פריימר ללא aptamer לבחירה באמצעות ספריית ה-DNA אקראיים
July 26th, 2010
פרוטוקולים Selex מהווים סבבים רבים של ברירה, שכל אחד מהם דורש התחדשות של ligands כבול, אשר בתורו דורשים רצפים פריימר קבוע איגוף האזורים ספריה אקראי. רצפים אלה תחל קבוע יכול להפריע בתהליך הבחירה (חיוביות שגויות תשלילים). כאן אנו מציגים פריימר ללא פרוטוקול.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות אברים מספרייה אקראית, הנקשרים באופן ספציפי לחלבון מטרה במקרה זה, חלבון S 100 B. זה מושג על ידי עיכול הספרייה תחילה עם אנדונוקלאז הגבלה כדי לשחרר רצפים אקראיים מרצפי פריימר קבועים מאגפים. השלב השני של ההליך הוא לקשור את רצפי הספרייה האקראית לחלבון S 100 B מטוהר ולשחזר אותם.
השלב השלישי של ההליך הוא איחוד רצפים קשורים עם רצפי פריימר קבועים על ידי הכלאה וקשירה. השלב האחרון של ההליך הוא תמלול המוצרים הקשורים כדי לאפשר הגברה מחדש של R-T-P-C-R של מאגר האברים המועמדים המאוגדים, ואחריו סבבים נוספים של הליך בחירה זה. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות קשירה ספציפית של אברים נבחרים לחלבון S 100 B.
לדוגמה, כאן, מבחני קשירת סנדוויץ' מבוצעים באמצעות מיקרו-מערכים ובדיקות אברס שניות עם תווית פלואורסצנטית מבוצעות גם באמצעות ננו-חוטים פונקציונליים ואבי שניים המחוברים לננו-חלקיקי זהב של 15 ננומטר. היום נציג נוהל לבחירת אופטימלי, הנקשרים לחלבון S מאה B מספרייה אקראית של רצפי D. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו למגוון מטרות, כולל פיתוח פלטפורמת חיישנים לגילוי מוקדם של סרטן.
אז בואו נתחיל. כדי להתחיל בהליך זה, צור ספריית DNA ללא פריימר או PF כפי שתואר קודם לכן. פיצול של ספריית ה-DNA הדו-גדילית ואחריו טיהור ג'ל עם ג'ל פולי אקרילאמיד 10% יביא לשבר של 32 נוקלאוטידים של חמישה פוספטים ראשוניים ב-30 סמ"ק, ושבר של 30 נוקלאוטידים של חמישה פוספטים ראשוניים ב-30, המסומנים לשבר 32 פלוס ו-30 פלוס בהתאמה.
שבר 32 פלוס מכיל את התחום האקראי של 30 נוקלאוטידים עם רצף האגף המינימלי CC בשלושת הקצוות הראשוניים, בעוד שקטע 30 פלוס מורכב רק מרצף התחום האקראי של 30 נוקלאוטיד. כדי להכין את שברי ה-DNA של ספריית ה-PF לבחירת aptr, resus השעו כל אחד משברי 32 פלוס ו-30 פלוס ב-40 מיקרוליטר של 20 מילי-טריס, HCL pH 7.4. לאחר מכן מחממים את הדגימות במשך שלוש דקות בחום של 85 מעלות צלזיוס לאחר הדגירה.
מצננים, הדגימות למטה למשך שלוש דקות באינקובטור אמבט מים של 37 מעלות צלזיוס, לאחר מכן ב-760 מיקרוליטר של בחירה, חוצצים ודוגרים במשך שלוש דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר שלוש דקות, שמור את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר הדגירה, העבירו את התמיסה דרך עמודה המכילה חרוזי ניקל NTA אגרו שטופים מראש עם מאגר בחירה.
כדי להסיר DNA לא ספציפי, אסוף את מקטעי ה-DNA של ספריית ה-PF שאינם נקשרים לעמודה והניח בצד למועד מאוחר יותר. כדי להכין את החרוזים הקשורים S 100 B סובבו תחילה 400 מיקרוליטר של חרוזי NDA ניקל למשך שלוש שניות במיקרו צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן שטפו את החרוזים עם 400 מיקרוליטר של מאגר מחייב על ידי פיפטינג בעדינות חמש פעמים.
לאחר מכן סובב את החרוזים והשליך את הסופרנטנט. חזור על זה. שוטפים פעמיים.
הבא עניים בעבר מטוהר היסטידין חלבון מתויג מעל החרוזים. כאן, קשירת סידן S 100 אנושית. משתמשים בחלבון B בעדינות למעלה ולמטה חמש פעמים כל שלוש דקות למשך 15 דקות בסך הכל
.לאחר 15 דקות, סובבו את החרוזים והשליכו את הסופרנטנט. לבסוף, שטפו את החרוז הקשור S 100 B עם 400 מיקרוליטר של מאגר בחירה בעדינות על ידי ליטוף למעלה ולמטה שלוש פעמים. שוב, סובב את החרוזים כלפי מטה והשליך את הסופרנטנט.
חזור על שלב זה פעמיים בסך הכל שלוש שטיפות אחרונות כדי לבחור עבור אברים קשורים S 100 B. אחזר את הקטעים של 32 פלוס ו-30 פלוס שהונחו קודם לכן בצד. הוסף את השברים לכרוך החרוזים S 100 B.לאחר מכן דגרו את הדגימה למשך 15 דקות.
ערבוב כל שלוש דקות על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה לאחר 15 דקות, סובב לזמן קצר את החרוזים, השליך את הסופרנטנט, ואז שטוף את קומפלקס S 100 BDNA עם 800 מיקרוליטר של מאגר בחירה על ידי פיפטינג עדין. לאחר מכן סובב את החרוזים כלפי מטה והשליך את הסופרנטנט. חזור על שלב כביסה זה פעמיים.
כדי לשחזר את ה-S 100, יש לבחור abers ב-200 מיקרוליטר של 20 מילי-מולרי tris, HCL pH 7.4 לחרוזים. לאחר מכן מחממים את התרחיץ למשך שלוש דקות בחום של 85 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה.
מערבלים את החרוזים למשך דקה אחת וסובבים אותם כלפי מטה. לאחר מכן העבירו את הסופרנטנט לצינור טרי. חזרו על שלב זה פעם אחת ושלבו את הסופרנטנטים.
לבסוף, טהר את שברי ה- DNA שנבחרו. חלץ את מוצרי ה-PCR פעמיים עם נפח שווה ערך של פניל כלורופורם, אלכוהול איזופרופיל. זרז אותם עם 250 מילי-מולרי נתרן כלורי ופי 2.5 מנפח 100% אתנול במינוס 70 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
הסתובב ב-21,000 GS בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. ואז השליכו את הסופרנטנט. שוטפים את הגלולה עם 75% אתנול ביעילות.
סובב ב-21,000 GS בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות והשליך את הסופרנטנט. יבש את הגלולה בוואקום מהיר למשך שלוש דקות לאחר 10 סבבי בחירה. שיבוט שברי ה-DNA המוגבר של ה-PCR שנוצר לתוך וקטור הטופו PCR 2.1 המתקבל מליבת ויטרוגן.
לאחר מכן רצף בין 40 ל-50 מושבות בודדות עבור כל אחד משברי N 30 סמ"ק ו-N 30 שנבחרו עם פריימר M 13 קדימה. יישר את הרצפים שנבחרו באמצעות תוכנת infomax vector NTI. לאחר מכן קבע את רצפי הקונצנזוס על סמך היישור.
לאחר שזוהו רצפי קונצנזוס, רכוש אברי קונצנזוס כמתואר בפרוטוקול הכתוב. השעו את האפטמר הראשון המסונתז עם שש חלק של חמישה ראשוניים Amin C במאגר הדפסה לריכוז סופי של 15 מיקרומולר. לאחר מכן אתר את פתרון האפטמר על שקופיות המופעלות על קישור קוד באמצעות מערך מיקרו-גריד של apogen Discoveries.
מעקב אחר הפרוטוקולים המומלצים של קישור הקוד. הדפס כל שקופית עם 12 מערכים. השתמש בפורמט שתיים על שמונה.
קלטת היברידיזציה של Microarray להכלאה. מדללים את החלבון S 100 B לריכוז המתאים ב -70 מיקרוליטר PBS. לאחר מכן החל את התמיסה על הבארות של קלטת המיקרו-מערך.
אטום את קלטת המיקרו-מערך באמצעות רדיד תקרה דביק נטול נוקלאז למניעת אידוי. אפשר לחלבון להיקשר לאברס המודפס על קישור הקוד. יש להחליק במשך שעה בטמפרטורת החדר לאחר הדגירה בנפרד.
שוטפים את בארות הקסטה שלוש פעמים עם PBS מגנזיום כלוריד חמישה מילימולר או PBSM. לאחר מכן, יש לדלל את האברס השני המסומן פלואורסצנטי ל-0.125 מיקרו-מולר ב-70 מיקרוליטר PBSM. מחממים את התערובת במשך שלוש דקות בחום של 85 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן הניחו ל-ABERS המסומנים להתקרר על קרח. במשך שלוש דקות, מרחו את האברים על הבארות של קלטת המיקרו-מערך. שוב, אטמו את הקסטה בנייר הדבק ודגרו אותם למשך שעה בטמפרטורת החדר.
שוב, בנפרד. שטפו את הבארות שלוש פעמים עם PBSM לאחר הכביסה. לפרק את הקסטה ולשטוף את כל השקופית עם PBSM.
לאחר מכן יבש היטב את השקופית באמצעות צנטריפוגה. לבסוף, סרוק את השקופית באמצעות מערך סריקה של Packard Biosciences. 4,000 XL נקבע קשירה עבור גמא P 32 A TP חמישה אפטמרים בקצה הראשוני שסומנו לחלבון S 100 B ושורטטו כנגד ריכוז לקביעת KD.
kds מייצגים לאחר כשבעה סבבי ברירה הם בדרך כלל בטווח של 10 עד שלילי שבע טוחנות. חמישה אפטמרים ראשונים מכוונים ראשונים חוברו למיקרו-מערכי קישור קוד, חלבון S 100 B מטוהר נקשר לאופטימר הראשון ו-LOR 5 46 שסומן שני. Optimer היה קשור למתחמי האופטימר S 100 B הראשונים.
הקרינה כומתה באמצעות סורק מערך סריקה. השורה האמצעית מציגה כריכת סנדוויץ' המאופיינת בכריכה תוספתית במבחני KD בשורות שמעל ומתחת. אין קשירת סנדוויץ' לאברים, חמישה אברים ראשונים שנגזרו מתיול חוברו לננו-חוטי זהב באמצעות כימיה סטנדרטית.
אברים שניים חוברו ל-50 NMO או nps זהב באותו אופן. חלבון S 100 B מטוהר נקשר תחילה לננו-חוטים הנגזרים, אפטמר שני 50 ננו-מולארי זהב mps נקשרו לאחר מכן לקומפלקסים הראשונים של ננו-חוטי אפטמר S 100 B. מתחמי כריכים כרוכים הודגמו באמצעות F FE SEM. הנה.
ניתן לראות בקרה שלילית לבדיקת קישור שבוצעה עם חלבון HTRA אחד במקום חלבון S 100 B. אוקיי, אז אחד הדברים החשובים ביותר בהליך הוא שאנחנו משתמשים בגישה נטולת פריימר שבה אין לנו רצפים קבועים שיכולים לגרום לתוצאות חיוביות שגויות ושליליות כוזבות על סמך הרצפים עצמם שמציפים את האזור האקראי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לוודא שתבנית ה-DNA נהרסת לפני כל תגובת שעתוק הפוכה, ולהקפיד לבודד את מוצר ה-R-T-P-C-R הספציפי לאחר כל הגברה מחדש.
אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
סקירה
מאמר זה מציג פרוטוקול ללא פריימר לבחירת אפטמרים הקושרים באופן ספציפי לחלבון S100B מתוך ספריית DNA אקראית. השיטה מכוונת לשפר את יעילות פרוטוקולי SELEX על ידי ביטול הפרעות מרצפי פריימר קבועים.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ביוכימיה
- הנדסת חלבונים
- ביוטכנולוגיה
רקע
- פרוטוקולי SELEX דורשים בדרך כלל רצפי פריימר קבועים שעלולים להוביל לתוצאות חיוביות ושלייליות כוזבות.
- זיהוי קושרים ספציפיים מספריות אקראיות הוא קריטי עבור יישומים שונים, כולל פיתוח חיישנים.
- חלבון S100B הוא מטרת עניין בגלל הרלוונטיות שלו באיתור סרטן.
- שיטות מסורתיות עשויות לעכב את תהליך הבחירה בגלל נוכחות רצפים קבועים.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה ללא פריימר לבחירת אפטמרים הקושרים לחלבון S100B.
- לייעל את תהליך ה-SELEX ולהעצים את הספציפיות.
- לספק פרוטוקול מפורט לחוקרים בתחום.
שיטות בשימוש
- עיכול של ספריית DNA אקראית להסרת רצפי פריימר קבועים.
- קשירה של הספרייה לחלבון S100B מטוהר.
- הכלאה וליגציה כדי לחבר מחדש רצפים קשורים עם רצפים קבועים.
- תעתוק והגברה של אפטמרים נבחרים באמצעות R-T-P-C-R.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של אפטמרים הקושרים באופן ספציפי לחלבון S100B.
- הוכחת קשירה באמצעות מבחני סנדוויץ' באמצעות מערכי מיקרו.
- אימות אפטמרים נבחרים באמצעות ננו-חוטים מתפקדים וננו-חלקיקי זהב.
- יישומים פוטנציאליים באיתור מוקדם של סרטן מודגשים.
מסקנות
- הפרוטוקול ללא פריימר משפר את תהליך ה-SELEX על ידי הפחתת הפרעות.
- אפטמרים נבחרים מראים הבטחה לשימוש ביישומי ביו-חיישנים.
- שיטה זו יכולה להתאים למטרות שונות מעבר לחלבון S100B.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Primer-free aptamer selection addresses a critical bottleneck in early discovery by eliminating fixed sequence interference, enabling more accurate identification of high-affinity binders. This innovation enhances predictive confidence in target validation and supports robust assay development for protein targets such as S100B. The approach is strategically relevant for biopharma portfolios seeking reliable molecular recognition tools for diagnostics and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables unbiased interrogation of molecular interactions by removing primer-induced artifacts.
- Improves functional target validation by isolating aptamers with true specificity for the protein of interest.
- Supports predictive confidence in downstream biological assays and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated aptamer libraries for high-throughput screening platforms.
- Enhances assay reproducibility by minimizing sequence-related variability.
- Delivers quantitative binding data (e.g., Kd values) for reliable compound or biomarker evaluation.
- Enables scalable and reusable assay formats, including microarrays and nanowire-based sensors.
Translational & Preclinical Research
- Aligns aptamer selection with disease-relevant protein targets such as S100B, supporting translational biomarker strategies.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by generating robust molecular probes.
- Reduces mechanistic ambiguity in preclinical models by ensuring aptamer specificity.
Pipeline & Workflow Integration
This primer-free selection method integrates at the interface of early discovery and assay development, supporting workflows from target validation to preclinical research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating aptamers with minimal sequence bias.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative binding outputs suitable for high-throughput and multiplexed assays.
- Analytics: Provides robust Kd measurements and consensus sequence identification for comparative analysis.
- Translational Research: Enables alignment with disease biomarkers and supports continuity into preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for aptamer selection against diverse protein targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes aptamer selection, improving reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of molecular diagnostics.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid chemistry and protein biochemistry.
- Needs access to instrumentation for DNA purification, amplification, and microarray or nanowire assays.
- Demands cross-team standardization of selection and validation protocols.
- Adaptation may be needed for different protein targets or sample matrices.
- Careful control of template destruction and product isolation is essential to avoid false positives.
