Name: Dechorionation עוברים Medaka והשתלות Cell עבור דור של מפלצות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-22T17:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: למד את שיטת ההשתלות התאית בעוברי מדקה לחקירת אוטונומיה גנית. הטכניקה כוללת דהכוריונציה, סימון תאים בפלואורסצנטיות והשתלת תאים תורמים לעוברים מקבלים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי מענק מטעם MRC ל מ FS.

1. התפתחות העוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הם הניחו, ביצים מקובצים בגלל חוטים מצורף על סיסית. כדי לאפשר לפתח עוברים בדרך כלל, יש צורך להפריד ביצים. סבך החוטים וחותכים מצורף ידי החזקת חוטים התקשרות עם שני מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר unclustering, ביצים מופרדות צואה ואצות והועברו בינוני העובר טרי בצפיפות מירבית של 40 ביצים לכל צלחת פטרי 6cm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים Medaka לפתח מעט איטי יותר מאשר דג הזברה ב 27 ° C. העיתוי של הבקיעה שונה בין שני המינים; עוברים medaka בוקעות מן סיסית 7 ימים ומיד מתחילים לשחות ולאכול, בעוד עוברי דג הזברה בוקעות 2 ימים אך מתחילים לשחות ולאכול 5-6 ימים. פיתוח medaka מבוים פי 4 הזמני של Iwamatsu. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפיתוח של עוברים medaka ניתן להתאים בנוחות תוכניות ניסיוניות ידי בחירת הטמפרטורה המתאימה. פיתוח של עוברים medaka ניתן עצרה 4 ° C בהתפתחות המוקדמת. אחרי שלב 24 כאשר הלב פועם מתחיל, פיתוח יכול להיות האטה באמצעות טמפרטורת מינימום של 18 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיתוי הופעתו של איברים / רקמות היא מעט שונה medaka לעומת דג הזברה, כלומר somitogenesis medaka מתרחשת לאחר תחילת התפתחות המוח ואילו somitegenesis דג הזברה מקדים להתפתחות המוח. </li></ol> 2. הסרת סיסית סיסית של medaka מורכב משתי שכבות מגן בשכבה הפנימית קשה משטח רך החיצונית. לכן, טיפול שני שלבים פרוטאז העסקת pronase ואת האנזים הבקיעה יש צורך להסיר סיסית. Dechorionated פעם, עוברים יש לשמור 1X BSS. חצי סטרילי תנאי ישפר את תרבות מוצלחת של העוברים dechorionated, במיוחד כאשר תקופות ארוכות יותר של התבוננות נדרשים. פתרונות אלה כוללים שימוש סטרילי (למשל עיקור 1X BSS עם אנטיביוטיקה) וכלים מעוקרים אתנול עם 70% ואחריו שטיפה 1X BSS. כפי dechorionated עוברים medaka הם רך ושברירי יותר עוברי דג הזברה dechorionated, משנה זהירות יש לנקוט כדי להבטיח שהם לא פנה אוויר או בועות פיפטה, כמו זה יגרום קריסה מיידית. כדי להבטיח פגיעה מזערית עוברים, פעורת פה זכוכית מלוטשת עם משאבת חום פיפטה פיפטה יש להשתמש בעוברים העברת לולאה השיער צריך להיות מנוצל כדי להתמצא עוברים לצורך השגחה. Non-חסיד צלחות פטרי צריך לשמש כדי למנוע מן העוברים הצמדת משטחים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני dechorionation זה יש לבדוק כי ביצים שהופרדו מספיק וניקה-up. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאז הן pronase ואנזימים הבקיעה הם proteinases, הם צריכים להיות כל הזמן על הקרח לצמצם את החשיפה של עוברים אלה אנזימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ביצים נייר זכוכית (p2000 בגודל חצץ, עמיד למים) להציב מכסה של צלחת פטרי 9cm. הסר בינוני עודף אלא להבטיח נפח מספיק נשאר כדי למנוע ייבוש של עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלגל בעדינות עוברים כ 45-60 שניות כדי להסיר כמה שערות המשטח החיצוני קלות ציון את פני השטח של סיסית (איור 1). העברת עוברים בחזרה צלחת פטרי המקורית ולבחון. כאשר עוברים מתגלגל על ​​נייר זכוכית להשתמש באצבע, הפעלת לחץ מינימלי ושמירה במקביל אצבע על פני השטח של נייר חול. אל רול יותר עוברים 5-7 בבת אחת. זהירות זה יהיה למזער את הסיכון של ריסוק עוברים מתחת לזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף בינוני ביצה בצלחת עם pronase 20mg/ml ועוברים דגירה של 40-60 דקות על 27 ° C. ודא עוברים מכוסים דיים על ידי pronase ואת מכסה קיים על המנה. Pronase שאינם בשימוש יש לשמור על הקרח במהלך שלב זה כדי למזער עצמית העיכול ניתן לעשות שימוש חוזר