Name: תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: למד כיצד לחקור תגובות תאים חיים לגירוי מכני באמצעות מיקרוסקופ משולב אופטי אטומי. השיטה מאפשרת תיעוד בזמן אמת של ארגון מחדש של ציטוסקלטין האקטין בתאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Vinculin-GFP הפלסמיד היה מתנה קנת יאמאדה, המכונים הלאומיים לבריאות, המכון הלאומי למחקר דנטלי Craniofacial, Bethesda, מרילנד, אקטין mRFP הפלסמיד היה מתנה מיכאל דוידסון, פלורידה סטייט, Tallahassee, פלורידה. עבודה זו נתמכה על ידי בפרס קריירה NSF # 0747334 ו - AHA-National SDG # 0835205N כדי אנדריאה קנה הנשימה.

1. סקירה כללית של מערכת מיקרוסקופ משולב המערכת מיקרוסקופ המשמש במחקרים אלה תוארה בפירוט 1. בקצרה, הפוכה אולימפוס IX-81 מיקרוסקופ עם TIRF מצורף (אולימפוס, מרכז עמק, PA) בשילוב עם CSU-22 Yokogawa ראש סריקה (Yokogawa החשמל Inc, יפן). BioScope SZ מיקרוסקופ כוח אטומי (Veeco מכשירים Inc, סנטה ברברה, קליפורניה) הוא רכוב על גבי מיקרוסקופ אופטי הפוכה, ואת המערכת כולה מוצבת בחלק העליון של הטבלה מחקר כיתה אופטי (ניופורט, אירווין, קליפורניה). האסיפה confocal מורכב מסורק דיסק-ספינינג, גלגל מסנן חיצוני המצלמה EMCCD שלה (רופר Scientific-Photometrics, טוסון, אריזונה) מחוברים נוקשה עם לוחית אלומיניום בסיס מושם על משטח סיליקון הכרחי דעיכת רטט. סורק confocal מתחבר עם המיקרוסקופ דרך מקורבות עם צווארון חתר שניתן decoupled מן המיקרוסקופ במהלך המדידות AFM, כך אין רעידות מהסורק דיסק ספינינג, ישפיע על מדידות AFM. ארגון, קריפטון לייזר (ספקטרה פיזיקה, Mountain View, CA) משמש כמקור עירור הן TIRF מצבי הדמיה confocal, והוא יכול להיות בשילוב לחילופין בשני סיבים אופטיים אשר לספק את לייזר המצורף TIRF או ראש סריקה, בהתאמה . שני המחשבים לשלוט במערכת: Slidebook תוכנה שולטת הדמיה אופטית ותוכנת Nanoscope שולט AFM. 2. תא תרבות תאים חיים להביע GFP בונה ממוקד כנגד חלבונים ספציפיים צריך להיות ממוקם בתוך צלחת תחתית זכוכית תא תרבות 24 שעות לפני הניסוי גירוי מכני. ביום הניסוי להחליף את תרבית תאים בינוניים עם אדום בינוני ללא פנול. המנה תרבית תאים הוא רכוב על הבמה AFM עם קולר מגנטי. 3. AFM עצה הכנה מיקרוסקופ הקמה קצה AFM אישית עם מיקרון 2 biotinilated חרוז זכוכית יהיה שטף חמש פעמים עם DPBS ואז מודגרות 5 דקות עם avidin (1 מ"ג / מ"ל), שטפתי שוב עם DPBS חמש פעמים, ולאחר מכן מודגרות 5 דקות עם biotinilated 1 מ"ג / מ"ל פיברונקטין. טיפ יהיה שטף חמש פעמים יותר בסוף 2, רכוב על הסורק AFM, ולאחר מכן את החצאית סיליקון מגן יוצבו סביב לבעל. הגדר את המיקרוסקופ לצפייה וידאו כדי ליישר את קצה AFM במרכז שדה הראייה. יישר את המנוף אופטי ידי הצבת את קרן הלייזר בסוף מאוד של שלוחה, ולאחר מכן לשנות את אובייקטיבי מטרה בהגדלה גבוהה המתאים הדמיה תא בודד. באביב קבוע של קצה חייב להיות נחוש לפני תחילת הניסוי. פרמטר זה תימדד בשיטת מנגינה תרמית זמין התוכנה Nanoscope. החלף ממצלמת וידאו אל המצלמה EMCCD כדי לאפשר הדמיה בתפרחת. לאחר מכן, בחר תא ולהביא את קצה AFM במגע עם תא ספציפי. לאחר זמן המתנה 20 דקות, אשר הוא הכרחי עבור הידבקות מוקד חזקה כדי ליצור בנקודת AFM של מגע עם פני התא, ההליך גירוי מכני יתחיל. 4. גירוי מכני של תא חי TIRF הדמיה 3-4 תהיה שיטת הבחירה של הדמיה לכימות הידבקויות מוקד, ו-ספינינג דיסק confocal הדמיה 5 ישמש לדמיין את cytoskeleton אקטין בגוף התא. AFM 6 ישמשו הדמיה מצב הקשר תחת נוזל. התמונה TIRF או confocal של התא יהיה רכשה לפני תחילת ההליך גירוי מכני. גירוי מכני יהיה המושרה על ידי החללית AFM פונקציונליות כי יועברו מעלה בשלבים בדידים כל 3-5 דקות במשך תקופה של זמן (1-1.5 שעות). התא מגיב תגובה תירשם ברציפות תוכנה Nanoscope כסדרה של תמונות גובה, כל שורה בתמונה המייצג יחידת זמן של 1 שניות. בעוד רכישת נתונים AFM, המפעיל צגים בכל עת את עמדת-z של קצה AFM, כדי לקבוע את התזמון הנכון בשביל למשוך הבא. אחרי כל גירוי מכני ניתן לרכוש תמונה TIRF או confocal של התא Slidebook תוכנה, בעוד הרף רכישת נתונים AFM. התמונות אופטי יכול להיות מעובד off-line ליצור סרטים שמראים cytoskeleton אקטין מוקד מחדש הידבקויות. כמו כן, כל תמונה ניתן לעבד כמותי כדי לקבוע תא שטח, אזור חלבון מסוים, ולנתח את המורפולוגיה תא בכלל. בסוף הניסוי קצה AFM היא נסוגה מהתא ורגישות AFM הטיפ תימדד בתוכנה Nanoscope. הניסוי הוא מאוד רגיש לרעש! כל נגיעה לדבר או מיקרוסקופ במהלך לשעברperiment יש להימנע. כדי למזער את רעש המדידות AFM, confocal את הדיסק מסתובב, צריך להיות דה מצמידים של המיקרוסקופ. זמן ההמתנה כדי ליצור מוקדי הדבקה חזקה בין שטח פני התא ואת קצה AFM עשוי להשתנות בהתאם לסוג התא המשמש ואת מצופה מטריצה ​​על קצה. 5. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2072/2072fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. תא השריר החלק בכלי הדם אותו (VSMC) transfected עם אקטין mRFP vinculin ו-GFP היה צילמו על ידי: (א) AFM על פני התא apical; (ב) TIRF על פני השטח של התאים הבזליים, ו (ג) ספינינג דיסק מיקרוסקופיה confocal בגוף התא. התמונה confocal מוצג כהשלכה מרבי של מחסנית 3-D. חפיפה טובה בין AFM ו TIRF או ספינינג דיסק תמונות confocal מוצגים (ד) ו - (ה), בהתאמה. גודל התמונה הוא 64 x 50 מיקרון. <img src="/files/ftp_upload/2072/2072fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. VSMC transfected עם אקטין mRFP היה מגורה באופן מכני על ידי AFM ו הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה ספינינג דיסק confocal החצים מצביעים על סיבי אקטין כי:. (א) לפלמר / לעבות, (ב) depolymerize / נעלמים, או (ג) צרור יחד בשל על ארגון מחדש אקטין. קווים מקווקווים לבן מייצגים את קצה AFM מעל התא. תמונה בגודל 91 x 91 מיקרון.

