פריימר ללא aptamer לבחירה באמצעות ספריית ה-DNA אקראיים

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לזהות abers מספרייה אקראית, הנקשרים באופן ספציפי לחלבון מטרה, ובמקרה זה, חלבון S 100 B. מטרה זו מושגת תחילה על ידי עיכול של הספרייה באמצעות רסטריקציית אנדונוקלאז כדי לשחרר רצפים אקראים מרצפי פריימרים קבועים הסמוכים להם. השלב השני של הפרוצדורה הוא קישור רצפי הספרייה האקראית לחלבון S 100 B מטוהר והשבתם.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא חיבור מחדש של הרצפים הקשורים לרצפי הפריימרים הקבועים באמצעות היברידיזציה וליגציה. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא שעתוק התוצרים שעברו ליגציה כדי לאפשר הגברה מחדש ב-R-T-P-C-R של מאגר ה-abers המועמדים הקשורים, ולאחריה סבבים נוספים של פרוצדורת סלקציה זו. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות קישור ספציפי של abers נבחרים לחלבון S 100 B.

לדוגמה, כאן, בדיקות קישור מסוג סנדוויץ' מבוצעות באמצעות מערכים זעירים (microarrays), ובדיקות נוגדנים שניים מסומני פלואורסצנציה מבוצעות באמצעות ננו-חוטים פונקציונליים ונוגדנים שניים המצומדים לננו-חלקיקי זהב בגודל 15 ננומטר. היום נציג פרוצדורה לבחירת רצפים אופטימליים, הקושרים לחלבון S100B, מתוך ספרייה אקראית של רצפי DNA. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו למגוון מטרות, כולל פיתוח פלטפורמת חיישן לגילוי מוקדם של סרטן.

בואו נתחיל. כדי להתחיל בנוהל זה, ייצרו ספריית DNA ללא פריימר (PF), כפי שתואר בעבר. שבירה של ספריית ה-DNA בעלת הגדילים הכפולים, ולאחריה טהרה בג'ל באמצעות ג'ל פוליאקרילאמיד דנטורטיבי בריכוז 10%, תביא לקבלת פרגמנט של 32 נוקלאוטידים עם פוספט ב-5', ופרגמנט של 30 נוקלאוטידים עם פוספט ב-5', אשר יוגדרו כפרגמנטים 32+ ו-30+ בהתאמה.

הפרגמנט 32 plus מכיל את הדומיין האקראי של 30 נוקלאוטידים עם רצף ה-CC המינימלי השולי בקצה ה-3', בעוד שהפרגמנט 30 plus מורכב אך ורק מרצף הדומיין האקראי של 30 נוקלאוטידים. כדי להכין את פרגמנט ה-DNA של ספריית ה-PF לצורך סלקציית aptr, השHה כל אחד מהפרגמנטים 32 plus ו-30 plus ב-40 µL של 20 mM Tris, HCl pH 7.4. לאחר מכן, חמם את הדגימות למשך שלוש דקות ב-85 °C בעקבות האינקובציה.

קררו את הדגימות במשך שלוש דקות במקלט מים בטמפרטורה של 37 °C, לאחר מכן הוסיפו 760 µL של בופר ברירה (selection buffer) והדגירו למשך שלוש דקות בטמפרטורה של 37 °C. לאחר שלוש דקות, השאירו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר ההדגרה, העבירו את התמיסה דרך עמודה המכילה חרוזי agarose עם nickel NTA שנשטפו מראש בבופר ברירה.

כדי להסיר DNA שאינו ספציפי, אספו את מקטעי ה-DNA של ספריית ה-PF שאינם נקשרים לעמודה ושמרו אותם להמשך. להכנת חרוזי ה-S 100 B הקשורים, סובבו תחילה 400 µL של חרוזי ניקל NDA למשך שלוש שניות במיקרו-צנטריפוגה והסִירו את העילאי.

לאחר מכן, סובבו את החרוזים (spin down) והשליכו את העילאי. חזרו על פעולה זו. שטפו פעמיים.