עד פעילות אבוד (כ 1-2 שבועות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחזור pronase לשימוש חוזר ועוברים לשטוף 5X במדיום העובר כדי להסיר עקבות של pronase כמו זה יהיה להשבית את האנזים הבקיעה להתווסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני העובר ועוברים לכסות עם האנזים הבקיעה, הבטחת עוברים לשבת כמו monolayer בצלחת. אם יש ביצים לשבת על גבי אחד לשני בצלחת, אלה שבתחתית יהיה מעוך כמו סיסית נמס. שמור אנזים הבקיעה בשימוש על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור העוברים על 27 מעלות צלזיוס, לאחר 15 דקות לבדוק מעת לעת את התקדמות הבקיעה באמצעות stereomicroscope. זה יהיה לראות כי מספר הירח מכתש כמו חורים מתחילים להופיע בשכבה הפנימית של סיסית, אשר בקרוב מתמוסס הבאה זה משאיר השכבה החיצונית הרכה של סיסית להסיר בקלות manuallי ' כל התהליך של הבקיעה עלול לקחת 15-60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע עוברי לצאת מן סיסית, העברת העוברים על צלחת פטרי המכילה 1X BSS. ודא שלא להעביר אנזים הבקיעה את BSS 1X ידי נגיעה קצה פיפטה על פני השטח של BSS המאפשר העוברים בעדינות לרדד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שכל העוברים מועברים אנזים הבקיעה, לבצע העברה הסופי מאכל אחר טריים של 1X BSS. זה מבטיח עוברי לא נחשפים כל שאריות האנזים הבקיעה, כמו זה יהיה נזק עוברי חשוף. לאחר בצלחת זה סופי כל עוברי עדיין בעל השכבה החיצונית של סיסית יכול להיות משוחרר באופן ידני באמצעות עיקור מיקרו מלקחיים תחת stereomicroscope. אם עוברים צריך להיות מפותח dechorionation הבאים, פניצילין / סטרפטומיצין יש להוסיף את BSS כדי למנוע התפתחות חיידקים. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. השוואה בין עוברים התגלגל פרשו במהלך dechorionation. שים לב כיצד עוברים התגלגל B פאנל העדר שערות לראות על עוברי פרש בלוח א 3. עוברים dechorionated הרכבה הטבעה agarose שימושית עבור תקופות ארוכות יותר של הדמיה (למשל זמן לשגות הדמיה) עבור עוברים לחיות כמו גם תצפיות מפורטות של עוברים קבוע. במהלך gastrulation ו organogenesis מוקדם (שלב 14 שלב 28), עוברים medaka התערוכה גלים של תנועות התכווצות קצבית ברחבי periderm, שכבת רקמה המכסה גם את העובר המתפתח ואת חלמון 5. עוברים מטופלים עם 3.5mm 1-heptanol להפסיק תנועות התכווצות 6. כדי לעצור את התנועה של העוברים לאחר שלב 28 (64hpf), עוברים הם מורדמים ידי הוספת טיפות Tricaine mesilate (TMS) לפני ההטבעה. TMS תתווסף גם agarose (רק להוסיף כמות מזערית, מינון זה צריך להיות מותאם, כ דילול 01:25). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי כמות קטנה של 3% נמוך הטמפרטורה gelling agarose (ב 1X BSS) על ידי חימום ל 37 ° C ולשמור על בטמפרטורה הזאת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלבים הבאים צריכים להתבצע במהירות על מנת להבטיח כי agarose לא לפני orientating לחזק את העובר. שימוש פעורת פה פיפטה זכוכית מותכת העברת agarose מספיק כדי למלא את המכסה של דיכאון צינור Eppendorf. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה חד העובר dechorionated לדיכאון את הכובע מזעור נושאת על BSS עם העובר. מיד ספיגת agarose ואת העובר מדיכאון את הפקק להעביר קאמרית תרבות צלחת פטרי. צלחת פטרי 3.5cm עם חלון זכוכית בתחתית משמש. עבור דימות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה, הם עוברים על הבטן הגוף חוקיים והניח קרוב זכוכית המכסה. עבור דימות באמצעות מיקרוסקופ זקוף, עובי של agarose ממוזער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את צלחת פטרי 3.5cm לתוך צלחת 14cm קוטר פטרי המכילה קרח ומים (מים מלאים עד עומק סך בערך 1 / 3 של צלחת גדולה). בעוד מחזיק את החדר בחוזקה על החלק התחתון של צלחת פטרי 14cm, להשתמש לולאה השיער בעדינות כדי להתמצא העובר כרצונכם ב agarose מותכת והחזק את העובר עד agarose מבצרת בעדינות על ידי העלאת והורדת את צלחת קטנה יותר למיקום המקורי שלה במים קרים כקרח. </li></ol> 4. השתלת תאים בעוברים medaka מטרת הליך זה היא לקבוע האם הגן של עניין מעשי התא באופן עצמאי (בתוך תא) או אי התא באופן עצמאי (בין תאים). תאים