תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית
October 4th, 2010
מאמר זה נועד להדריך את הקורא בפעולה של כוח אטומי משולב אופטי מיקרוסקופ הדמיה לגירוי מכני של תאים חיים בתרבות. פרוטוקול צעד אחר צעד מוצג. נתונים נציג קבוצה שמראה תא חי בתגובה לגירוי מכני מוצג.
חקר תגובת התאים בזמן אמת לגירוי מכני מושג על ידי תאים גדלים לראשונה המבטאים חלבוני היתוך GFP על צלחות תחתית זכוכית למשך 24 שעות. השלב השני הוא ציפוי קצה A FM בפיברונקטין ביוטיניל. לאחר מכן קצה ה- FM הפונקציונלי מובא במגע עם פני התא כדי לאפשר הידבקות מוקדית חזקה להיווצר סביב קצה ה- FM, המאפשר מניפולציה ישירה של שלד הציטו הפועל באמצעות קישור מטריקס אינטגרין אקטין בין הקצה המצופה פיברונקטין לתא.
השלב האחרון הוא לעורר מכנית את התא החי על ידי תנועה מבוקרת כלפי מעלה של קצה A FM, כך שהכוח האנכי מופעל בנקודת המגע של התא מבלי לשבור את ההידבקות המוקדית החזקה. בסופו של דבר, התוצאות מראות כי תאים מגיבים לגירוי המכני על ידי חיזוק ההתקשרות שלהם למצע ועל ידי גרימת ארגון מחדש של שלד הציטו של אקטין כפי שתועד בהדמיה אופטית פלואורסצנטית בזמן אמת. היי, אני אנדריאה טרייק, עוזרת פרופסור במחלקה לביולוגיה מערכתית ורפואה תרגומית במרכז למדעי הבריאות בטקסס.
היי, אני סאם לים. אני פוסט-דוקטורנט במחלקה לביולוגיה מערכתית ורפואה תרגומית במרכז למדעי הבריאות בטקסס. היום נראה לכם נוהל לחקר שיפוץ תאים אדפטיבי לגירוי מכני.
אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור שיפוץ שלד בזמן אמת בתאי שריר חלק בכלי דם חיים. אז בואו נתחיל. עבור מחקרים אלה, נעשה שימוש במיקרוסקופ אולימפוס IX 81 הפוך עם פלואורסצנטיות השתקפות פנימית כוללת או חיבור דשא בשילוב עם ראש סריקה CSU 22 Yokogawa.
מיקרוסקופ כוח אטומי ביו-סקופ SZ מותקן על גבי המיקרוסקופ האופטי ההפוך. המערכת כולה מותקנת על שולחן אופטי בדרגת מחקר ותוארה בעבר בפירוט. מיקרוסקופ משולב זה משתמש בשני מכשירים מצמדים למטען מכפיל אלקטרונים EM כמותיים או מצלמות E-M-C-C-D.
האחד מיועד להדמיית דשא והשני להדמיה קונפוקלית. המכלול הקונפוקלי, המורכב מגלגל המסנן החיצוני של סורק הדיסק המסתובב, ומצלמת E-M-C-C-D, מותקן על לוחית בסיס אלומיניום המונחת על גבי כרית סיליקון הנחוצה לשיכוך רעידות. כל המכלול הקונפוקלי מתחבר למיקרוסקופ דרך אוגן עם צווארון הברגה.
לפיכך, ניתן לנתק את המכלול מהמיקרוסקופ במהלך מיקרוסקופ כוח אטומי או מדידות FM כדי למנוע רטט מסורק הדיסק המסתובב. לייזר ארגון קריפטון משמש כמקור עירור הן למצבי הדמיה דשא והן קונפוקליים. ניתן לחבר את הלייזר לאחד משני הסיבים האופטיים, המעבירים את הלייזר לחיבור הדשא או לראש הסריקה הקונפוקלי.
