Dechorionation עוברים Medaka והשתלות Cell עבור דור של מפלצות

בשל סיסית הקשיח עוברים רך, מניפולציה של עוברים medaka מעורב יותר מאשר דג הזברה. וידאו זה מציג צעד אחר צעד נהלים כיצד לתפעל עוברים medaka, כולל dechorionation, גובר agarose עבור הדמיה השתלת תאים לייצור מפלצות. נהלים אלה הם חיוניים כדי להשתמש medaka ו דג הזברה במעבדה כדי לנצל את מלוא היתרונות של התכונות המשלימות שלהם לנתיחה הגנטי של פונקציות הגנום החולייתנים.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר שיבוטים בעובר לצורך בחינת האוטונומיה של גן או חלבון מעניין. זה מושג על ידי תיוג עוברים תורמים עם רוד דומין דקסטרן על ידי מיקרו הזרקה בשלב התא האחד כפי שמוצג בסרטון הנלווה לסרטון זה, מיקרו-הזרקה של עוברי מאקה. השלב השני של ההליך הוא פיתוח העוברים התורמים והמקבלים לשלב הנכון.

השלב השלישי של ההליך הוא ציפוי העוברים של התורם והמקבל. השלב האחרון של ההליך הוא השתלת תאים מעוברי התורם המסומנים לעוברים של המקבל. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות על ידי ניתוח התפשטות התפלגות והתמיינות של שיבוטים, של תאים מושתלים באמצעות זיהוי תאים מושתלים על ידי עוקבי הקרינה או השושלת שלהם.

היי, אני שון ברזינסקי מהמעבדה של ד"ר מאקוטו פקי במחלקה לביולוגיה וביוכימיה באוניברסיטת באת'. אני גם רוצה ממעבדת זקי. היום נראה לכם הליך להשתלת תאים בעוברי הדגים הכהים.

אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור עם גן או מוטציה מעניינים, בעל תפקוד אוטונומי של תא או לא תא. אז בואו נתחיל. בעת ציפוי ביצי מאקה השתמש בתמיסות וכלים סטריליים כדי לשפר את הצלחת התצפית והתרבות לטווח ארוך.

הניחו חתיכת נייר זכוכית עמיד למים P 2000 חצץ במכסה של צלחת פטרי שאינה דבקה בתשעה סנטימטרים. השתמש בפה רחב כדי לירות פיפטה פסטה מלוטשת כדי להעביר עד 10 ביצים טריות לא מקובצות נקיות ומסומנות מצלחת ביצה. בינוני לנייר זכוכית.

מסירים עודפי מדיום, משאירים מספיק בכלי כדי למנוע מהביצים להתייבש. השתמש בקצה אצבע עטוי כפפה כדי לגלגל בעדינות 10 ביצים בכל פעם על נייר הזכוכית למשך 45 עד 60 שניות. כדי להסיר שערות על פני השטח החיצוניים ולקלוע את משטח הקוריאן, הפעל לחץ מינימלי ושמור על קצה האצבע מקביל לנייר הזכוכית.

מעבירים את הביצים למנה המקורית של בינוני. מוציאים את המדיום, מכסים את הביצים בתמיסה של 20 מיליגרם למיליליטר פרון. מכסים את התבשיל ודוגרים בחום של 27 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.

הקפידו למקם את המנה בזווית כך שהעוברים יהיו שקועים מספיק באנזים. על מנת למזער את האנזים הנדרש, השתמש בצינור העברה מפלסטיק כדי לשחזר פרונאז לשימוש חוזר ולהניח אותו על קרח. שטפו את הביצים חמש פעמים במדיום עוברי כדי להסיר את כל עקבות הנטייה כדי למנוע ממנו לעכל את האנזים הבקיעה.

הוסף מספיק אנזים בקיעה כדי לכסות את הביצים השטופות. ודא שהביצים נשארות בשכבה אחת בתחתית המנה כדי למנוע ריסוק כשהקוריאן מתמוסס. דוגרים על הביצים בחום של 27 מעלות צלזיוס.

הקפידו למקם את המנה בזווית כך שהעוברים יהיו שקועים מספיק באנזים. על מנת למזער את התקדמות בדיקת האנזים הנדרשת תחת מיקרוסקופ סטריאו מנתח, יצירת חורים דומים יופיעו בשכבה הפנימית של הקוריאן לפני שהיא מתמוססת לחלוטין. התהליך עשוי להימשך עד 60 דקות, תלוי בפעילות האנזים.

כאשר חלק קטן מהקוריאן מומס, יש למצוץ מיד את הביצה הבודדת בעזרת פיפטה כדי למנוע עיכול של העובר על ידי אנזים הבקיעה. מעבירים לכלי נקי של פעם BSS על ידי נגיעה בקצה הפיפטה בעדינות לכלי נקי של פעם BSS ומניחים לביצה להתגלגל החוצה כדי למזער את העברת אנזים הבקיעה. השתמש במלקחיים כדי להסיר את שאר הקוריאן כאשר כל הביצים הועברו מאנזים הבקיעה.

