תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית
4 באוקטובר 2010
מאמר זה נועד להדריך את הקורא בפעולה של כוח אטומי משולב אופטי מיקרוסקופ הדמיה לגירוי מכני של תאים חיים בתרבות. פרוטוקול צעד אחר צעד מוצג. נתונים נציג קבוצה שמראה תא חי בתגובה לגירוי מכני מוצג.
חקר תגובת התאים בזמן אמת לגירוי מכני מושג על ידי תאים גדלים לראשונה המבטאים חלבוני היתוך GFP על צלחות תחתית זכוכית למשך 24 שעות. השלב השני הוא ציפוי קצה A FM בפיברונקטין ביוטיניל. לאחר מכן קצה ה- FM הפונקציונלי מובא במגע עם פני התא כדי לאפשר הידבקות מוקדית חזקה להיווצר סביב קצה ה- FM, המאפשר מניפולציה ישירה של שלד הציטו הפועל באמצעות קישור מטריקס אינטגרין אקטין בין הקצה המצופה פיברונקטין לתא.
השלב האחרון הוא לעורר מכנית את התא החי על ידי תנועה מבוקרת כלפי מעלה של קצה A FM, כך שהכוח האנכי מופעל בנקודת המגע של התא מבלי לשבור את ההידבקות המוקדית החזקה. בסופו של דבר, התוצאות מראות כי תאים מגיבים לגירוי המכני על ידי חיזוק ההתקשרות שלהם למצע ועל ידי גרימת ארגון מחדש של שלד הציטו של אקטין כפי שתועד בהדמיה אופטית פלואורסצנטית בזמן אמת. היי, אני אנדריאה טרייק, עוזרת פרופסור במחלקה לביולוגיה מערכתית ורפואה תרגומית במרכז למדעי הבריאות בטקסס.
היי, אני סאם לים. אני פוסט-דוקטורנט במחלקה לביולוגיה מערכתית ורפואה תרגומית במרכז למדעי הבריאות בטקסס. היום נראה לכם נוהל לחקר שיפוץ תאים אדפטיבי לגירוי מכני.
אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור שיפוץ שלד בזמן אמת בתאי שריר חלק בכלי דם חיים. אז בואו נתחיל. עבור מחקרים אלה, נעשה שימוש במיקרוסקופ אולימפוס IX 81 הפוך עם פלואורסצנטיות השתקפות פנימית כוללת או חיבור דשא בשילוב עם ראש סריקה CSU 22 Yokogawa.
מיקרוסקופ כוח אטומי ביו-סקופ SZ מותקן על גבי המיקרוסקופ האופטי ההפוך. המערכת כולה מותקנת על שולחן אופטי בדרגת מחקר ותוארה בעבר בפירוט. מיקרוסקופ משולב זה משתמש בשני מכשירים מצמדים למטען מכפיל אלקטרונים EM כמותיים או מצלמות E-M-C-C-D.
האחד מיועד להדמיית דשא והשני להדמיה קונפוקלית. המכלול הקונפוקלי, המורכב מגלגל המסנן החיצוני של סורק הדיסק המסתובב, ומצלמת E-M-C-C-D, מותקן על לוחית בסיס אלומיניום המונחת על גבי כרית סיליקון הנחוצה לשיכוך רעידות. כל המכלול הקונפוקלי מתחבר למיקרוסקופ דרך אוגן עם צווארון הברגה.
לפיכך, ניתן לנתק את המכלול מהמיקרוסקופ במהלך מיקרוסקופ כוח אטומי או מדידות FM כדי למנוע רטט מסורק הדיסק המסתובב. לייזר ארגון קריפטון משמש כמקור עירור הן למצבי הדמיה דשא והן קונפוקליים. ניתן לחבר את הלייזר לאחד משני הסיבים האופטיים, המעבירים את הלייזר לחיבור הדשא או לראש הסריקה הקונפוקלי.
שנית, מחשבים שולטים במערכת. האחד משתמש בתוכנת ספר שקופיות, השולטת בהדמיה האופטית ובתוכנת ננו-סקופ השנייה, השולטת ב-A FM 24 שעות לפני ניסוי הגירוי המכני הציבה תאים חיים המבטאים מבני GFP הממוקדים כנגד חלבונים ספציפיים בצלחת תרבית תאים בתחתית זכוכית. ביום הניסוי, החלף את מדיום תרבית התאים במדיום נטול פנול אדום.
