דגי HCR-DNA: טכניקת הכלאה פלואורסצנטית באתרה לזיהוי DNA נגיפי בתאים נגועים
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מחקר סרטן
0 צפיות • 6:00 דק׳ • April 30th, 2023
- HCR-FISH, או הכלאה של תגובת שרשרת הכלאה-פלואורסצנטיות באתרה, מזהה רצפי חומצות גרעין נגיפיות בתוך הגנום של תאים נגועים בנגיף. כדי להתחיל, לתקן תרבית דבק של תאים נגועים וירוס לחדור קרום התא שלהם. לדגור על התאים עם חיץ הכלאה כדי להפחית כל אות רקע. טפל בתאים באמצעות גשושיות יוזמות הנושאות רצף יוזם HCR ורצף משלים המכוון לדנ"א הנגיפי. חממו את הדגימה כדי לפרק את הדנ"א הדו-גדילי של המארח לדנ"א חד-גדילי. לדגור על הדגימה כדי לאפשר לגשושית להיקשר לרצף הדנ"א הנגיפי המשלים שלה.
לאחר מכן, טפלו עם חיץ הגברה המכיל שתי קבוצות של בדיקות סיכת שיער אוליגונוקלאוטיד עם תווית פלואורסצנטית, H1 ו-H2. לדגור כדי להקל על תגובת שרשרת ההכלאה. רצף היוזם הלא מזווג נקשר לזנב H1 המשלים שלו, ויוצר ליניאריות של מבנה סיכת השיער. רצף H1 החשוף נקשר באופן דומה לזנב H2 המשלים שלו. ה-H2 הנגרר ממשיך להיקשר לזנב H1. בדרך זו, הגשושיות המתויגות בפלואורסצנט מתגברות סביב אתר המטרה, ופולטות אות חזק. טפל בדגימה עם DAPI כדי להכתים את גרעיני התא.
השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לזהות את הפלואורסצנטיות הבהירה ממוקדי השכפול בתוך גרעיני התאים הנגועים. בפרוטוקול הבא, נציג באתרו דגי HCR-DNA כדי לזהות גנום של נגיף פוליומה של תאי מרקל בתאי עור אנושיים ראשוניים נגועים.
- ראשית, קבע את התאים על פתקי כיסוי עם 4% PFA ב- PBS למשך 10 דקות. לא
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים