JoVE Encyclopedia of Experiments
מחקר סרטן
0 צפיות • 3:45 דק' • April 30th, 2023
- גורמי שעתוק הם חלבונים המכילים תחומים קושרי DNA. הם נקשרים לרצפי דנ"א ספציפיים ומסייעים לווסת את ביטוי הגנים בתאים. כדי לזהות ביטוי פקטורי שעתוק במלנוציטים הקשורים לקשקשים, ראשית, קצרו קשקשים גביים בעלי פיגמנטציה כהה מדגי זברה מורדמים. תקן את הקשקשים וטפל בהם עם פתרון חדירה כדי להפוך את המלנוציטים בודדים לחדירים.
טפלו בתמיסת אקונומיקה כדי להסיר את גרגרי פיגמנט המלנין הכהים מהתאים. תהליך הלבנה זה מבטל את הסיכויים לאותות רקע הקשורים לפיגמנט במהלך שלבי הצביעה הבאים. דגירה עם תמיסה חוסמת המכילה חלבונים כדי לחסום אתרי קישור חלבונים לא ספציפיים על פני התא.
כעת, יש לטפל בדגימה עם הנוגדנים הראשוניים הרצויים. נוגדנים אלה נקשרים לגורמי שעתוק המטרה שלהם בתוך התאים. לאחר מכן, תייגו את הדגימה עם נוגדנים משניים מתויגים פלואורסצנטיים ספציפיים לנוגדנים הראשוניים. בנוסף, טפלו בדגימה בצבע קושר DNA פלואורסצנטי מתאים כדי להכתים את גרעיני התא. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לזהות פליטות פלואורסצנטיות בהירות ממכלולי גורמי השעתוק-נוגדנים וגרעיני התא.
בפרוטוקול הבא, נראה את ההכתמה החיסונית של מלנוציטים הקשורים לקשקשים גביים המבטאים גורם שעתוק מעורר מלנוציטים-A, או מיטפה, בדג זברה מהונדס.
- כדי לבצע immunostaining, להרדים את הדג ב 0.17 מיליגרם למיליליטר של טריקאין. עם אור אירוע תחת מיקרוסקופ מנתח, השתמש במלקחיים חדים עדינים כדי למרוט קשקשים גביים, תוך זהירות לא לפגוע במחצית הקשקשת המכילה מלנוציטים. מניחים את הקשקשים ישירות מהמלקחיים לתוך מיליליטר אחד של קיבוע ודגרים בטמפרטורת החדר, תוך כדי סיבוב, במשך יותר או שווה לשעתיים. העבירו את הדג למי הדגים ועקבו אחר הדגים כדי לוודא התאוששות מוצלחת.
כדי להלבין מלנוציטים פיגמנטיים, ראשית, שטפו קשקשים קבועים ב-PBST פעמיים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף 1 מיליליטר של תמיסת אקונומיקה טרייה ולכסות עם מנעולי פרפילם או מכסה כדי למנוע גז מפיצוץ צינורות פתוחים. ממשיכים להלבין עד שהפיגמנט נעלם. לאחר מכן, יש לשטוף ב-PBST ארבע פעמים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
לדגור לפחות 30 דקות בתמיסת בלוקים. לאחר מכן, דגרו עם כ-400 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני בתמיסת בלוקים למשך הלילה בטמפרטורת החדר. למחרת, שטפו את הקשקשים שלוש פעמים במשך 30 דקות ב-PBST בטמפרטורת החדר. יש לדגור עם נוגדן משני למשך שעתיים עד לילה בטמפרטורת החדר.
לאחר צביעה עם DAPI, יש למרוח טיפה של vectashield על מגלשת זכוכית ולהרכיב את הקשקשים כך שהצד הקעור של הקשקשים פונה כלפי מטה כנגד המגלשה. הניחו כיסוי זכוכית מחליק על הדגימות. השתמשי בלק שקוף כדי לאטום את הקצוות ולהתבונן בשקופיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.