בצע העברה אחרונה למנה חדשה של פעם אחת BBSS. הוסף אנטיביוטיקה אם יש להביא את העוברים לשלב מאוחר יותר של התפתחות עוברית לאחר קישוט להליך זה, התחל ציפוי שלב 12 עוברים 1.5 שעות לפני ההשתלה. השתמש בקצה פיפטה כדי להוסיף כמות קטנה של 3% מתיל צלולוז למרכז מיקרוסקופ חלל.

מחליקים פנימה צלחת פטרי של תשעה סנטימטרים. מורחים את הנוזל דק על פני השקע. יבש את המתיל צלולוז במשך שתי דקות.

מלאו את שקע השקופיות ב-350 מיקרוליטר של סטרילי פעם אחת BSS תחת מיקרוסקופ מנתח. השתמש בפיפטה מזכוכית מלוטשת אש עם פה רחב כדי להעביר תורם אחד ועד ארבעה עוברים מושתלים לשקופית. השתמש בלולאת שיער כדי לכוון את העוברים כך שעורם הפיצוץ פונה כלפי מעלה.

נשען את העוברים זה על זה ליציבות במידת הצורך. הכנס בעדינות מיקרו-מחט לתוך הפיצוץ התורם. דרם. סופג לאט 10 עד 20 תאים.

כעת הכנס בעדינות את המחט לאזור הרלוונטי של דרם העובר המקבל הוצא לאט את תאי התורם. אל תפריע לגבול שק הצ'לו. מלאו בזהירות את צלחת הפטרי בכ-30 מיליליטר סטרילי פעם אחת BSS כדי לטבול את העוברים ולשחרר את העוברים מהמתיל תאית.

יוצקים על צד המנה כדי לא לשבש את העוברים. מוסיפים לתבשיל 100 מיקרוליטר סטרפטומיצין פניצילין לריכוז משוער של 0.3%מכסים את המנה. התבונן בעוברים מעת לעת לפי הצורך.

למחקרי הדמיה ארוכים יותר כגון זמן-lapse ותצפיות מפורטות, הטמיעו עוברים מצופים חיים בעוברים חיים מרדימים כדי למנוע תנועה על ידי הוספת חומר הרדמה מתאים למדיום המכיל את העוברים נמסים כמיליליטר אחד של 3% נקודת התכה נמוכה נוצרה בפעם אחת BSS ושומרת אותה על 37 מעלות צלזיוס. במידת הצורך, הוסף כמות מתאימה של חומר הרדמה לארוס כדי למנוע עוויתות פועלות במהירות למניעת התמצקות, השתמש בפיפטה פסטה עם פה רחב כדי למלא את המכסה. דיכאון של צינור מיקרו צנטריפוגה עם aros.

השתמש בפיפטה עם פה רחב כדי להעביר עובר אחד מצופה ומורדם לתוך הארוס בכובע. העבירו כמה שפחות מדיום עם העובר. עדכנו מיד את הארוס והעובר והעבירו אותם לצלחת פטרי תחתית זכוכית בגודל 3.5 סנטימטר.

מעבירים את המנה לכלי בגודל 14 ס"מ מלא שליש מהדרך בתערובת קרח ומים. החזק את המנה הקטנה יותר בחוזקה לתחתית המנה הגדולה יותר תחת מיקרוסקופ סטריאו מנתח. השתמש בלולאת שיער כדי לכוון במהירות את העובר כרצונך.

החזיקו את העובר בשקט עד שהאגרו מתמצק. כעת ניתן לדמות את העובר. תמונה א' מציגה עובר תורם ומקבל מיד לאחר ההשתלה.

העובר התורם מוצג מימין עם דרם גבס מסומן באדום לחלוטין. העובר המקבל מוצג משמאל ומזוהה בקלות על ידי המסה הקטנה של תאים מושתלים אדומים הנראית בתמונה B מציגה שני עוברים מושתלים כשבע שעות לאחר ההשתלה. שימו לב שהתאים המושתלים נדדו מאתר ההשתלה וכעת הם מפוזרים על פני הפיצוץ.

תמונת עור C מציגה את העובר של הנמען בשלב 29. שימו לב לפיגמנטציה בעין ולנוכחות של מפור בגזע ובאזור המוח. ניתן לראות את התאים המסומנים במוט דומין כמאכלסים רבים מהמבנים העובריים המעידים על ייצור מוצלח של כימרה.

זה עתה הראינו לכם כיצד לאכול עוברי דגי מקה ולבצע השתלת תאים בשלב עוברי מוקדם. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להשתיל את תאי התורם שלך באזור הנכון של הנמען המפוצץ. זה יאפשר לתאי התורם שלך להתמיין לסוג התא הנכון.

אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.