Name: אולטרסאונד מונחה Microinjection לתוך forebrain העכבר בתוך הרחם ב E9.5 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: למדו הזרקת מיקרו מונחית אולטרסאונד לתוך ה-Forebrain של עכברים עובריים ביום עוברי 9.5. שיטה זו מאפשרת מניפולציה של ביטוי גנים בתאי גרעין עצביים לפני תחילת הנוירוגנזה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+high-titer+pseudotyped+retroviral+vectors+with+very+broad+host+range%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of high-titer pseudotyped retroviral vectors with very broad host range.</a> Methods Cell Biol. 43, 99-112 (1994).</li>
<li>Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

זריקות ויראלי באמצעות הדרכה אולטרסאונד ניתן לבצע מ-E8.5 E11.5, שם רק את שק השפיר ניתן להזריק בכל E8.5, בעוד הן את שק השפיר מערכת חדרית ניתן להזריק מ-E9.5 E11.5. כאשר מבוצע כהלכה, חלקיקים נגיפיים מוזרק לתוך המערכת חדרית באמצעות הדרכה אולטרסאונד גישה התאים המצפים את מערכת חדרית, ולכן יכולים להדביק את המבנים השונים של המוח התיכון (הניאוקורטקס, הגרעינים הבזליים, diencephalon, עין וכו &#39;), forebrain ו למוח האחורי (Figure1C). וירוס שהוחדר לתוך שק מי השפיר יש גישה התאים החיצוני של העובר. בנוסף וירוס, הדרכה אולטרסאונד יכולה לשמש גם כדי להזריק לתוך התאים בעובר המתפתח. לכן, טכניקה זו מספקת מספר רב של אפשרויות לבחירה (תקופת זמן התפתחותי וירוס, מבנה / תאים) בעת תכנון ניסוי. זה קריטי, כי הנגיף מוזרק או תאים להביע כתב לזיהוי קל של תאים נגועים / מוזרק. מבחינה היסטורית, אדם phosphatase אלקליין השליה (PLAP) או ה-GFP נעשה שימוש. מניסיון, מצאנו PLAP יכול להיות גן הכתב מאוד שימושי כי הן PLAP histochemical והכתים immunohistochemical התשואות תא בודד חד וברור כתם מאפשר לנתח מורפולוגיה תאים המיקום לבצע ניתוח משובט. מאז הביטוי GFP ויראלי יכול להיות חלש, כתב ה-GFP לא יכול להיות אידיאלי עבור מכתים רקמות, אך הוא שימושי אם רוצים להשיג תאים בודדים ידי מיון מופעל תא פלואורסצנטי (FACS).

&quot;אחד מיקרוסקופים backscatter הבאים אולטרסאונד יכולה לשמש בהליך זה. למרות בסרטון P40 מ-Paradigm הרפואי משמש, P40 כבר לא זמינים מסחרית, וכן הוחלף P60, אשר במחיר דומה והוא יכול לשמש אותו יישום. חומרים נוספים תיאר לבניית שלב הם לשימוש עם התקן פרדיגמה רפואית (ים). Vevo 2100 מגיע עם ציוד הדמיה חיה קטנה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> P60 אולטראסאונד BioMicroscope (UBM) מ-Medical Paradigm ( <a href="http://www.paradigm-medical.com/ubms.html">http://www.paradigm-medical.com/ubms.html</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Vevo 2100 מ VisualSonics ( <a href="http://www.visualsonics.com/">http://www.visualsonics.com/</a> ) </li></ol> הרדמה משככי כאבים הפתרון נמבוטל (50 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​הנתרן להזרקה pentobarbital, המיוצר על ידי מעבדות אבוט) ניתן לקבל לבריאות בעלי חיים שיין Bulter. שים לב שזה חומר II הזמנים מבוקרת דורש הסוכנות למלחמה בסמים (DEA) להשיג רשיון. הפתרון Bupivacaine (0.25%, המיוצר על ידי Hospira, Inc, בין השאר) ניתן לקבל מספר מפיצים, כולל מור רפואי.

אולטרסאונד מונחה microinjection לתוך forebrain העכבר בתוך הרחם ב e9.5

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

בניתוח הישרדות ברחם אצל עכברים מאפשר מניפולציה המולקולרי של ביטוי גנים במהלך ההתפתחות. עם זאת, מאחר לדופן הרחם אטום במהלך embryogenesis מוקדם, היכולת למקד חלקים מסוימים של העובר על microinjection היא מוגבלת מאוד. למרבה המזל, בתדירות גבוהה הדמיה אולטרה סאונד מאפשר את הדור של תמונות שניתן להשתמש בהם בזמן אמת כדי להנחות מחט microinjection לאזור עובריים של עניין. כאן אנו מתארים את השימוש של הדמיה כגון להנחות את הזריקה של וקטורים retroviral למערכת חדרי המוח הקדמי של העכבר על יום עובריים (E) 9.5. שיטה זו משתמשת laparotomy לאפשר גישה קרניים הרחם, וצלחת במיוחד המאפשר לארח עוברי להיות שטוף מלוחים בזמן שהם צילמו והזריק. ניתוחים מוצלחים לעיתים לגרום רוב או את כל העוברים שורדים מוזרק לנקודת זמן שלאחר מכן עניין (embryonically או לאחר הלידה). העקרונות המתואר כאן ניתן להשתמש בשינויים קלים לביצוע זריקות לתוך הנוזל amnionic של E8.5 עוברי (ובכך לאפשר זיהום לאורך היקף האחורי הקדמי של הצינור העצבי, דבר לא סגור עדיין), או למערכת חדרית של המוח ב E10.5/11.5. יתרה מזאת, אמצע neurogenic הגילאים (~ E13.5), הדמיה אולטרה סאונד ניתן להשתמש הזרקה ישירה לתוך אזורי מוח ספציפיים עבור זיהום ויראלי או השתלת תאים. השימוש הדמיה אולטרסאונד כדי מדריך זריקות ברחם אצל עכברים היא טכניקה רבת עוצמה המאפשר מניפולציה מולקולרית תאית של עוברי עכברים בדרכים שאחרת היה קשה במיוחד אם לא בלתי אפשרי.

בניתוח הישרדות ברחם אצל עכברים מאפשר מניפולציה המולקולרי של ביטוי גנים במהלך ההתפתחות. כאן אנו מתארים את השימוש בתדר גבוה הדמיה אולטרסאונד כדי להנחות את הזריקה של וקטורים retroviral לתוך המוח העכבר ביום עובריים (E) 9.5.

אולטרסאונד מונחה Microinjection לתוך forebrain העכבר בתוך הרחם ב E9.5

ניתוח להישרדות ברחם (In utero survival surgery) בעכברים מאפשר מניפולציה מולקולרית של ביטוי גנים במהלך ההתפתחות. עם זאת, מכיוון שדופן הרחם אטומה...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להחדיר וקטורים רטרו-ויראליים למוח הקדמי של עכבר לפני תחילת הנוירוגנזה באזור זה. שיטה זו תאפשר טרנסדוקציה של תאי אזור הנבטות עם גנים רצויים. ניתן להזריק וקטורים ויראליים אחרים או תאים באמצעות שיטה זו.פעולה זו מבוצעת תחילה על ידי ביצוע לפרוטומיה בעכבר בהריון תחת הרדמה, דבר המאפשר גישה לעוברים. השלב השני של הפרוצדורה הוא הנחת העכבר ההרה על במת ההזרקה תחת המתמר האולטרסאונד. לאחר מכן, יש למקם את העוברים על הפלטה לצורך ההזרקה.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא שימוש בתמונת אולטרסאונד בזמן אמת כדי להנחות את מחט המיקרו-הזרקה לאתר היעד של ההזרקה. עוברים מוזרקים בסדרה עד להשלמת המספר הרצוי. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא הוצאת העכבר ממכשיר ההזרקה וסגירת החתכים בדופן הגוף, בשריר ובסין.לאחר מכן מאפשרים לבעל החיים להתאושש. לבסוף, ניתן לקבל תוצאות המראות את המיקום והמאפיינים הפנוטיפיים של תאים נגועים באמצעות זיהוי של גן דגל (reporter gene) נתון בחתכי רקמה וסימון באמצעות סממנים ספציפיים לסוג התא. שלום, אני Taryn Pier Fois מהמעבדה של Nick Guyano בתוכנית הנוירו-דגנרציה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס.היום נדגים לכם הליך המשתמש בדימוי אולטרסאונד כדי להנחות מיקרו-הזרקה של וקטורים רטרו-ויראליים למוח העובר של עכבר ביוםו Embryonic day 9.5. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את ההשפעה של מניפולציה של ביטוי גנים במהלך התפתחות המוח על התנהגות תאי גזע ותאי פרוגניטורים עצביים ועל הגדרת סוג התא. אז בואו נתחיל.אם ההזרקות אמורות להכיל וקטורים ויראליים מהונדסים, יש לבצע את הפרוצדורה בתוך תא בטיחות ביולוגית ברמה 2. הנח עכברה הרייה מורדמת על גבה. השתמש במספריים כירורגיים עדינים כדי לבצע חתך אורכי באורך של one inch דרך העור בקו האמצע.גזרו את רקמת החיבור הנמצאת בין העור לשריר המקיף את החתך. לאחר מכן, בצעו חתך קצר מעט יותר דרך שריר הבטן בעזרת פינצטה. משכו בעדינות החוצה את קרני הרחם.רשמו את מספר העוברים בכל צד. העבירו את החיה לבמת ההזרקה העשויה פלקסיגלס. כדי להגן על העוברים.החזירו את רוב קרני הרחם אל תוך בעל החיים, והשאירו חשופים רק שני עוברים סמוכים. השתמשו בצלחת פטרי בקוטר 10 סנטימטרים עם שני חורי דבקי-לחישה קטנים וחור מרכזי בקוטר שני סנטימטרים, שנאטם באמצעות פיסת ממברנת scholastic כדי לשמור על לחות העוברים. השתמשו בצבת שנדחפת מעט דרך ממברנת ה-scholastic.הנמיקו את הצלחת מעל האם. תוך כדי הנמקת הצלחת, אחזו ברקמת הרחם שבין שני העוברים הנבחרים ומשכו אותם בעדינות דרך הממברנה כאשר הצלחת מושבצת.הקבעו אותו באמצעות שני דבבקי לחץ דרך החורים הקטנים אל תוך השעווה. מלאו את הצלחת ב-1 XPBS בטמפרטורה של 37 degrees Celsius כדי לשמור על העוברים לחים. כוונו את העוברים במקביל לאורכה של האם.הנח את שלב ההזרקה תחת מתמר האולטרסאונד. הורד את המתמר למרחק של כשני עד שלושה מילימטרים מעל העוברים. כדי לקבל תמונות אולטרסאונד ברורות, חיוני שראש המתמר לא יפגע בעוברים בזמן שהוא נעים קדימה ואחורה.לצורך איסוף תמונות, חברו את המחט למיקרו-מזרק בנפח 25 microliter המותקן במשאבת הזרקה ושאיבה ידנית. מקמו מחט מיקרו-הזרקה משוחזת ובעלת חתך אלכסוני במחזיק פיפטה. הפעילו לחץ קל על מזרק בנפח 10 cc מלא בשמן מינרלי בחלק העליון של ברז המעצור כדי לשטוף שמן לתוך הצינוריות, למחזיק מחט המיקרו-הזרקה ולמחט, ושאבו שמן אל תוך המיקרו-מזרק.יש לוודא שאינן נוצרות בועות אוויר. יש לשאוב בועת אוויר באורך של מילימטר אחד עד שניים לתוך המחט. כדי לשמור על הפרדה בין השמן המינרלי לנגיף, השתמש במשאבת השאיבה כדי לטעון בזהירות את המחט בתמיסת הנגיף.שאבו את התמיסה בצורה חלקה ואיטית, והקפידו להימנע מסתימות. מקמו את המחט הטעונה במיקום המיקרו-מניפולטור באזור ההזרקה, תוך הקפדה לא לשבור אותה על העובריים או על מתמר האולטרסאונד.העבירו את מחט ההזרקה למיקום הנמצא במרחק של מילימטר אחד עד שניים מדופן הרחם. בזווית של כ-45 מעלות, הדמיות המופקות על ידי מתמר האולטרסאונד מוצגות על גבי מסך וידאו. קצה המחט נראה כנקודה הבהירה ביותר על המסך.יש לוודא שכיוון התנודה של הגשושית מקביל לאורך המחט. באמצעות תמונת האולטרסאונד במסך הווידאו, מקמו את העובר כך שהאזור המטרה, במקרה זה ventricle של המוח הרביעי, יהיה נראה בבירור ונגיש למחט. יישרו את אזור המטרה במוח עם כיוון התקדמות המחט.השתמשו במיקרו-מניפולטור כדי להביא את קצה המחט למגע עם דופן הרחם. דחפו את המחט קדימה במהירות כדי לחדור לרקמת הרחם. ייתכן שיהיה צורך במספר דחיפות דומות כדי לחדור את שק השית (amniotic sac) ולהזריק לעוברי את הנפח המתאים של הווירוס.בהזרקה מוצלחת, ערפל של חלקיקים חודר לבטנה והחלל הבטני עשוי להתרחב מעט; נסוג עם המחט כחמישה מילימטרים לפני הזרקת העובר הבא. לאחר שהוזרקו שני העוברים, השתמש בפינצטה כדי למשוך את שני העוברים הבאים דרך הקרום השלייתי והחזר את העוברים המוזרקים אל תוך הבטן. ברגע שהמספר הרצוי של עוברים הוזרק והודף בחזרה אל חלל הבטן, העבר את העכבר ממעמדת ההזרקה אל פד סופג.כדי לסגור את החתך, אפשרו לבעל החיים להתאושש בכלוב נקי ומחומם. צילום מסך זה של תמונת אולטרסאונד בזמן אמת מעובר עכבר ביום הריון E 9.5 מציג מאפיינים אנטומיים שונים שניתן להשתמש בהם להנחיית הזרקות. כאן V מייצג את הפרונטקל (ventricle) בעוד ש-amniotic sac הוא שק השה ו-uw הוא דופן הרחם.מחט ההזרקה היא הנקודה הבהירה מימין בתמונה. בתמונה זו, עובר שהוזרק לו נגיף המבטא A-P-L-A-P מראה תאים נגועים בנגיף החיוביים ל-PLAP בתוך המוח המתפתח. מספר שבועות לאחר ההדבקה, ביטוי חלבון הדגל (reporter) מאפשר בחינה של מורפולוגיית התאים ומיקומם, וכן ניתוח קלונאלי.הרגע הדגמנו כיצד לבצע הזרקה זעירה של וקטור רטרו-ויראלי לעוברים של עכברים ברחם תחת הנחיית אולטרסאונד ביום עוברי 9.5. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לפעול במהירות, שכן סיכויי ההישרדות גבוהים יותר ככל שזמן המניפולציה בעכבר במהלך הניתוח קצר יותר. כמו כן, חשוב לזכור לנקוט משנה זהירות בעת שימוש בחומרים המהווים סיכון ביולוגי, כגון וקטורים רטרו-ויראליים.זהו זה. תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.

ultrasound-guided-microinjection-into-mouse-forebrain-utero-at

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בשנת הזרקה תוך חדרי ברחם ו electroporation E15 של עוברי עכברים

העברת גן שיטה למוח עכבר בפיתוח מתואר באמצעות שיטה ניתוחית ייחודית צורה מיוחדת של אלקטרודות. זו טכניקה ייחודית זו מאפשרת transfection של DNA פלסמיד temporally מרחבית, אשר יסייעו מדעני מוח רבים בחקר התפתחות המוח.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

שליטה על ההתפשטות של תאי גזע הסומטיים היא גורם מרכזי פוגעות המחקר והשימוש בטיפול שלהם. כאן אנו מתארים מערכת באופן זמני להרחבת שליטה עצבית גזע תאים במהלך ההתפתחות ובגרות, אשר ניתן להשתמש כדי להגדיל את מספר הנוירונים שנוצרו במוח העכבר.

התרחבות של תאי גזע עצביים עובריים ומבוגרים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation או הזרקת Stereotaxic ויראלי

מקור: Mangold, K., H el. al., מיקוד צלחת עצבית של עכברים על ידי הזרקת ננו ברחם (NEPTUNE) ביום העוברי 7.5. J. Vis. Exp. (2022)סרטון זה מדגים את שיטת הזרקת הננו ברחם למיקוד צלחת עצבית במודל עכבר עוברי. תמיסה לנטי-ויראלית בעלת טיטר גבוה מוזרקת לחלל מי השפיר, שם היא משתלבת בתאי צלחת עצבית, ומאפשרת מניפולציה גנטית יציבה למחקר נוירו-התפתחותי ויישומים טיפוליים.

מניפולציה של תאי צלחת עצבית באמצעות ננו-הזרקה ברחם במודל עכבר עוברי

למרות החשיבות הפונקציונלית ורפואית של...

מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

פרוטוקול זה מספק הוראות תצפית ישירה של נוירונים קליפת המוח נודדת. ב electroporation ברחם , תרבות פרוסות organotypic, הדמיה confocal זמן לשגות משולבים ישירות באופן דינמי ללמוד את ההשפעות של overexpression או downregulation של גנים של עניין נודדים נודדות ולנתח את ההבחנה שלהם במהלך הפיתוח.

זמן לשגות Confocal הדמיה של נוירונים נודדים תרבות פרוסה Organotypic של המוח עכבר עובריים באמצעות<em&gt; באוטרו</em&gt; Electroporation

השילוב של מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים התמרה חושית ברחם היא גישה חזקה ללמוד שינויים מורפולוגיים במוצא ultrastructure בסדר של מערכת העצבים במהלך הפיתוח. שיטה משולבת זו מאפשרת תובנות שינויים בפרטים מבניים שבבסיס והנוירולוגיה הפלסטית ביחס ייצוגן הטופוגרפי.

הערכה של הפרמטרים והנוירולוגיה הפלסטית Ultrastructural לאחר התמרה חושית עם רחם של פיתוח העכבר המוח ואת חוט השדרה

פרוטוקול זה מדגים שיטה פשוטה וחזקה לחקר גדילת אקסון באתרו ודינמיקת חרוט גדילה. הוא מתאר כיצד להכין פרוסות מוח חריפות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית ex vivo ומספק צינור ניתוח ידידותי למשתמש.

באתרו הדמיה של גדילה וצמיחה של דינמיקת חרוט אקסון בתרביות פרוסות מוח עובריות אקס-ויוו חריפות

בפרוטוקול זה אנו מתארים כיצד להזריק לעכבר את חלל מי השפיר ב-E7.5 עם לנטי-וירוס, מה שמוביל להתמרה אחידה של כל הצלחת העצבית, עם השפעה מזיקה מינימלית על ההישרדות או ההתפתחות העוברית.

מיקוד צלחת עצבית מורין על ידי ננו-הזרקת רחם (NEPTUNE) ביום עוברי 7.5

במהלך התפתחות קליפת המוח, נוירונים ותאי גלייה מקורם באזור החדר המצפה את החדר ונודדים לעבר פני המוח. גנים רבים מעורבים בתהליך זה. פרוטוקול זה מציג את הטכניקה לדימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה.

דימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה בפרוסות מוח עובריות של עכבר

למדו הזרקת מיקרו מונחית אולטרסאונד לתוך ה-Forebrain של עכברים עובריים ביום עוברי 9.5. שיטה זו מאפשרת מניפולציה של ביטוי גנים בתאי גרעין עצביים לפני תחילת הנוירוגנזה.

אולטרסאונד מונחה Microinjection לתוך forebrain העכבר בתוך הרחם ב E9.5

גלה סרטונים נוספים