התורם יכול להיות מתויג עם צבע נותב כגון rhodamine-dextran לפני השתלה (כפי שמתואר "Microinjection עוברים Medaka" הפרוטוקול הנלווה יופיטר) או זן מהונדס עם ביטוי של GFP עשוי להיות מנוצל, המאפשר הערכה השתלה. שילוב של שתי הטכניקות תיוג לעיתים קרובות כדאי להתגבר אוטומטי הקרינה שניתן נתקל. במשך זמן לשגות המחקרים הבאים השתלה, ביטוי של GFP הוא שימושי במיוחד. השתמש פיפטה פעורת פה זכוכית עם משאבה פיפטה בכל הליך זה לעקר את כל הכלים (כולל שקופיות) מראש EtOH עם 70% ואחריה לשטוף היטב סטרילי 1X BSS. עוברים נמען מפותחים בדרך כלל סביב 12 הבמה כמו זו מאפשרת הפליה של הקטבים הגחון ועל הגב בעת ביצוע ההשתלה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל dechorionating עוברים 1.5 שעות לפני השתלת הזרקת מנגנון ההתקנה במהלך incubations האנזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום מיקרוסקופ חלל להחליק לתוך צלחת פטרי בקוטר 9cm. </li> הוספת כמות קטנה של 3% methylcellulose למרכז השקופית חלל באמצעות קצה פיפטה סטרילית להפיץ דק. <li style=";text-align:right;direction:rtl"> Methylcellulose יבש למשך כ 1-2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 350μl של סטרילית 1X BSS למלא דיכאון שקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה חד העובר התורם עד ארבעה עוברי הנמען לשקופית באמצעות פיפטה מזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים להתמצא באמצעות לולאה השיער כך blastoderm העובר פונה מעלה. עוברים ניתן נשען אחד נגד השני ליציבות עלייה נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס בעדינות את המחט מיקרו לתוך blastoderm התורם לאט ספיגת 10-20 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס בעדינות מחט לאזור הנדרש blastoderm העובר מקבל ולגרש את התאים לאט. בזהירות רבה יש לנקוט בעת הוספת תאים לתוך blastoderm הנמען כדי לא לשבש את התא שק חלמון גבול כמו זה יהיה לגרום למוות של העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים מעוקרים 1X BSS לתוך צלחת פטרי. בזהירות לצקת את BSS לתוך צלחת קרוב לצד המנה ככל האפשר, כדי לא לשבש את העוברים. לא לשפוך את BSS ישירות על העוברים ולהוסיף BSS מספיק כזה שקופיות עוברים שקועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100μl של סטרפטומיצין / פניצילין כדי בצלחת ומכסים. בזהירות כדי להעביר צלחת 27 ° C בחממה כדי לאפשר התפתחות תקינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים ניתן להבחין מדי פעם לפי הצורך. בעת השימוש השתלת לבצע ולהשיג-of-פונקציה ו / או להציל ניסויים פנוטיפ, כמה שינויים מורפולוגיים נצפתה יכול להיות בגלל ההשפעות של השתלה. כך מספר השתלות נחוצים. לאחר 2-3 ימים, melanophores צריך להיות נוכח על שק החלמון, הראש, העיניים המטען. אם נוכח העוברים המושתלים על כך מוצלח הכימרה יש ככל הנראה יוצרו (איור 3). </li></ol> אם התורם הצורך, גנוטיפ העובר (ים) על ידי העברת צינור PCR (ים) המכיל 25μl של 20mg/ml proteinase ק לדגור על 55 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות ואחריו 10 דקות 94 ° C ו לבצע PCR. 5. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. בעמדה דוגמה של העובר agarose-מוטבע. Anterior מוצג מימין ולהציג היא הגב. לוח ב ': לתאי אנדותל ניתן לראות משני צדי הגוף העובר מסומנים בעזרת ה-GFP מונע על ידי האמרגן fli. <img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. תמונות של הפוסט השתלת עוברים. תמונה מראה העובר התורם והמקבל מיד לאחר ההשתלה. העובר התורם מוצג בצד ימין עם blastoderm אדום לחלוטין (חץ). העובר מקבל מוצג משמאל מזוהה בקלות על ידי המסה קטנה של התאים המושתלים אדום גלוי blastoderm (ראש חץ). תמונה ב 'מציגה שני עוברי מקבל כ -7 שעות לאחר ההשתלה (מודגרות ב 27 ° C). שימו לב התאים המושתלים היגרו מהאתר של השתלת מפוזרים כיום ברחבי blastoderm (חיצים). תמונה ג'מציגה העובר מקבל את st.29 (כ 74hpf). שים לב פיגמנטציה בעיניים את הנוכחות של melanophores באזור תא המטען המוח (חיצים). Rhodamine שכותרתו התאים ניתן לראות להיות מיישבים רבים של מבנים עובריים המציין את ייצור מוצלח של תעתוע.

<ol><li>Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+genome-wide+screen+for+mutations+affecting+organogenesis+in+Medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes.</a> Mech Dev. 121, 647-658 (2004).</li>
<li>Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medaka+and+zebrafish%2C+an+evolutionary+twin+study%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study.</a> Mech Dev. 121, 629-6237 (2004).</li>
<li>Hirose, Y., Varga, Z. M., Kondoh, H., Furutani-Seiki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+lineage+and+regionalization+of+cell+populations+during+Medaka+neurulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Single cell lineage and regionalization of cell populations during Medaka neurulation.</a> Development. 131, 2553-2563 (2004).</li>
<li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+normal+development+in+the+medaka+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Zool+Sci%22%5BJournal%5D)">Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes.</a> Zool Sci. 11, 825-839 (1994).</li>
<li>Cope, J., Fluck, R., Nicklas, L., Plumhoff, L. A., Sincock, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stellate+layer+and+rhythmic+contractions+of+the+Oryzias+latipes+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">The stellate layer and rhythmic contractions of the Oryzias latipes embryo.</a> J Exp Zool. 254, 270-275 (1990).</li>
<li>Brend, T., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Whole+Mount+High-Resolution+Double+Fluorescent+In+Situ+Hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בסרטון הזה אנחנו מדגימים איך dechorionate ולבצע transplanataion על תא עוברי medaka. זוהי טכניקה רבת עוצמה כדי לייצר עוברים chimeric לחקר תפקוד הגנים / חלבון במהלך הפיתוח, כמו גם הבהרת את האוטונומיה של הגן / החלבון המדובר. Medaka הם מערכת מודל שימושי עבור החולייתנים טכניקה זו עקב מפות גורל מבוססת היטב ההלוואות שלהם שקיפות אותם היטב בתחום ההדמיה בזמן אמת vivo. השתלה ניתן לשלב עם microinjection (כפי שמתואר &quot;Microinjection של Medaka עוברים&quot; הפרוטוקול הנלווה יופיטר) כך את התנהגותו של התאים המושתלים ניתן להבחין בקלות.