בשלב הבא, העבירו את החלבון בעל תג היסטדין שzוּנקה מראש מעל לחרוזים. כאן נעשה שימוש בחלבון B של S100 קושר סידן אנושי. העבירו את התמיסה בעדינות למעלה ולמטה בעזרת פיפט חמש פעמים בכל שלוש דקות, למשך 15 דקות בסך הכל.

לאחר 15 דקות, סבבו את החרוזיים בצנטריפוגה והשליכו את הנוזל העליון. לבסוף, שטפו את ה-S 100 B הקשור לחרוזיים עם 400 µL של תמיסות בחירה (selection buffer), על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה שלוש פעמים. סבבו שוב את החרוזיים בצנטריפוגה והשליכו את הנוזל העליון.

חזרו על שלב זה פעמיים, לסך הכל שלושה שטיפות סופיות, כדי לבחור את ה-abers הקשורים ל-S 100 B. השמיגו את מקטעי ה-32 plus וה-30 plus שהוצדדו קודם לכן. הוסיפו את המקטעים ל-S 100 B הקשור לחרוזים. לאחר מכן, דגרו את הדגימה למשך 15 minutes.

ערבבו בכל שלוש דקות על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה, ולאחר 15 דקות, סובבו את החרוצים קצרה במערכת צנטריפוגלית (spin down), השליכו את הנוזל העליון (supernatant), ולאחר מכן שטפו את קומפלקס ה-S 100 BDNA באמצעות 800 µL של בופר סלקציה על ידי פיפטינג עדין. לאחר מכן, סובבו את החרוצים במערכת צנטריפוגלית והשליכו את הנוזל העליון. חזרו על שלב שטיפה זה פעמיים.

כדי להפיק את ה-S 100, יש להוסיף 200 µL של Tris-HCl בריכוז 20 mM ו-pH 7.4 לחרוזים. לאחר מכן, יש לחמם את תמיחת החרוזים למשך שלוש דקות בטמפרטורה של 85 °C. לאחר הדגירה.

ערבבו את החרוצים במיקסר Vortex למשך דקה אחת וסבבו אותם במצנטריפוגה להסמכה. לאחר מכן, העבירו את הנוזל העליון (supernatant) למבחנה נקייה. חזרו על שלב זה פעם אחת ואחדו את הנוזלים העליונים.

לבסוף, טהרו את מקטעי ה-DNA שנבחרו. בצעו חילוץ של תוצרי ה-PCR פעמיים עם נפח שווה של פניל כלורפורם ואיזופרופיל אלכוהול. השקיפו אותם באמצעות 250 millimolar של נתרן כלוריד וכפי 2.5 מהנפח של 100%Ethanol בטמפרטורה של minus 70 degrees Celsius למשך 15 דקות.

סבבו בצנטריפוגה במהירות של 21,000 GS בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, השליכו את הנוזל העליון. שטפו את המשקע ביעילות עם 75% ethanol.

סובבו בצנטריפוגה במהירות של 21,000 GS בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך חמש דקות והשליכו את תסמין העל. ייבשו את המשקע בואקום מהיר למשך שלוש דקות לאחר 10 סבבי סלקציה. שלבו את מקטעי ה-DNA שהוגברו ב-PCR בתוך וקטור PCR 2.1 topo שהתקבל מ-vitrogen core.

לאחר מכן, רצפו בין 40 ל-50 מושבות בודדות עבור כל אחד ממקטעי ה-N 30 cc וה-N 30 שנבחרו, באמצעות הפריימר M 13 forward. יישרו את הרצפים שנבחרו באמצעות תוכנת infomax vector NTI. לאחר מכן, קבעו את רצפי הקונסנזוס על בסיס היישורים.

לאחר זיהוי רצפי הקונסנסוס, רכשו נטיבני קונסנסוס כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. השעו את האפטמר הראשון שסונתז עם מוטיב Amin C six בקצה 'five prime' במסייפר הדפסה (printing buffer) לריכוז סופי של 15 micromolar. לאחר מכן, נקטו את תמיסת האפטמר על גבי שקפים מופעלים מסוג code link באמצעות מערך microgrid של apogen discoveries.