מכיוון שניסוי FM רגיש מאוד לרעש, הימנע מדיבור או נגיעה בשולחן האופטי או במיקרוסקופ במהלך הניסוי כדי למזער רעש. במדידות FM, נתק את הדיסק המסתובב קונפוקלי מהמיקרוסקופ. הניסוי מתחיל בהרכבת צלחת תרבית התאים על במת FM עם צווארון מגנטי כדי לקבע את המנה לשלב המיקרוסקופ המגנטי.
השלוחה בצורת V בבדיקה A FM מותאמת אישית עם חרוז זכוכית ביוטיניל של שני מיקרון. ניתן לראות את השלוחה בקלות באמצעות המיקרוסקופ. החרוז מודבק ממש בקצה השלוחה, וכאן יש למרוח את תמיסת הציפוי בצורה טיפתית.
כדי להכין את בדיקת ה- FM לניסוי, הרכיב תחילה את הקצה במחזיק הזכוכית ולאחר מכן הנח את מחזיק הזכוכית על תושבת השולחן לציפוי הקצה. שטפו את הקצה על ידי טפטוף בזהירות של 10 מיקרוליטר של מי מלח או DPBS בקצה הקצה, ולאחר מכן השתמשו במגבון קים כדי לייבש את הקצה. חזור על הליך זה חמש פעמים לאחר שטיפה עם DPBS במיליגרם אחד למיליליטר.
נלהב בפתרון. יש להניח טיפה מעל הקצה. הניחו לקצה לדגור במשך חמש דקות לאחר ציפוי האבאדון.
שטפו את הקצה חמש פעמים נוספות עם DPBS. לאחר מכן הצליב פיברונקטין ביוטיניל על האוואדון על ידי הוספת תמיסה של מיליגרם אחד למיליליטר. יש להניח בטיפה על הקצה ולדגור במשך חמש דקות.
לבסוף, שטפו את הקצה שוב חמש פעמים עם DPBS והשאירו את הטיפה האחרונה בקצה. לאחר הכנת הקצה, התקן את הקצה על סורק FM. לאחר הרכבת קצה ה- FM, הנח חצאית סיליקון מגן סביב המחזיק.
לאחר מכן הגדר את המיקרוסקופ של צפייה בווידאו. לאחר מכן, יישר את קצה ה-FM במרכז שדה הראייה. הגדר את הידית האופטית על ידי הנחת קרן הלייזר ממש בקצה השלוחה.
לאחר מכן שנה את המטרה למטרת ההגדלה הגבוהה המתאימה להדמיית תא בודד. לאחר מכן הביאו את התא, שיעורר מכנית לשדה הראייה ובחרו מקום בו קצה ה- A FM צריך לנחות על פני התא. לבסוף, הורד את קצה ה- FM עד שהוא נוגע בתא הספציפי הזה.
לאחר הבאת הקצה במגע עם התא, המתן כ -20 דקות. זה מאפשר להיווצר הידבקות מוקדית חזקה בנקודת המגע FM על פני התא. לאחר תקופת ההמתנה, הליך הגירוי המכני יכול להתחיל להתכונן לניסוי הגירוי המכני.
עבור ממצלמת וידאו למצלמת E-M-C-C-D כדי לאפשר צפייה בתאי הפלואורסצנט להדמיה. לאחר מכן רכוש תמונה ראשונית של התא במנוחה. השתמש בדיסק מסתובב ובמיקרוסקופיה קולית להדמיה של הפעולה בשלד הציטולוגי בכל גוף התא.
לעומת זאת, השתמש בדשא כדי לדמיין הידבקויות מוקדיות כדי לעורר את התא. השתמש בשלוחה כדי להפעיל תנועה מבוקרת כלפי מעלה בצעדים נפרדים כל שלוש עד חמש דקות. בעת רכישת נתוני A FM, חשוב שהמפעיל יפקח כל הזמן על המתח של מיקום Z piso כדי לקבוע את התזמון הנכון לקוטב האנכי.
במקביל לרכישת נתוני FM רשום תמונה קונפוקלית או דשא של התא לאחר כל משיכה אנכית באמצעות תוכנת ספר השקופיות. לבסוף משוך את קצה ה-FM מהתא עם השלמת ניסוי הגירוי. טרנספקט של תאי שריר חלק בכלי הדם עם אקטין, MRFP ו-vcul.