<table><tbody><tr><td>מדיום עוברי</td><td>ריאגנט</td><td>הוכן במעבדה</td><td>N/A</td><td>200ml תמיסת סטוק 50X, 1ml 1%methyleneblue ב-H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O/10 ליטר מים מזוקקים (RO) (תמיסת סטוק 50X: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 2.4g, MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 4.0g לליטר מים מזוקקים (RO).)</td></tr><tr><td>פינצטה למיקרו-דיסקציה</td><td>כלים</td><td>55 INOX A.DUMONT&amp;amp;FILS</td><td>N/A</td><td>קצוות עדינים וחדים מאוד להסרת הכוריון.</td></tr><tr><td>נייר זכוכית עדין חסין מים - גרעיניות p2000</td><td>כלים</td><td>Hermes Abrasives Ltd.</td><td>N/A</td><td>גרעיניות עדינות מאוד לגלילה/ניקוי עובריים עם כוריון.</td></tr><tr><td>3% methylcellulose</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma</td><td>M 0512</td><td>צמיגות גבוהה להחזקת עובריים במקוםם במהלך השתלה.</td></tr><tr><td>1X BSS</td><td>ריאגנט</td><td>הוכן במעבדה</td><td>N/A</td><td>20XBSS: 130g NaCl, 8g KCl, 4g MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 4g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, ו-10mg Phenol Red ב-1L מים מסוג MilliQ ואוטוקלאב; 500mM Hepes במים מסוג MilliQ שעברו אוטוקלאב. הוסף 25ml 20XBSS ו-15ml 500ml Hepes pH7.0, השלם עד 500ml ובצע סינון סטרילי לפני השימוש.</td></tr><tr><td>פניצילין-סטRepartitionפטומיצין</td><td>ריאגנט</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>מוסף ל-BSS בעת אינקובציה של עובריים לאחר הסרת הכוריון.</td></tr><tr><td>פרונאז (Pronase)</td><td>ריאגנט</td><td>Calbiochem</td><td>53702</td><td>להסרת הכוריון.</td></tr><tr><td>אנזים בקיעה (Hatching enzyme)</td><td>ריאגנט</td><td>הוכן במעבדה</td><td>N/A</td><td>להסרת הכוריון.</td></tr><tr><td>Tricaine mesilate (TMS)</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td>400mg tricaine ב-97.9ml מים מזוקקים ו-2.1ml 1M Tris, pH מכוון ל-7; 4.2ml מתמיסה זו ב-100ml מים נקיים של מיכל.</td></tr><tr><td>3% אגרוז עם טמפרטורת ג'לטינציה נמוכה במיוחד</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma</td><td>A-2576</td><td>סוג IX-A. משמש במהלך הטמעה של עובריים לתצפית.</td></tr><tr><td>תא תרבית של צלחת פטרי</td><td>כלי</td><td>Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.</td><td>11-004-008</td><td>צלחת עם בסיס זכוכית Iwaki בגודל 35mm עם חלון של 12mm. משמש במהלך הטמעה של עובריים לתצפית.</td></tr><tr><td>מיקרו-מניפולטור</td><td>ציוד</td><td>Narishige</td><td>N/A</td><td>דגם MN151. להוצאה והחדרה של תאים במהלך השתלה.</td></tr><tr><td>קפילריות זכוכית בורוסיליקטית</td><td>כלי</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC100-10T</td><td>להכנת מחטי השתלה.</td></tr><tr><td>מכשיר למתיחת מיקרו-פיפטות (Flaming/Brown)</td><td>ציוד</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model P-97</td><td>להכנת מחטי השתלה.</td></tr></tbody></table>