שנית, מחשבים שולטים במערכת. האחד משתמש בתוכנת ספר שקופיות, השולטת בהדמיה האופטית ובתוכנת ננו-סקופ השנייה, השולטת ב-A FM 24 שעות לפני ניסוי הגירוי המכני הציבה תאים חיים המבטאים מבני GFP הממוקדים כנגד חלבונים ספציפיים בצלחת תרבית תאים בתחתית זכוכית. ביום הניסוי, החלף את מדיום תרבית התאים במדיום נטול פנול אדום.
מכיוון שניסוי FM רגיש מאוד לרעש, הימנע מדיבור או נגיעה בשולחן האופטי או במיקרוסקופ במהלך הניסוי כדי למזער רעש. במדידות FM, נתק את הדיסק המסתובב קונפוקלי מהמיקרוסקופ. הניסוי מתחיל בהרכבת צלחת תרבית התאים על במת FM עם צווארון מגנטי כדי לקבע את המנה לשלב המיקרוסקופ המגנטי.
השלוחה בצורת V בבדיקה A FM מותאמת אישית עם חרוז זכוכית ביוטיניל של שני מיקרון. ניתן לראות את השלוחה בקלות באמצעות המיקרוסקופ. החרוז מודבק ממש בקצה השלוחה, וכאן יש למרוח את תמיסת הציפוי בצורה טיפתית.
כדי להכין את בדיקת ה- FM לניסוי, הרכיב תחילה את הקצה במחזיק הזכוכית ולאחר מכן הנח את מחזיק הזכוכית על תושבת השולחן לציפוי הקצה. שטפו את הקצה על ידי טפטוף בזהירות של 10 מיקרוליטר של מי מלח או DPBS בקצה הקצה, ולאחר מכן השתמשו במגבון קים כדי לייבש את הקצה. חזור על הליך זה חמש פעמים לאחר שטיפה עם DPBS במיליגרם אחד למיליליטר.
נלהב בפתרון. יש להניח טיפה מעל הקצה. הניחו לקצה לדגור במשך חמש דקות לאחר ציפוי האבאדון.
שטפו את הקצה חמש פעמים נוספות עם DPBS. לאחר מכן הצליב פיברונקטין ביוטיניל על האוואדון על ידי הוספת תמיסה של מיליגרם אחד למיליליטר. יש להניח בטיפה על הקצה ולדגור במשך חמש דקות.
לבסוף, שטפו את הקצה שוב חמש פעמים עם DPBS והשאירו את הטיפה האחרונה בקצה. לאחר הכנת הקצה, התקן את הקצה על סורק FM. לאחר הרכבת קצה ה- FM, הנח חצאית סיליקון מגן סביב המחזיק.
לאחר מכן הגדר את המיקרוסקופ של צפייה בווידאו. לאחר מכן, יישר את קצה ה-FM במרכז שדה הראייה. הגדר את הידית האופטית על ידי הנחת קרן הלייזר ממש בקצה השלוחה.
לאחר מכן שנה את המטרה למטרת ההגדלה הגבוהה המתאימה להדמיית תא בודד. לאחר מכן הביאו את התא, שיעורר מכנית לשדה הראייה ובחרו מקום בו קצה ה- A FM צריך לנחות על פני התא. לבסוף, הורד את קצה ה- FM עד שהוא נוגע בתא הספציפי הזה.
לאחר הבאת הקצה במגע עם התא, המתן כ -20 דקות. זה מאפשר להיווצר הידבקות מוקדית חזקה בנקודת המגע FM על פני התא. לאחר תקופת ההמתנה, הליך הגירוי המכני יכול להתחיל להתכונן לניסוי הגירוי המכני.
עבור ממצלמת וידאו למצלמת E-M-C-C-D כדי לאפשר צפייה בתאי הפלואורסצנט להדמיה. לאחר מכן רכוש תמונה ראשונית של התא במנוחה. השתמש בדיסק מסתובב ובמיקרוסקופיה קולית להדמיה של הפעולה בשלד הציטולוגי בכל גוף התא.
