transgenesis מבוסס וקטור miniCoopR: טכניקה לסינון גנים הגורמים למלנומה במודל הגידול של דגי זברה

- בדגי זברה, מלנומה נובעת מטרנספורמציה ממאירה של מלנוציטים - התאים מייצרי המלנין. כדי לחקור את הופעת המלנומה, השתמשו במודל של דגי זברה טרנסגניים עם מחסור במלנומה. מודל זה חסר מלנוציטים עקב מוטציה של אובדן תפקוד במקדם המיצית הספציפי למלנוציטים.

התחל על ידי לקיחת עובר חד תאי של מודל מהונדס זה על צלחת אגר. הזרקה משותפת תערובת המכילה וקטור miniCoopR מבוסס טרנספוזון ואנזים טרנספוזון mRNA לתוך העובר. הווקטור מכיל קלטת גן, המורכבת ממיניגן מיטפה נושא מקדם המחובר לגן מועמד הדחוק בין שני יסודות טרנספוזון.

ה-mRNA המוזרק בהזרקה משותפת מקודד חלבוני טרנספוזאז. חלבונים אלה פועלים על יסודות הטרנספוזון ומזרזים את כריתת הקלטת מווקטור המיני-קואופר, ולאחר מכן את שילובה בדנ"א הגנומי של העובר. לאחר מכן, מקדם הקלטות מניע את הביטוי הן של גן המיטפה והן של הגן המועמד המעניין.

גן המיטפה תומך בהצלה והתפתחות של מלנוציטים, ואילו הגן המועמד, אם הוא אונקוגני, גורם להתפרצות מלנומה. מסך את דג הזברה המפותח. דגים טרנסגניים עם מלנוציטים שניצלו מפתחים פיגמנטציה של מלנין, ואילו אלה הנושאים מלנומה נושאים נגעים פיגמנטיים מורמים.

בפרוטוקול הבא, נציג את ההקרנה של משנים להופעת מלנומה באמצעות וקטורים miniCoopR במודלים של גידולי דגי זברה טרנסגניים.

- כדי ליצור מבנים להזרקה, התחל ביצירת שיבוטים של כניסה אמצעית על ידי PCR המגבירה את מסגרת הקריאה הפתוחה באורך מלא של גנים מעניינים ומשלבת מחדש לתוך pDONR221. לאחר מכן, השתמש בטכנולוגיית Multisite Gateway כדי לשלב מחדש את מקדם המיטפה הספציפי למלנוציטים, הגן המעניין והאות הפוליאדנילציה לווקטור miniCoopR כדי למקם גנים מעניינים תחת שליטתו של מקדם המיטפה.

הזריקו 25 פיקוגרמות של כל שיבוט יחד עם 25 פיקוגרמות של Tol2 transposase mRNA לעוברים חד-תאיים, טרנסגניים, משולשים-הומוזיגוטים של דגי זברה. בעלי חיים מוטנטיים מסוג Mitfa-BRAF-p53 סובלים ממחסור במלנוציט ונוטים להשתנות ולהיווצר מלנומה. יחד עם הגן המעניין, וקטור המיני-CoopR מכיל מיניגן מצית מציל. לכן, בעלי חיים המוזרקים בהצלחה יפתחו מלנוציטים שניצלו, המבטאים את הגן המעניין.

לדגור על העוברים המוזרקים ב 28.5 מעלות צלזיוס. ב 24 שעות לאחר ההפריה, או hpf, להסיר את כל העוברים המתים. 72 שעות לאחר ההפריה, באמצעות מיקרוסקופ מנתח תחת אור אירוע על רקע לבן, לבחור בעלי חיים טרנסגניים עם מלנוציטים שניצלו.

כאשר בעלי החיים מגיעים 4 ימים לאחר ההפריה, להעביר אותם טנקים 3 ליטר במשתלה של מתקן דגי זברה. בגיל חודשיים, בחר את בעלי החיים עם לפחות אזור אחד של הצלת מלנוציטים גדול מ 4 מילימטרים בריבוע. סנן את בעלי החיים שנבחרו מדי שבוע לנוכחות גידולים. בודדו בעלי חיים נושאי גידול לצורך מחקר.

צייר עקומות הישרדות ללא מלנומה עם גיל ושבועות על אבסיסה ואחוז הישרדות ללא מלנומה על הקואורדינטה. השוו בעלי חיים עם מלנוציטים המבטאים גן בעל עניין בבקרת בעלי חיים המבטאים EGFP במלנוציטים. השתמש בבדיקת דירוג יומן כדי לקבוע אם שתי העקומות שונות סטטיסטית.