בידוד תאי גזע מלנומה: שיטה להשגת תאי מלנומה חיוביים ושליליים CD133 באמצעות מיון תאים המופעלים מגנטית

- מלנומה מכילה תת-אוכלוסייה קטנה של תאי גזע סרטניים בעלי יכולות התחדשות עצמית והתחלת גידול. CD133 או Prominin-1, גליקופרוטאין טרנסממברנה מחומש, הוא אחד הסמנים העיקריים המבוטאים על ידי תאי גזע סרטן מלנומה גרורתיים. כדי לבודד תאים חיוביים CD133, התחל עם השעיה של תאי מלנומה ראשוניים במאגר מתאים.

דגירה עם מגיב חוסם המכיל חלבונים החוסמים אתרי קישור לא ספציפיים על פני התא. לטפל בתאים עם נוגדנים ראשוניים CD133 biotinylated. נוגדנים אלה נקשרים לאנטיגנים CD133 המתבטאים בתאים חיוביים ל- CD133. כעת, הוסיפו מיקרו-כדוריות מגנטיות נגד ביוטין לתרחיף. דגרו כדי שהמיקרו-כדוריות ייקשרו לתאים המסומנים בביוטין.

לבסוף, העבירו את המתלה המוגר דרך עמוד הממוקם בשדה מגנטי. עם השפעה מגנטית, כל התאים החיוביים CD133 המסומנים עם microbeads להידבק לעמודה, בעוד התאים ללא תווית לעבור דרך. אסוף תאים שליליים אלה ללא תווית CD133. הסר את העמודה מהשדה המגנטי. יש לשטוף את התוכן באמצעות מאגר מתאים כדי לנטרל ולאסוף תאים חיוביים ל-CD133.

בפרוטוקול הבא נראה בידוד של תאי גזע סרטניים חיוביים ושליליים ל-CD133 מתרבית של מלנומה ראשונית המתקבלת מרקמת הגידול. יש לשטוף 80% תאים חוממים עם PBS שחומם מראש. מוסיפים כמות מתאימה של Accutase ודגרים עד שהתאים מתנתקים מפני השטח של התרבית. קצרו את התאים בתווך קוונטי 263 והעבירו לצינור של 50 מיליליטר.

מנה את התאים. לאחר מכן, צנטריפוגה את מספר התאים הנדרש במשך 5 דקות ב 300 x גרם ו 4 עד 8 מעלות צלזיוס. לשאוף סופרנאטנט לחלוטין, ולהשהות עד 1 פעמים 10 לתאים השמיניים במאגר MACS של 350 מיקרוליטר. הוסף 100 מיקרוליטר מגיב חסימת FcR ו 50 מיקרוליטר CD133/1-ביוטין. מערבבים היטב ודגרים בחום של 4 מעלות למשך 10 דקות.

לשטוף את התאים עם 10 מיליליטר MACS חוצץ, ואחריו צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 300 x גרם ו 4 עד 8 מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנאטנט לחלוטין. לאחר שטיפה שנייה, להשעות מחדש את גלולת התא ב 400 מיקרוליטר של מאגר MACS. הוסיפו 100 מיקרוליטר מיקרו-חרוזים נגד ביוטין וערבבו היטב. יש לדגור בחום של 4 עד 8 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

בינתיים, כדי להכין את מפריד ה- MACS להפרדה המגנטית, חבר את ה- QuadroMACS ל- MACS Separator Multi Stand. הכנס את המספר הנדרש של עמודות LS עם כנפי העמודות בחזית בשדה המגנטי של QuadroMACS. מקם מסנן קדם-הפרדה בכל עמודת LS וצינור איסוף מתאים מתחת לכל עמודה.

שטפו את המסנן והעמוד במאגר MACS של 3 מיליליטר והשליכו את הזרימה. לאחר שטיפת התאים במאגר MACS כפי שתואר קודם לכן, השהה מחדש את התאים במאגר MACS של 500 מיקרוליטר והחל את תרחיף התא על עמודת LS המוכנה. שטפו שלוש פעמים עם מאגר MACS של 3 מיליליטר לכל עמודה. אסוף את סך השפכים של מקטע התא השלילי CD133 ללא תווית.

לאחר מכן, השליכו את מסנן קדם-ההפרדה, הסירו את העמוד מהמפריד והניחו אותו על צינור איסוף מתאים. החל מאגר MACS של 5 מיליליטר. שטפו מיד את התאים החיוביים CD133 המסומנים על ידי דחיפת הבוכנה בחוזקה לתוך העמודה. כדי להגביר את טוהר המקטע השלילי, החל את תרחיף התא על עמודת LS מאוזנת חדשה ואסוף את החלק השלילי CD133 של השפכים.

• Melanoma - A type of skin cancer with self-renewing tumor initiation capabilities.
• CD133 - A marker in metastatic melanoma stem cells that enables their isolation.
• MACS Separator - A device used for magnetic cell sorting isolation.
• Quantum 263 medium - A culture medium used for melanoma cell cultivation.
• Anti-Biotin Microbeads - Tiny magnetic particles used to label cells for isolation.

• Understanding Melanoma - It's a skin cancer with self-renewable tumor cells (e.g., MACS separator).
• Principles of Magnetic Cell Sorting - The process of sorting cells based on their magnetic properties (e.g., CD133).
• Role of Microbeads - They assist in segregating cells during magnetic isolation (e.g., Anti-Biotin Microbeads).
• Isolation of CD133 - The melanoma stem cells are differentiated using MACS separator.

• [Question 1] What is melanoma and how is it connected to CD133 stem cells?
• [Question 2] What role does a MACS separator play in cell isolation?
• [Question 3] How are Anti-Biotin Microbeads used in the magnetic cell isolation process?

• Cell Isolation Techniques - Understanding melanoma therapy (e.g., MACS Separator).
• Medical Industry Impact - Improved cancer treatment methodologies (e.g., CD133).
• Scientific Progression - Better understanding of stem cells can lead to medical advancements.
• Research Developments - Isolation techniques pave way for newer studies.