רקומביננטי תא פוליומה פוליומה וירוס (MCPyV) הכנת ויריון: טכניקה לייצור טיטר גבוה רקומביננטי MCPyV Virion

- Merkel cell polyomavirus, או MCPyV, הוא אונקו DNA דו-גדילי בעל גנום מעגלי הגורם לקרצינומה של תאי מרקל, סוג של סרטן העור. כדי להכין נגיפים מסוג MCPyV, ראשית, יש לטפל בתרבית דבקה של תאי אריזה באמצעות קוקטייל המכיל חומר טרנספקציה, הגנום הנגיפי, ושני פלסמידים המקודדים חלבוני ביטוי הדרושים לקידום שכפול נגיפי.

במהלך הדגירה, מגיב transfection יוצר lypoplexes עם פלסמידים, להקל על המסירה שלהם לתוך תאי האריזה. ברגע שהוא בתוך הגרעין, מנגנון התא מאפשר ביטוי של הגנום הנגיפי והפלסמיד. הביטוי פלסמידים מקודדים חלבוני אנטיגן של גידול גדול ואנטיגן של גידול קטן. חלבונים אלה עוברים טרנסלוקציה לגרעין ומניעים שכפול DNA נגיפי. לאחר מכן, הגנום הנגיפי מקודד חלבוני קפסיד מבניים. חלבונים אלה נעים לתוך הגרעין ומסייעים בהרכבה של נגיפים רקומביננטיים.

לאחר מכן, לקצור את התאים בתרבית. טפלו בהם בתמיסה המכילה חומר ניקוי ו-DNase. חומר הניקוי משחרר את התאים כדי לשחרר את הנגיפים. DNase מפרק כל DNA פלסמיד חופשי מהתרחיף. צנטריפוגה להפרדת פסולת תאית בכדורית. טען את הסופרנאטנט המכיל את הנגיף לתוך צינור הנושא תווך שיפוע צפיפות מתאים. צנטריפוגה להשגת שברים מרוכזים עשירים בנגיפים בתווך השיפוע.

בפרוטוקול הבא, נציג את ההכנה של נגיפים רקומביננטיים MCPyV בעלי טיטר גבוה באמצעות תאי 293TT.

- בשעות אחר הצהריים המאוחרות או בערב, זרעו 6 מיליון תאים 293TT-28 לתוך צלחת של 10 ס"מ המכילה תוספת DMEM בינונית. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. למחרת בבוקר, ודא כי התאים הם כ 50% זורמים. לאחר מכן, להדביק את התאים עם 66 מיקרוליטר של מגיב transfection, 12 מיקרוגרם של MCPyV לבודד R17b DNA, 8.4 מיקרוגרם של פלסמיד ביטוי ST pMtB, ו 9.6 מיקרוגרם של פלסמיד ביטוי LT pADL. לדגור על התאים במשך הלילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.

למחרת, כאשר התאים הנגועים כמעט מתמזגים, טריפסין את התאים ומעבירים אותם לצלחת של 15 ס"מ להמשך הרחבה. כאשר המנה הופכת כמעט מתמזגת, מעבירים את התאים לשלוש מנות חדשות של 15 סנטימטרים. כאשר מנות חדשות אלה הופכות כמעט נפגשות, קצרו את התאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. צנטריפוגה ב 180 x גרם בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. לאחר מכן, הסר את supernatant ולהוסיף נפח תא 1 של DPBS-Mg.

הוסף 25 אמוניום סולפט מיקרומולרי, ואחריו 0.5% טריטון X-100, 0.1% בנזונאז ו-0.1% DNase תלוי ATP. מערבבים היטב ודגרים בטמפרטורה של 37 מעלות למשך הלילה. למחרת, מצננים את התערובת על קרח במשך 15 דקות. לאחר מכן, להוסיף 0.17 נפח של נתרן כלורי. מערבבים ודגורים על קרח עוד 15 דקות. צנטריפוגה ב 12000 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. אם הסופרנאטנט אינו ברור, הפוך בעדינות את הצינור וחזור על הצנטריפוגה.

לאחר מכן, להעביר את supernatant לצינור חדש. להשהות את הגלולה בנפח אחד של DBPS בתוספת 0.8 שומות של נתרן כלורי. צנטריפוגה ב 12000 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. אם הסופרנאטנט אינו ברור, הפוך בעדינות את הצינור וחזור על הצנטריפוגה. ערבבו שוב את שני הסופרנאטנטים והצנטריפוגה במהירות של 12000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

לאחר מכן, השתמש פיפטה כדי להפקיד שיפועים של יודיקסונל לתוך צינורות פוליאלומר 5 מיליליטר דקים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. יש להעמיס 3 מיליליטר של הסופרנאטנט המזוקק, המכיל וירוסים, על גבי שיפוע היודיקסונלי המוכן. צנטריפוגה עם רוטור SW55ti בעוצמה של 234,000 x גרם ובטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס למשך 3.5 שעות, תוך הקפדה על האטת התאוצה וההאטה. לאחר השלמת אולטרהצנטריפוגה, לאסוף 12 שברים צינורות סיליקון.