - Protein complex facilitating cell-cytoskeleton and extracellular matrix connection.
• Vinculin - An integral protein within the focal adhesion complex.
• Actin Cytoskeleton - Provides structural support to cells and mediates cellular movement.
• Immunofluorescence - A staining method used to visualize components within a cell.
• Cell Spreading - The process related to cell movement and attachment involving focal adhesions and actin filaments.

• Introduce Focal Adhesion - Protein complex connecting actin cytoskeleton and extracellular matrix (e.g., vinculin).
• Key Concepts - Supporting cell's structural integrity, movement, and interactions (e.g., actin network).
• Underlying Mechanisms - Fundamental processes facilitating cell adhesion, spreading, and movement.
• Connect to Experiment - Using immunofluorescence to visualize actin and vinculin in cancer cells.

• What is focal adhesion and how does it facilitate cellular movement and interaction?
• How does vinculin function within the focal adhesion complex?
• How is immunofluorescence used to study the organization of actin cytoskeleton and focal adhesion?

• Practical Applications – Understanding cellular behavior and responses through immunofluorescence (e.g., cancer research).
• Industry Impact – Enhancing the understanding of cell morphology in biomedical sector (e.g., drug development).
• Societal Importance – Broadening comprehension of diseases trajectory and treatment options (e.g., cancer).
• Link to Scientific Advancements - Immunofluorescence marks a significant advancement in cell biology studies.