<ol><li>Trache, A., Lim, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+microscopy+for+real-time+imaging+of+mechanotransduction+studies+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells.</a> J Biomed Opt. 14, 034024-03 (2009).</li>
<li>Trache, A., Meininger, G. A. Atomic Force Microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrache%2C+A+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22">Current Protocols in Microbiology</a>. Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. , Wiley & Sons Inc. Volume 2C 2.1-2.17 (2008).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J Biomed Opt. 6, 6-13 (2001).</li>
<li>Trache, A., Meininger, G. A. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrache%2C+A+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22">Current Protocols in Microbiology</a>. Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. , Wiley & Sons Inc. 2B 2.1-2.22 (2008).</li>
<li>Inoue, S., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct-view+high-speed+confocal+scanner%3A+the+CSU-10%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct-view high-speed confocal scanner: the CSU-10.</a> Methods Cell Biol. 70, 87-127 (2002).</li>
<li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscope.</a> Phys Rev Lett. 56, 930-933 (1986).</li>
<li>Stamenović, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+mechanics+in+airway+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal mechanics in airway smooth muscle cells.</a> Respir Physiol Neurobiol. 163, 25-32 (2008).</li>
<li>Gunst, S. J., Tang, D. D., Opazo Saez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+remodeling+of+the+airway+smooth+muscle+cell%3A+a+mechanism+for+adaptation+to+mechanical+forces+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal remodeling of the airway smooth muscle cell: a mechanism for adaptation to mechanical forces in the lung.</a> Respir Physiol Neurobiol. 137, 151-168 (2003).</li>
<li>Worth, N. F., Rolfe, B. E., Song, J., Campbell, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation+in+culture+is+associated+with+reorganization+of+contractile+and+cytoskeletal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganization of contractile and cytoskeletal proteins.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 49, 130-145 (2001).</li>
<li>Romer, H. R., Birukov, K. G., Garcia, J. G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+Adhesions%3A+paradigm+for+a+signaling+nexus%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Focal Adhesions: paradigm for a signaling nexus.</a> Circulation Research. 98, 606-616 (2006).</li>
<li>Opazo Saez, A., Zhang, W., Wu, Y., Turner, C. E., Tang, D. D., Gunst, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+development+during+contractile+stimulation+of+smooth+muscle+requires+recruitment+of+paxillin+and+vinculin+to+the+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tension development during contractile stimulation of smooth muscle requires recruitment of paxillin and vinculin to the membrane.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 286, C433-C447 (2004).</li>
<li>Alenghat, F. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction%3A+all+signals+point+to+cytoskeleton%2C+matrix+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Sciences+STKE%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix and integrins.</a> Sciences STKE. 119, pe6-pe6 (2002).</li>
<li>Zamir, E., Geiger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+complexity+and+dynamics+of+cell-matrix+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular complexity and dynamics of cell-matrix adhesions.</a> J Cell Sci. 114, 3583-3590 (2001).</li>
<li>Geiger, B., Bershdsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+mechanosensory+function+of+focal+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly and mechanosensory function of focal contacts.</a> Curr Opin Cell Biol. 13, 584-592 (2001).</li>
<li>Sastry, S. K., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+Adhesions%3A+a+nexus+for+intracellular+signaling+and+cytoskeletal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Focal Adhesions: a nexus for intracellular signaling and cytoskeletal dynamics.</a> Exp Cell Res. 261, 25-36 (2000).</li>
<li>Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mechanotransduction.</a> Dev Cell. 10, 11-20 (2006).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הידבקויות cytoskeleton 7-10 ו 11-16 הם מבנים מוקד דינמי להרכיב, להתפזר להתהפך כמו תאים נודדים או להגיב בכוח מכני 17. יש להם פונקציות משמעותי בוויסות גדילת התאים, הישרדות, ועל ביטוי גנים. ידיעת התפלגות הספציפיים שלהם ואת הדינמיקה מספקת הבנה טובה יותר של האופן שבו תאים לתקשר עם מטריקס ו - בינם לבין עצמם. מערכת זו המיקרוסקופ החדש ישים רחב על פני מגוון רחב של מחקרים דינמי מולקולריים ב...

