אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מחקר סרטן
0 צפיות • 6:00 דק׳ • April 30th, 2023
- HCR-FISH, או הכלאה של תגובת שרשרת הכלאה-פלואורסצנטיות באתרה, מזהה רצפי חומצות גרעין נגיפיות בתוך הגנום של תאים נגועים בנגיף. כדי להתחיל, לתקן תרבית דבק של תאים נגועים וירוס לחדור קרום התא שלהם. לדגור על התאים עם חיץ הכלאה כדי להפחית כל אות רקע. טפל בתאים באמצעות גשושיות יוזמות הנושאות רצף יוזם HCR ורצף משלים המכוון לדנ"א הנגיפי. חממו את הדגימה כדי לפרק את הדנ"א הדו-גדילי של המארח לדנ"א חד-גדילי. לדגור על הדגימה כדי לאפשר לגשושית להיקשר לרצף הדנ"א הנגיפי המשלים שלה.
לאחר מכן, טפלו עם חיץ הגברה המכיל שתי קבוצות של בדיקות סיכת שיער אוליגונוקלאוטיד עם תווית פלואורסצנטית, H1 ו-H2. לדגור כדי להקל על תגובת שרשרת ההכלאה. רצף היוזם הלא מזווג נקשר לזנב H1 המשלים שלו, ויוצר ליניאריות של מבנה סיכת השיער. רצף H1 החשוף נקשר באופן דומה לזנב H2 המשלים שלו. ה-H2 הנגרר ממשיך להיקשר לזנב H1. בדרך זו, הגשושיות המתויגות בפלואורסצנט מתגברות סביב אתר המטרה, ופולטות אות חזק. טפל בדגימה עם DAPI כדי להכתים את גרעיני התא.
השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לזהות את הפלואורסצנטיות הבהירה ממוקדי השכפול בתוך גרעיני התאים הנגועים. בפרוטוקול הבא, נציג באתרו דגי HCR-DNA כדי לזהות גנום של נגיף פוליומה של תאי מרקל בתאי עור אנושיים ראשוניים נגועים.
- ראשית, קבע את התאים על פתקי כיסוי עם 4% PFA ב- PBS למשך 10 דקות. לאחר מכן, שטפו את פתקי הכיסוי פעמיים עם PBS וטפלו בהם עם 70% אתנול בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לחלחל לתאים. למחרת, החליפו את האתנול בחיץ הידרציה לבדיקה ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות כדי לבצע הכלאה מוקדמת של הדגימות. 30 דקות לפני סיום הדגירה שלפני ההכלאה, מדללים את הגשושיות בתמיסת הכלאת הגשושית בדילול של 1:500 ודגרים ב-45 מעלות צלזיוס.
כאשר הדגירות הושלמו, פיפטה כ -10 מיקרוליטר של תערובת הבדיקה המדוללת על שקופית מיקרוסקופ עבור כל החלקת כיסוי. הניחו כל חלקת כיסוי, בצד התא כלפי מטה, על טיפת תערובת ההכלאה המתאימה לו. בעזרת כמות נדיבה של מלט גומי, אטמו את הקצוות ואת החלק האחורי של כל מכסה למגלשה שלו. הניחו את המגלשות על הצד השטוח של בלוק חום וחממו אותן ל-94 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. לאחר מכן, להעביר את המגלשות לחדר לח לדגור אותם ב 45 מעלות צלזיוס במשך הלילה.
למחרת, השתמשו במלקחיים כדי לקלף בזהירות את מלט הגומי. הניחו את פתקי הכיסוי, בצד התא כלפי מעלה, לתוך בארות של צלחת בת 24 בארות ושטפו אותם עם חיץ שטיפת בדיקה שלוש פעמים בטמפרטורת החדר. מוסיפים 200 מיקרוליטר של חיץ הגברה לכל באר המכילה החלקת כיסוי ודגרים בטמפרטורת החדר למשך 30 עד 60 דקות. בינתיים, חיממו כל אחת מהשתיים המסומנות כסיכות שיער אוליגונוקלאוטיד וזיהו את הבדיקות בצינורות PCR נפרדים על ידי חימום שלהן ל-95 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות ולאחר מכן קירורן לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. מערבבים את סיכות הראש יחד בחיץ הגברה בדילול של 1:50.
לאחר מכן, מתח סרט פרפין על הפנים הפתוחות של מכסה צלחת 12 בארות כדי ליצור משטח לתגובת ההגברה. פיפטה 50 עד 100 מיקרוליטר טיפות של תערובת סיכת הראש על סרט פרפין עבור כל החלקת כיסוי. בעזרת מלקחיים, הסירו בזהירות כל החלקת כיסוי מתמיסת ההגברה וגעו בקצה למגבון חד פעמי נקבובי לייבוש. הניחו כל כיסוי מיובש, בצד התא כלפי מטה, על טיפת הגברה. מעבירים את מכסה הצלחת לתא לח ודגרים למשך הלילה בטמפרטורת החדר ובחושך.
למחרת, להחזיר את פתקי הכיסוי לבארות של צלחת 24 בארות. יש להוסיף DAPI המכיל 5x SSCT בריכוז של 0.5 מיקרוגרם למיליליטר לכל באר ולדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר מכן, לשטוף את הדגימות פעמיים עם 5x SSCT בטמפרטורת החדר. הרכיבו את הכיסוי השטוף על שקופיות המיקרוסקופ, והשתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך כדי לנתח את התאים ולצלם את הדגימות.