לעומת זאת, השתמש בדשא כדי לדמיין הידבקויות מוקדיות כדי לעורר את התא. השתמש בשלוחה כדי להפעיל תנועה מבוקרת כלפי מעלה בצעדים נפרדים כל שלוש עד חמש דקות. בעת רכישת נתוני A FM, חשוב שהמפעיל יפקח כל הזמן על המתח של מיקום Z piso כדי לקבוע את התזמון הנכון לקוטב האנכי.
במקביל לרכישת נתוני FM רשום תמונה קונפוקלית או דשא של התא לאחר כל משיכה אנכית באמצעות תוכנת ספר השקופיות. לבסוף משוך את קצה ה-FM מהתא עם השלמת ניסוי הגירוי. טרנספקט של תאי שריר חלק בכלי הדם עם אקטין, MRFP ו-vcul.
GFP צולם באמצעות FM על פני התא האפיקלי. אותו תא צולם באמצעות דשא על פני התא הבסיסי. כאן שתי התמונות חופפות.
תמונה של אותו תא נרכשה גם באמצעות דיסק מסתובב קונפוקלי בכל גוף התא ומוצגת כהקרנה מקסימלית של ערימה תלת מימדית. מוצגות חפיפות טובות בין ה- A FM לדיסק המסתובב תמונות קונפוקליות. תא השריר החלק של כלי הדם שלה שהועבר עם MRFP אקטין מגורה מכנית על ידי A FM וצולם על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב.
השגיאות מצביעות על סיבים פועלים המראים ארגון מחדש יוצא דופן בגירוי FM. חלק מסיבי הפעולה מתפלמרים בעוד שאחרים מתפלמרים עקב הגירוי המכני, סיבים פועלים אחרים מתקבצים יחד. עקב ארגון מחדש של פעולה, זה עתה הראינו לך כיצד לעורר באופן מכני תרבות מכירת חיים באמצעות EFM ובמקביל להקליט סידור מחדש של CY באמצעות שיטות הדמיה אופטיות.
בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי ניסוי FM הוא רועש ביותר, רגיש. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בהצהרות שלך.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מחקר זה מציג פרוטוקול לשימוש במיקרוסקופ משולב של כוח אטומי-אופטי להדמיה לגירוי מכני של תאים חיים בתרבית. המתודולוגיה כוללת מדריך שלב אחר שלב ומציגה נתונים מייצגים על תגובות של תאים חיים לגירוי מכני.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- גירוי מכני
- הדמיית תאים חיים
רקע
- הבנת תגובת התא לגירויים מכניים חיונית בביולוגיה של התא.
- מיקרוסקופיית כוח אטומי מאפשרת מניפולציה מדויקת של תאים.
- הדמיית תאים חיים מספקת תובנות בזמן אמת לגבי תהליכים תאיים.
- הדבקה פוקאלית ממלאת תפקיד מרכזי בהצמדת התא ותגובתו.
מטרת המחקר
- ללמד על הפעלת מיקרוסקופ מיוחד למחקרים של תאים חיים.
- להדגים את ההשפעות של גירוי מכני על תאים חיים.
- לספק פרוטוקול מפורט לחוקרים לשכפל את המחקר.
שיטות ששימשו
- תאים המבטאים חלבוני נתיך GFP מתרבים על צלחות זכוכית.
- קצה AFM מצופה בפיברו-נקטין ביוטינילציה.
- קצה AFM מתפקד משמש ליצירת הדבקות פוקאליות עם משטח התא.
- גירוי מכני מופעל באמצעות תנועה מבוקרת כלפי מעלה של קצה AFM.
תוצאות עיקריות
- התאים חיזקו את ההצמדה שלהם למצע בעת גירוי.
- נצפתה ארגון מחדש של הציטו-שלד של האקטין בתגובה לכוחות מכניים.
- הדמיית פלואורסצנציה בזמן אמת תיעדה תגובות תאיות דינמיות.
- הפרוטוקול הוכיח בהצלחה את יעילות הטכניקה.
מסקנות
- המיקרוסקופ המשולב חוקר באופן יעיל את תגובות התאים החיים לגירויים מכניים.
- שיטה זו יכולה לשפר את ההבנה של המכניקה וההדבקות התאית.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול חקירת סוגי תאים ותנאים שונים.