פעלו לפי הפרוטוקולים המומלצים בקישור לקוד. הדפיסו כל שקופית עם 12 מערכים. השתמשו בפורמט של שתיים על שמונה.

קסטת היברידיזציה של מערך מיקרו (Microarray) לצורך היברידיזציה. דללו את חלבון S 100 B לריכוז המתאים ב-70 µL של PBS. לאחר מכן, גרש את התמיסה לבארי של קסטת מערך המיקרו.

אטמו את קסדרת המיקרומערך (microarray cassette) באמצעות רדיף אטימה דביק נטול נוקלאז כדי למנוע התאיידות. אפשרו לחלבון להיקשר ל-abers המודפסים על ה-code link. לאחר מכן, הכניסו לדגירה בודדת למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.

שטפו את בארות הקסטה שלוש פעמים ב-PBS עם חמישה מילימולר מגנזיום כלוריד או PBSM. לאחר מכן, דללו את הנוגדנים המשניים המסומנים פלואורסצנטית ל-0.125 micromolar ב-70 microliters של PBSM. חממו את התערובת למשך שלוש דקות ב-85 °C.

לאחר מכן, יש לאפשר ל-ABERS המסומנים להתקרר על קרח. במשך שלוש דקות, יש להחיל את ה-abers לבארות של קסטת המיקרו-מערך (microarray). שוב, יש לאטום את הקסטה בעזרת רדיד דביק ולהדגיר אותן למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.

שוב, באופן פרטני. שטפו את הבארים שלוש פעמים עם PBSM לאחר השטיפה. פרקו את הקסטרה ושטפו את כל השקופית ב-PBSM.

לאחר מכן, ייבשו את השקופית ביסודיות באמצעות סבב צנטריפוגה. לבסוף, סרקו את השקופית באמצעות מערך סריקה של Packard Biosciences. קשירת 4,000 XL נקבעה עבור אפטמרים המסומנים בקצה 5' באמצעות gamma P 32 A TP לחלבון S 100 B, והתוצאות שורטטו מול הריכוז לצורך קביעת KD.

ערכי Kd מייצגים לאחר שבעה סבבים בערך של סלקציה הם בדרך כלל בטווח של 10⁻⁷ מולרי. אפטמרים ראשונים עם קצה 5' שנועד לקישור הוצמדו למערכי מיקרו-צמודים (code link microarrays). חלבון S100B מופק נקשר לאפטמר הראשון, ולאפטמר שני המסומן ב-LOR 546 נקשר לקומפלקסי S100B-אפטמר ראשון.

הפלורסצנציה נמדה כמותית באמצעות סורק מערך סריקה. השורה האמצעית מראה קישור סנדוויץ', המתאפיין בקישור אדיטיבי במבחני KD בשורות שמעל ומתחת. אין קישור סנדוויץ' עבור abers חמישי; ה-thiol derivatized first abers הראשונים שוזרו לננו-חוטי זהב באמצעות כימיית thile סטנדרטית.

נוגדנים שניים הוצמדו ל-50 NMO או ל-gold nps באותו אופן. לאחר מכן, חלבון S 100 B מנוקה נקשר תחילה לננו-חוטים הנגזרים; לאחר מכן נקשרו aptamer 50 nano molar gold mps למתחמי ה-S 100 B על ננו-חוטי האפטמר הראשונים. מתחמי סנדוויץ' קשורים הודגמו באמצעות F FE SEM.

ניתן לראות ביקורת שלילית עבור בדיקת קישור (binding assay) שבוצעה עם חלבון HTRA 1 במקום חלבון S 100 B. ובכן, אחד הדברים החשובים ביותר בנוגע לפרוצדורה הוא שאנו משתמשים בגישה נטולת פריימרים, שבה אין רצפים קבועים שעלולים לגרום לתוצאות חיוביות שגויות ולתוצאות שליליות שגויות עקב השתלטות הרצפים עצמם על האזור האקראי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לוודא שתבנית ה-DNA הושמדה לפני כל תגובת שעתוק הפוך (reverse transcription), ולהקפיד לבודד את תוצר ה-R-T-P-C-R הספציפי לאחר כל הגברה מחדש.

זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.