GFP צולם באמצעות FM על פני התא האפיקלי. אותו תא צולם באמצעות דשא על פני התא הבסיסי. כאן שתי התמונות חופפות.
תמונה של אותו תא נרכשה גם באמצעות דיסק מסתובב קונפוקלי בכל גוף התא ומוצגת כהקרנה מקסימלית של ערימה תלת מימדית. מוצגות חפיפות טובות בין ה- A FM לדיסק המסתובב תמונות קונפוקליות. תא השריר החלק של כלי הדם שלה שהועבר עם MRFP אקטין מגורה מכנית על ידי A FM וצולם על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב.
השגיאות מצביעות על סיבים פועלים המראים ארגון מחדש יוצא דופן בגירוי FM. חלק מסיבי הפעולה מתפלמרים בעוד שאחרים מתפלמרים עקב הגירוי המכני, סיבים פועלים אחרים מתקבצים יחד. עקב ארגון מחדש של פעולה, זה עתה הראינו לך כיצד לעורר באופן מכני תרבות מכירת חיים באמצעות EFM ובמקביל להקליט סידור מחדש של CY באמצעות שיטות הדמיה אופטיות.
בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי ניסוי FM הוא רועש ביותר, רגיש. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בהצהרות שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול לשימוש במיקרוסקופ דימות אופטי-כוח אטומי משולב להפעלת תאי חיים בתרבית באופן מכני. המתודולוגיה כוללת מדריך שלב-אחרי-שלב ומציגה נתונים מייצגים של תגובות תאי חיים לגירוי מכני.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- סטימולציה מכנית
- דימוי תאים חיים
רקע
- הבנת התגובה של תאים לגירויים מכניים היא קריטית בביולוגיה של התא.
- מיקרוסקופיית כוח אטומי מאפשרת מניפולציה מדויקת של תאים.
- דימות תאים חיים מספק תובנות בזמן אמת לגבי תהליכים תאיים.
- היצמדות מוקדית (Focal adhesion) ממלאת תפקיד מרכזי בהיצמדות התא ובתגובתו.
מטרת המחקר
- להסביר על תפעולו של מיקרוסקופ ייעודי למחקרי תאים חיים.
- להדגים את ההשפעות של גרייה מכנית על תאים חיים.
- לספק פרוטוקול מפורט המאפשר לחוקרים לשחזר את המחקר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תאים המבטאים חלבוני היתוך GFP תורגדו על פיתחי זכוכית.
- קצה ה-AFM מצופה בפיברונקטין מביוטין.
- קצה ה-AFM הפונקציונלי משמש ליצירת הידבקותים מוקדיים עם פני התא.
- גירוי מכני מופעל באמצעות תנועה עולה מבוקרת של קצה ה-AFM.
תוצאים עיקריים
- התאים חיזקו את היצמדותם לתשתיות בעקבות גרייה.
- נצפתה ארגון מחדש של שלד האקטין בתגובה לכוחות מכניים.
- דימות פלואורסצנציה בזמן אמת תפס תגובות תאיות דינמיות.
- הפרוטוקול הדגים בהצלחה את יעילותה של הטכניקה.
מסקנות
- המיקרוסקופ המשולב מאפשר לחקור ביעילות תגובות של תאים חיים לגירויים מכניים.
- שיטה זו יכולה להעמיק את ההבנה של מכניקה תאית והיצמדות (adhesion).
- יישומים עתידיים עשויים לכלול בחינה של סוגי תאים ותנאים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנה של האופן שבו תאים חיים חשים וכ adaptations למכוחות מכניות היא קריטית להסרת סיכונים מתהליך התיקוף של מטרות במסלולי העברה של אותות מכניים (mechanotransduction). גישה משולבת זו של AFM ודימוי אופטי מאפשרת רזולוציה תת-תאית בזמן אמת של דינמיקת השלד התאי וההיצמדות, ובכך מספקת ביטחון חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי קישור גירויים מכניים לארגון מבני מחדש. השיטה תומכת בהסרת סיכונים מכניסטית באמצעות ויזואליזציה ישירה של עיצוב מחדש של actin המושרה על ידי כוח וחיזוק של נקודות היצמדות (focal adhesions), ובכך מסייעת בקבלת החלטות של go/no-go בבחירת מטרות טרום-קלינית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי חשיפת האופן שבו גירוי מכני מעורר ארגון מחדש של שלד התא המבוסס על אקטין וחיזוק של היצמדות מוקדית (focal adhesion).
