בדיקת ארגון ציטו-שלד והדבקה מוקדית: שיטה מבוססת אימונופלואורסנציה לחקר הידבקות תאים והתפשטותם על מצעים

- מורפולוגיית המצע משפיעה מאוד על התנהגות התאים הסרטניים ועל תגובות גרורתיות. רשת דינמית של שלד אקטין מספקת תמיכה מבנית לתאים ומתווכת את התנועה התאית. קומפלקסים חלבוניים גדולים הקשורים לממברנה הנקראים הידבקויות מוקדיות מחברים את השלד הציטו-תאי עם המטריצה החוץ תאית, ומסייעים להתפשטות תאים.

כדי להתחיל להכתים, לקחת תרבית תאים סרטניים, ולטפל בהם עם paraformaldehyde כדי לתקן ולחדור את התאים. כעת, לדגור על התאים עם מגיב משפר אותות המכיל חלבונים כדי להכין את התאים כדי להפחית את צביעת הרקע. הוסף נוגדנים ראשוניים אנטי וינקולין הנקשרים לוינקולין, אחד החלבונים בתוך קומפלקס ההיצמדות המוקדית.

לאחר מכן, לדגור על הדגימה עם נוגדן משני מצומד בצבע פלואורסצנטי המכוון לנוגדן הראשוני. לבסוף, טפל בתאים עם צימודים פלואורסצנטיים מתויגים phalloidin כי להיקשר באופן סלקטיבי חוטי אקטין של השלד cytoskeleton. התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי כדי לחקור את האותות הפלואורסצנטיים שלהם.

תאים בעלי מורפולוגיה מפוזרת היטב מציגים סיבי אקטין מוגדרים ומציגים הידבקויות מוקדיות מובחנות ומוארכות המכילות וינקולין. לעומת זאת, תאים בעלי פיזור גרוע אינם בעלי חוטי אקטין מוגדרים, אך מציגים הידבקויות מוקדיות המכילות וינקולין. בפרוטוקול הבא, נדגים בדיקת immunofluorescence לחקר שלד ציטו-שלד וארגון הידבקות מוקדית בתאי סרטן המעי הגס הראשוניים.

- לקחת את המצעים כדי להיות immunostained על מכסה המנוע הלמינרי ולהסיר את מדיה תרבות. לאחר מכן, שטפו את המצע במי מלח חוצצי פוספט, או PBS, וקבעו את התאים עם 4% פרפורמלדהיד ב-PBS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את המצעים עם PBS במשך חמש דקות בסך הכל שלוש פעמים. לאחר מכן, לדגור על המצע עם 500 מיקרוליטר של משפר אות במשך 30 דקות לפני שטיפה עם PBS.

לאחר מכן, לדגור על התאים עם נוגדן חד שבטי אנטי וינקולין בדילול של 1 עד 250 ב- PBS למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את המצעים עם PBS במשך חמש דקות בסך הכל שלוש פעמים. דגרו על הדגימות עם נוגדן משני Alexa Fluor 488 עז נגד עכבר IgG בדילול של 1 עד 200 ב-PBS בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, שטפו שוב את המצעים עם PBS במשך חמש דקות בסך הכל שלוש פעמים.

כדי לדמיין את מבנה F-actin, לדגור על התאים עם tetramethylrhodamine-phalloidin מצומדים בריכוז של 50 מיקרוליטר למיליליטר במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את המצע שוב כמו קודם. לבסוף, המשך לצלם את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ לייזר סורק קונפוקלי.