dechorionation עוברים medaka והשתלות cell עבור דור של מפלצות

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka הוא דג קטן ההטלה מים מתוקים המאפשר ניתוח הן גנטיות העוברית והיא אחת משלוש חוליות אורגניזמים מודל שבו הגנום כולו פנוטיפ מונחה מסכי מוטציה בוצעו 1. החפיפה סטייה תפקודית של גנים הקשורים בין medaka ו דג הזברה מאפשר זיהוי של פנוטיפים רומן כי הם ניתנים לזיהוי ב זן יחיד 2, ובכך medaka ו דג הזברה משלימות לניתוח גנטי של פונקציות הגנום החולייתנים. מניפולציה של עוברים medaka, כגון dechorionation, עוברים הרכבה עבור הדמיה השתלת תאים, הם הליכים מפתח לעבוד על שניהם medaka ו דג הזברה במעבדה. השתלת תאים בוחן אוטונומיה תא של מוטציות medaka. מפלצות נוצרות על ידי השתלת תאים מעוברים שכותרתו התורם לעוברי הנמען ללא תווית. תאים התורם ניתן להשתיל לאזורים מסוימים של עוברי הנמען מבוסס על גורל מפות 3 כך שיבוטים של התאים המושתלים יכולים להיות משולבים ברקמות של עניין במהלך הפיתוח. בשל סיסית הקשיח עוברים רך, מניפולציה של עוברים medaka מעורב יותר מאשר דג הזברה. בסרטון הזה, אנו מראים נהלים מפורטים לתפעל עוברים medaka.

בשל סיסית הקשיח עוברים רך, מניפולציה של עוברים medaka מעורב יותר מאשר דג הזברה. וידאו זה מציג צעד אחר צעד נהלים כיצד לתפעל עוברים medaka, כולל dechorionation, גובר agarose עבור הדמיה השתלת תאים לייצור מפלצות. נהלים אלה הם חיוניים כדי להשתמש medaka ו דג הזברה במעבדה כדי לנצל את מלוא היתרונות של התכונות המשלימות שלהם לנתיחה הגנטי של פונקציות הגנום החולייתנים.