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות באמצעות תצפית ישירה על דינמיקה של שלד התא התלויה בכוח בתאים נצמדים חיים.
- ערך חיזוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי קישור קלטים מכניים לתוצרים מבניים, ובכך מפחית עמימות במעורבות של מטרות רגישות למכניקה (mechanosensitive).
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עבור זרימות עבודה המשך, על ידי ביסוס פרוטוקולים הניתנים לשחזור עבור גרייה מכנית ודימות בזמן אמת.
- ערך תפעולי: נותן מענה לסטנדרטיזציה של בדיקות ולפלט כמותי באמצעות תנועה מבוקרת של קצה ה-AFM וקריאות פלואורסצנציה מסונכרנות.
- סקביליות: מדגיש את היכולת להשתמש בפלטפורמה עבור סוגים שונים של תאים נצמדים, דבר המאפשר הערכה מהימנה של תרכובות במסגרת קמפיינים של סריקת מכנו-ביולוגיה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: דן ברלוונטיות למחלה על ידי הדגמת צימוד מבני מאפיקאל לבזאלי, שבו גירוי אפיקאלי משרה ארגון מחדש לאורך כל גוף התא.
- קידום מותאם סיכונים: מתאר המשכיות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני, באמצעות לכידה של תגובות דינמיות המנחות את התאמת הסמנים הביולוגיים במסלולי מכנו-טרנסדוקציה.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מתמקד בערך של הפחתת סיכונים חזויה על ידי הצגה של האופן שבו הפעלת כוח מובילה לפולימריזציה, דפולימריזציה וצמימה של אקטין, ובכך מבהיר את מנגנון הפעולה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ועד לזיהוי מובילים (leads), ובכך היא מספקת תובנות מכניסטיות לפני סריקת תרכובות.
- ביולוגיה של תגליות: מסביר כיצד השיטה תומכת בבדיקת השערות באמצעות יישום של גירוי מכני מבוקר ותצפית בזמן אמת על עיצוב מחדש של השלד התאי.
- סריקה: מתאר את מוכנות הבדיקה באמצעות יצירה הדירה של הידבקות מוקדית (focal adhesion) ודימות כמותי של דינמיקת actin באמצעות שיטות TIRF ומיקרוסקופיה קונפוקאלית.
- אנליטיקה: מדגיש מדידות כגון אירועי פולימריזציה/דפולימריזציה של actin ושינויים בעוצמת ההידבקות המוקדית, המאפשרים השוואה בין מצבים מעוררים למצבי מנוחה.
- מחקר תרגומי: מקשר את השיטה לרצף פרה-קליני על ידי הדגמה של האופן שבו גירוי מכני אפקלי מפיץ שינויים מבניים דרך גוף התא, דבר הרלוונטי להעברת כוחות ברמת הרקמה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציג את השיטה כיכולת הדירה למחקר של מטרות רגישות למכניקה (mechanosensitive) במודלים של תאי כלי דם, תאי אפיתל ותאי מזנכימליים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף מטרה, הפחתת עמימות מכניסטית במסלולי העברה מכנית (mechanotransduction).
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת הרחבה של גירוי מכני ודימוי רב-מודאלי.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך או הפסקה (go/no-go), יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות של מכנוביולוגיה.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף והחלטות קידום מותאמות סיכון, המבוססות על תצפית ישירה של הסתגלות תאית המושרה על ידי כוח.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות מדעית בהפעלת AFM, דימוי תאים חיים ודינמיקה של השלד התאי.
- הצרכים הציודיים כוללים מערכת משולבת של AFM-TIRF-confocal עם שיכוך רעידות ומצלמות EM-CCD כפולות.
- סטנדרטיזציה בין צוותים מחייבת הקפדה על פרוטוקול עבור פונקציונליזציה של הקצה, יצירת הדבקות מוקדיות (focal adhesion) ותזמון הגירוי.
- שיקולי התאמה כוללים קשיחות מצע משתנה, חלבוני ציפוי וסוגי תאים שונים, תוך שמירה על ספציפיות של גירוי אפקלי.
- מגבלות מעשיות כוללות רגישות לרעש במהלך מדידות AFM והצורך בתנאים סביבתיים מבוקרים לצמצום הסחף (drift).
