בדיקת היווצרות מושבות קרטינוציטים: בדיקת מבחנה להערכת יכולתם של קרטינוציטים לגדול למושבות

- בדיקת היווצרות מושבה קובעת את יכולתם של תאים בודדים להתרבות וליצור מושבות. התחילו עם עור עכבר-גבי נכרת בצלחת תרבית. יש לגרד את הרקמה התת עורית והשומן מהצד הגחוני של העור. לטפל ברקמה עם פתרון עיכול. האנזימים הפרוטאוליטיים בתמיסה מפרקים את המטריצה החוץ תאית, וגורמים לדיסוציאציה של תאי האפידרמיס.

גרדו בעדינות את שכבת האפידרמיס כדי לשחרר את התאים והשערות המנתקים למצע קציר. סנן את התרחיף דרך מסננת מתאימה כדי ללכוד שערות או כל פסולת ולקבל תרחיף חד תאי של תאי האפידרמיס. העבירו את הנפח הרצוי של תרחיף תאים זה לצלחת מצופה קולגן המכילה שכבה דבקה של תאי הזנה שנעצרו. תוספת עם מדיה מתאימה המעדיפה הישרדות keratinocyte.

במהלך התרבית, הקרטינוציטים נצמדים לשכבת ההזנה. בנוסף, תאי הזנה אלה מפרישים גורמי גדילה ומסנתזים חלבוני מטריצה חוץ-תאיים התומכים בצמיחת קרטינוציטים. בהתאם ליכולת ההתרבות של קרטינוציטים בודדים, הם מתחילים ליצור מושבות. הסר את המדיה ותקן את המושבות. לצבוע את התאים עם צבע מתאים כדי לזהות את המושבות לספירה. בפרוטוקול הבא נבצע את הבדיקה הקלונוגנית של קרטינוציטים ראשוניים שנקטפו מהעכברים הבוגרים לאחר הטיפול בתרכובות בדיקה.

- לאחר קצירת דגימות עור גבי מעכברים בוגרים שעברו המתת חסד, השתמשו במלקחיים אוטוקלאביים ובאזמל כדי להניח עור גבי אחד בכל פעם, שעיר כלפי מטה, לתוך צלחת פטרי דקה ולגרד את הרקמה התת עורית, כולל השומן מהצד הגחוני של רקמת העור, עד שהרקמה שקופה למחצה.

הניחו את העור המרוטש הזה ב-PBS עד שכל שאר העורות הנותרים יעובדו. לאחר מכן, השתמש באזמל כדי לחתוך את דגימות העור לרצועות של 0.5 x 1 עד 1.5 סנטימטר. הניחו את הרצועות השעירות כלפי מעלה בצלחת פטרי סטרילית לפני שתציפו את הדגימות בצד השעיר כלפי מעלה על פני השטח של PBS 20 מיליליטר בתוספת תמיסת גנטמיצין 2x בתוספת 0.25% טריפסין בצלחת פטרי פלסטיק בגודל 100X20 מ"מ למשך שעתיים בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס.

בתום הדגירה מניחים צלחת פטרי מרובעת סטרילית מפלסטיק המכילה 15 מיליליטר מדיום קטיף בשיפוע של 30 מעלות, ובעזרת מלקחיים מעוקלים מעבירים בזהירות רצועת עור צפה לתוך המנה. מחזיקים להב אזמל חדש בזווית ניצבת לעור ומשתמשים בכוח מספיק אך לא מוגזם, מגרדים את האפידרמיס ואת השערות מהדגימה למדיום.

לאחר גירוד כל הרצועות, רוקנו בזהירות את הסופרנאטנט המכיל תאי אפידרמיס לצנצנת סטרילית של 60 מיליליטר המכילה מוט ערבוב מגנטי בקוטר 1.5 אינץ', ושטפו את צלחת הפטרי עם אמצעי קציר נוסף כדי לאסוף את תאי האפידרמיס שנותרו.

מביאים את הנפח הסופי בצנצנת ל -30 מיליליטר עם מדיום טרי, ומערבבים את תמיסת תאי האפידרמיס ב -100 סיבובים לדקה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. בתום הדגירה, בארון בטיחות ביולוגית, מוציאים את מוט הערבוב ומסננים את תמיסת התאים דרך מסננת של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר.

השתמש במלקחיים ולאחר מכן פיפטה כדי ללחוץ על השערות ועל חומרי שכבת הקרנית דרך המסננת כדי לתפעל את הרקמה כדי לשחרר את תאי השערה הכלואים, והשתמש ב -5 מיליליטר נוספים של אמצעי קציר כדי לשחרר את תאי השערה הלכודים שנותרו לתוך הצינור.

- קריטי שתאי האפידרמיס והשערות יעברו מניפולציה כדי לשחרר את התאים מזקיקי השיער.

- להביא את הנפח הכולל בצינור עד 50 מיליליטר עם מדיום טרי ולאסוף את סינון התא על ידי צנטריפוגה. משעים מחדש את הגלולה ב 5 מיליליטר של מדיום קציר טרי וכ 20 triturations עם פיפטה 5 מ"מ. קח 0.5 מיליליטר של דילול 1:20 ולהעביר אותו צינור microfuge 2 מיליליטר.

לאחר ערבוב הדגימה בזהירות, לקחת 200 מיקרוליטר מצינור המיקרופוגה ולערבב בעדינות עם נפח שווה של 0.4% תמיסת טריפאן כחול. מערבבים בעדינות תמיסה זו שלוש פעמים ומעבירים את התאים להמציטומטר לספירת קרטינוציטים גרעיניים.

ציון כל התאים הכחולים הכהים כתאים שאינם בני קיימא, וציון תאים ורדרדים זהובים קטנים כתאים בני קיימא. ממוצע הכדאיות הוא כ-80%, ותשואת הקרטינוציטים הסופית לעכבר צריכה להיות כ-30 מיליון תאים בני קיימא. לאחר הספירה, לאסוף את התאים עם צנטריפוגה נוספת, עבור תרבית המונית, resuspend 2 עד 4 פעמים 10 כדי keratinocytes קיימא השישי לכל צלחת פטרי 35 מ"מ ב 2 מיליליטר של מדיום תרבית התא.

עבור בדיקת היווצרות מושבה קלונוגנית, להשהות מחדש את התאים ב 1 כפול 10 עד קרטינוציטים השלישי לכל 4 מיליליטר של מדיום E של ויליאם שונה עם תוספי מזון וריכוז בסרום לכל צלחת פטרי 60 מ"מ מצופה קולגן על שכבות מזין עכבר שוויצרי 3T3 מוקרן רנטגן.

עבור תרבית המונים, לגדל את התרביות ב 32 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני למשך תקופת תרבית התאים המתאימה, שינוי התווך 24 שעות לאחר הזריעה הראשונית עבור תרבית המונים ו 3 פעמים בשבוע לאחר מכן.

בסוף תרבות השבטים, שואפים את המדיום ומקבעים את המושבות ב-10% פורמלין חוצץ למשך הלילה בטמפרטורת החדר. למחרת בבוקר, הכתימו את המושבות עם 0.5% רודאמין B במים אוטוקלאביים למשך שעה לפני שטיפת הכלים במים אוטוקלאביים קרים עד שהמים זורמים צלולים. לאחר מכן, הטה את הכלים על מכסיהם לייבוש לפני ספירת המושבות.