הכנת בלוק רקמת עור קפואה: פרוטוקול לשימור דגימות מלנומה עורית מהעור הגבי של מורין

- תאי גזע של מלנוציטים שקטים, בתגובה לקרינת UV או להסרת שיער, מופעלים. תאי גזע מלנומה פעילה יכולים להוביל למלנומה עורית - סוג של סרטן העור. כדי לחקור מלנומה, אנו מכינים בלוקים של רקמת עור קפואה כדי לשמור על המבנים המקוריים של DNA וחלבונים במהלך הליך הקיבוע.

התחילו בהנחת עכבר מלנומה שעבר המתת חסד על מיטת ניתוח והסירו שיער מהאזור הגבי של העור מעל הזנב. הבלו על העור ומכסים אותו בנייר פילטר. לאחר מכן, השקיעו את נייר הסינון המכיל רקמת עור בפורמלין חוצץ ניטרלי למשך הזמן הרצוי. פורמלין חודר לרקמת העור ונקשר לחומצות האמינו, מה שגורם להצלבה של חלבונים, ובכך מוביל לקיבוע רקמות.

הסר את רקמת העור מהנייר וחתוך את הרקמה כדי להשיג חתיכות בגודל הרצוי. כעת, הטמיעו את חלקי הרקמה במאונך בקריומולד מלא בתווך OCT והניחו את הקריומוולדים על קרח יבש. OCT היא מטריצת דגימות המתמצקת בעת הקפאה ויוצרת שכבה ג'לטינית סביב דגימת הרקמה המחזיקה אותה במקומה. השתמש בלוקים קפואים עבור בדיקות היסטולוגיות נוספות. בפרוטוקול הבא, נכין בלוקים של רקמת עור קפואה מהעור הגבי של מורין לחקר מלנומה של העור.

- כדי לבודד את דגימות העור, השתמשו בגוזם חשמלי כדי להסיר כל שיער מאזור העור הגבי של העכברים המוקרנים שהורדמו והברישו קלות את העור החשוף ברקמה נטולת סיבים כדי לנקות את האזור. בצע חתך קטן עם מספריים חדים ממש מעל בסיס הזנב והכנס מספריים קהות גדולות לתוך החתך כדי להפריד את רקמות החיבור subdermal. בעזרת מספריים חדים, חותכים בזהירות לאורך קצה אזור העור המעניין כדי לבודד את דגימת הרקמה, ומניחים את רקמת העור שנכרתה על מגבת נייר נקייה.

לאחר מכן, השתמש במלקחיים עמומים כדי למתוח את העור כך שהוא נצמד למגבת והוא מתוח. לאחר איסוף כל הדגימות, הניחו את דגימת העור ואת מגבת הנייר בגב פיסת נייר פילטר מקופלת הצמודה מיד לקמט, וודאו שהדגימה חלקה ולא מקופלת או מקומטת. סגור את דפנות נייר הסינון בסיכות וחתוך את הנייר. לאחר מכן, יש לטבול את הדגימות באופן מלא בפורמלין חוצץ 10% נייטרלי למשך 3 עד 5 שעות בטמפרטורת החדר לפני שטיפת הרקמות בשתי שטיפות של 5 דקות במים נטולי יונים.

לאחר השטיפה השנייה, הסר בזהירות כל חומר שיורי מרקמות העור וקצץ את שולי הדגימה כך שלא יהיו משוננים. לאחר מכן, בצע שלושה חתכים sagittal בכל דגימה כך רוחב הרצועות הוא לא יותר מ 5 מ"מ ולעשות חתכים רוחביים כך הדגימות הם לא יותר מ 20 מ"מ רוחב. מקם קריומולד המכיל טמפרטורת חיתוך אופטימלית או מדיום OCT בכיוון דיוקן והנח ארבע עד חמש חתיכות עור על גבי ה- OCT.

כאשר כל החתיכות נמצאות במקומן, השתמש בשני זוגות של מלקחיים עדינים כדי להביא את הקצה הארוך של כל פיסת עור לתחתית הקריומולד, כך שהדגימות יהיו אנכיות בתוך OCT ומאונכות לבסיס התבנית. לאחר מכן, ממלאים את התבנית ב-OCT נוסף לשפה השנייה, ומניחים את התבנית על משטח שטוח של חתיכת קרח יבש, תוך שימוש במלקחיים כדי להתאים את כל פיסות העור שאולי זזו במהלך ההעברה כשהגוש מתחיל לקפוא לפי הצורך.