Dechorionation עוברים Medaka והשתלות Cell עבור דור של מפלצות

מדקה (Medaka) הוא דג מים מתוקים קטן המטיל ביצים, המאפשר ניתוחים גנטיים ואמבריולוגיים כאחד, והוא אחד משלושת אורגניזמי המודל של חולייתנים ב...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק שיבוטים (clones) בעובר במטרה לבחון את האוטונומיה של גן או חלבון מסוים. דבר זה מושג על ידי סימון של עוברים תורמים באמצעות Rod Domine dextran באמצעות מיקרו-הזרקה בשלב התא הבודד, כפי שמוצג בסרטון הנלווה לזה, microinjection of Maka embryos. השלב השני של הפרוצדורה הוא פיתוח של העוברים התורמים והמקבלים לשלב הנכון.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא ציפוי של עוברי התורם והמקבל. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא השתלת תאים מעוברי התורם המסומנים לעוברי המקבל. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות על ידי ניתוח ההפצה, השגשוג וההבחנה של שיבטוני התאים המושתלים, באמצעות זיהוי התאים המושתלים לפי הפלואורסצנציה שלהם או לפי סמני שושלת.שלום, אני שון ברזינסקי מהמעבדה של ד"ר מקוטו פקי במחלקה לביולוגיה וביוכימיה באוניברסיטת באת'. אני שייך גם למעבדת זקי. היום נראה לכם הליך להשתתלת תאים בעוברי דגים עיוורים.אנו משתמשים בנוהל זה במעבדה שלנו כדי לבחון האם לגן או למוטציה הנחקרים יש תפקוד תאי או שאינו תלוי בתא (non-cell autonomous). אז בואו נתחיל. בעת ציפוי ביצי זבובים, השתמשו בתמיסות ובכלים סטריליים כדי לשפר את סיכויי ההצלחה של תרבית ותצפית לטווח ארוך.הניחו פיסת נייר זכוכית עמיד למים בדרגת חספוס P 2000 במכסה של צלחת פטרי לא-דביקה בקוטר תשעה סנטימטרים. השתמשו בפיפטה מסוג fire polished pasta בעלת פיה רחבה כדי להעביר עד 10 ביצים נקיות, מסומנות ובלתי מצומצמות (unclustered) מטרימה של מדיום ביצים אל נייר הזכוכית.הסיר את עודפי המצע, והשאר בצלחת כמות קטנה בלבד כדי למנוע מהביצים להתייבש. בעזרת קצה אצבע עם כפפה, גלגל בעדינות 10 ביצים בכל פעם על נייר השמיר למשך 45 עד 60 שניות. כדי להסיר את השערות מהשטח החיצוני ולשרוט את פני השטח של ה-Corian, הפעל לחץ מינימלי ושמור על קצה האצבע במקביל לנייר השמיר.העבירו את הביצים חזרה לכלי המקורי עם המצע. הסירו את המצע וכסו את הביצים בתמיסה של 20 milligrams per milliliter של prone. כסו את הכלי והדגירו בטמפרטורה של 27 degrees Celsius למשך 60 דקות.הקפידו להניח את הצלחת בזווית כך שהעוברים יהיו טבולים מספיק באנזים. כדי למזער את כמות האנזים הדרושה, השתמשו בפיפט העברה מפלסטיק כדי לאסוף את ה-pronase לשימוש חוזר והניחו אותו על קרח. שטפו את הביצים חמש פעמים במצע עוברים כדי להסיר את כל השאריות של ה-pronase, ובכך למנוע ממנו לעכל את אנזים הבקיעה.הוסיפו כמות מספקת של אנזים בקיעה (hatching enzyme) כדי לכסות את הביצים השטופות. ודאו שהביצים נשארות בשכבה אחת בתחתית הכלי כדי למנוע מעיכה בעוד ה-Corian מתמוסס. דגרו את הביצים בטמפרטורה של 27 degrees Celsius.יש לוודא שהצלחת מונחת בזווית כך שהעוברים יהיו טבולים מספיק באנזים. כדי למזער את כמות האנזים הנדרשת, יש לעקוב אחר ההתקדמות תחת מיקרוסקופ סטריאו; חורים דומים יופיעו בשכבה הפנימית של ה-Corian לפני שהיא תתמוסס לחלוטין. התהליך עשוי להימשך עד 60 דקות, בהתאם לפעילות האנזים.כאשר חלק קטן מה-chorion נמס, שאבו מיד את הביצה הבודדת בעזרת פיפטה כדי למנוע עיכול של העובר על ידי אנזים הבקיעה. העבירו לצלחת נקייה המכילה 1x BSS על ידי נגיעה עדינה של קצה הפיפטה בצלחת נקייה של 1x BSS והנחת הביצה להחליק החוצה, כדי למזער את העברת אנזים הבקיעה. השתמשו בפינצטה כדי להסיר את שארית ה-chorion לאחר שכל הביצים הועברו מאנזים הבקיעה.בצעו העברה סופית לצילחת חדשה המכילה BBSS בריכוז של פי 1. הוסיפו אנטיביוטיקה אם העוברים אמורים להגיע לשלב מאוחר יותר של התפתחות עוברית. לאחר הכנה לביצוע הליך זה, התחילו בהסרת הציפוי מעוברים בשלב 12 כ-1.5 שעות לפני ההשתלה. השתמשו בקצה של פפית כדי להוסיף כמות קטנה של 3% methyl cellulose למרכז תא במיקרוסקופ.החליקו צלחת פטרי בקוטר תשעה סנטימטרים. פרסו את הנוזל בשכבה דקה על פני השטח של השקע. ייבשו את המתיל-צלולוז למשך שתי דקות.מלאו את שקע השקופית ב-350 µL של BSS סטרילי בריכוז one times תחת מיקרוסקופ דיסקציה. השתמשו בפיפטה מזכוכית בעלת פיה רחבה שעברה חישול באש כדי להעביר לשקופית עובר תורם אחד ועד ארבעה עוברים מקבלים. השתמשו בלולאת שיער כדי להכווין את העוברים כך שה-blaster derm יפנה כלפי מעלה.השעינו את העוברים זה על זה ליציבות במידת הצורך. הכניסו בעדינות מיקרו-מחט לתוך תורם ה-blaster.Derm. שאבו באיטיות 10 עד 20 תאים.כעת הכניסו בעדינות את המחט לאזור הרלוונטי בעובר המקבל, בבלסטודרמה, והוציאו לאט את תאי התורם. אין להפריע לגבול שק התאים. מלאו בזהירות את פטריית המעבדה בכ-30 milliliters של BSS סטרילי בריכוז 1x כדי להטביל את העוברי ולשחרר אותם מהמתיל-צלולוז.שפכו את הנוזל לצד הכלי כדי לא להפריע לעוברים. הוסיפו 100 µL של penicillin streptomycin לכלי כדי להגיע לריכוז מקורב של 0.3%. כסו את הכלי. עקבו אחר העוברים באופן תקופתי לפי הצורך.עבור מחקרי הדמיה ממושכים יותר, כגון צילומי Time-lapse ותצפיות מפורטות, טמנו עוברים חיים מצופים באגרוז. הרדימו עוברים חיים כדי למנוע תנועה על ידי הוספת חומר הרדמה מתאים לשלב למדיום המכיל את העוברים. המסו כ-1 mL של 3% Low melting point agarose ב-1x BSS ושמרו אותו בטמפרטורה של 37 °C. במידת הצורך, הוסיפו כמות מתאימה של חומר הרדמה לאגרוז כדי למנוע התכווצויות. תוך עבודה מהירה למניעת התמצקות, השתמשו בפיפטת פסטור רחבה כדי למלא את השקע של מכסה מבחנה למיקרו-צנטריפוגה באגרוז.השתמשו בפיפטה בעלת פיה רחבה כדי להעביר עובר אחד מצופה ומוערמם אל תוך ה-aros במכסה. העבירו כמות מינימלית ככל האפשר של מצע יחד עם העובר. עדכנו מיד את ה-aros ואת העובר והעבירו אותם לתוך צלחת פטרי עם תחתית זכוכית בקוטר 3.5 centimeter.העבירו את הצלחת לצלחת בקוטר 14 סנטימטר הממולאת עד לשליש בתערובת של קרח ומים. הצמידו את הצלחת הקטנה בחוזקה לתחתית הצלחת הגדולה תחת מיקרוסקופ סטריאו למחקר (dissecting stereo microscope). השתמשו בלולאת שיער כדי לכוון במהירות את העובר למנח הרצוי.החזיקו אתו של העובר ללא תזוזה עד להתגבשות האגרו. כעת ניתן לצלם את העובר. תמונה A מציגה עובר תורם ועובר מקבל מיד לאחר הש transplantation.העובר התורם מוצג מימין עם blaster derm המסומן כולו באדום. העובר המקבל מוצג משמאל וניתן לזהותו בקלות לפי המסה הקטנה של תאים מושתלים בצבע אדום הנראים בתמונת ה-blaster derm. תמונה B מראה שני עוברים מקבלים כשלוש שבע שעות לאחר ההשתלה. שימו לב כי התאים המושתלים נדדו מאתר ההשתלה וכעת הם מפוזרים על פני ה-blaster.תמונה C של העור מראה עובר של מקבל בשלב 29. שימו לב לפיגמנטציה בעין ולהנחיה של mefor באזור הגו והמוח. ניתן לראות כי התאים המסומנים ב-rod domine מקולוניזציה של מבנים עובריים רבים, מה שמעיד על ייצור מוצלח של כימרה.הרגע הדגמנו כיצד להכין עוברים של דגי זברה ולבצע השתלת תאים בשלב עוברי מוקדם. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להשתיל את תאי התורם באזור הנכון של הבלסטולה של המקבל. פעולה זו תאפשר לתאי התורם להתבדל לסוג התאים הנכון.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

dechorionation-medaka-embryos-cell-transplantation-for-generation

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מדריך צעד אחר צעד כדי ליצור ממוקד עוברי דג הזברה chimeric על ידי השתלת בשלב blastula או gastrula.

יצירת עוברים דג הזברה chimeric על ידי השתלה

דג הזברה השתלת מאפשר שילוב של גנטיקה אמבריולוגיה ליצור מפלצות רקמות ספציפיות. וידאו זה מדגים gastrula מבוים השתלות תא אפשרו במעבדה שלנו כדי לחקור את התפקידים של אוכלוסיות astroglial ו רמזים הנחיות ספציפיות במהלך היווצרות השליכה בקידמתו.

ממוקד רקמות מפלצות עובריים: דג הזברה Gastrula השתלת תאים

אנו להדגים פרוטוקול ליצור עוברי דג הזברה chimeric להתנהגות הדמיה לחיות הסלולר במהלך embryogenesis.

השתלה של ה-GFP-לבטא בלסטומרים עבור הדמיה חיה של התפתחות המוח ואת רשתית עוברי דג הזברה chimeric

Medaka ו דג הזברה משלימות לניתוח גנטי של פונקציות הגנום החולייתנים. פרוטוקול זה מדגיש את נקודות המפתח עבור microinjection מוצלח לעוברי medaka, טכניקה חשובה לניתוח העוברית ואת גנטי באמצעות medaka ו דג הזברה במעבדה.

Microinjection עוברים Medaka לשימוש כמודל אורגניזם גנטי

הגישה לניתוח הגירה גורלו הסופי של העופות לפסגה תאים עצביים שליו, חומוס עוברים chimeric מתואר. שיטה זו היא טכניקה פשוטה וישירה לאיתור תאים עצביים לפסגה במהלך הגירה והבחנה שקשה אחרת להבחין בתוך העובר גוזל unmanipulated.

ניתוח של הגירה קרסט בידול עצבית ועל ידי חוצה מינים להשתלות

דגי מעבדה קטנים הפכו למודלים פופולריים לחקר עצמות על המנגנונים העומדים בבסיס הפרעות בעצמות אנושיות ולסינון תרופות מווסתות עצם. בדוח זה, אנו מתארים פרוטוקול להערכת ההשפעה של אלנדרונאט על תאי עצם בזחלי מדקה עם נגעים אוסטאופורוטיים.

ותרופות טיפול<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של אוסטאובלסטים-osteoclast אינטראקציות במודל אוסטאופורוזיס Medaka דגים

מעקב חיה של אבות רשתית WT בודדים רקע גנטי מובהק מאפשר הערכה של תרומת איתות שאינו אוטונומי התא במהלך הנוירוגנזה. כאן, שילוב של מציאת גן, דור הכימרה באמצעות השתלה העובר בתחום הדמית confocal זמן לשגות vivo נוצל למטרה זו.

In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג&#39;ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להגביר את ייצור כמירה ללא השימוש של ציוד חדש. שינוי כיוון פשוטה של העובר להזרקה ניתן להגדיל את מספר העוברים המיוצר, להפחית באופן פוטנציאלי את ציר הזמן germline שידור.

תא הטרנס-הפנימית המוני הזרקה של תאי גזע עובריים מוביל שיעור גבוה יותר של Chimerism

מטרה זו של פרוטוקול זה היא לייצר כימאריק axo, עם פלואידי forelimbs נגזר מרקמת תורם Cas9-מוטוניים באמצעות שיטות השתלת רקמות עובריים.

הדור של כימאריק אקאוללס עם הגפיים הספאוזהות באמצעות השתלה עובריים

מניפולציות עובריות כגון סילוק והשתלת תאים הן כלים חשובים לחקר ההתפתחות המוקדמת. פרוטוקול זה מתאר מכשיר השתלה פשוט ויעיל לביצוע מניפולציות אלה בעוברי דגי זברה.

מכשיר השתלה פשוט ויעיל לעוברי דגי זברה

למד את שיטת ההשתלות התאית בעוברי מדקה לחקירת אוטונומיה גנית. הטכניקה כוללת דהכוריונציה, סימון תאים בפלואורסצנטיות והשתלת תאים תורמים לעוברים מקבלים.

Dechorionation עוברים Medaka והשתלות Cell עבור דור של מפלצות

גלה סרטונים נוספים