<table><tbody><tr><td>חוד AFM</td><td>Novascan Technologies, Inc.</td><td></td><td>חרוזי Borosilicate בגודל 2 micron, קשיחות 0.01N/m, פני שטח Biotin</td></tr><tr><td>avidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9275</td><td>1mg/mL ב-DPBS</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4759</td><td>1 mg/mL</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>21600-051</td><td></td></tr><tr><td>ערכה לטרנספקציה של Amaxa עבור תאי שריר חלק</td><td>Lonza Inc.</td><td>VPI-1004</td><td></td></tr><tr><td>צלחות עם תחתית זכוכית של Mattek</td><td>MatTek Corp.</td><td>P60G-1.5-30-F</td><td>צלחות Falcon סטריליות בגודל 60mm עם כיסוי זכוכית תחתית מס' 1.5</td></tr></tbody></table>

תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

כדי להבין את המנגנון שבאמצעותו תאים חיים במובן כוחות מכניים, וכיצד הם מגיבים להסתגל לסביבה שלהם, טכנולוגיה חדשה מסוגלת לחקור התנהגות תאים ברמה המשנה הסלולר עם רזולוציה במרחב ובזמן גבוהה פותחה. לפיכך, מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) היתה משולבת עם מיקרוסקופיה סך פנימית הקרינה (TIRF) השתקפות מהיר ספינינג דיסק (FSD) מיקרוסקופיה confocal. המערכת המשולבת הוא החלים רחב על פני מגוון רחב של מחקרים דינמי מולקולריים בתאים חיים כל חסיד, המאפשר הדמיה אופטית ישיר של תגובות התא לגירוי מכני בזמן אמת. התארגנות משמעותית של סיבי אקטין ו הידבקויות מוקד הוצגה עקב גירוי מכני מקומי על פני התא apical כי Induced שינויים לתוך המבנה התאי בגוף התא. אלו טכניקות חדשניות יספק מידע חדש להבנת השינוי המבני תא חי ואת הדינמיקה בתגובה לכוח מכני. פרוטוקול מפורט נתונים לקבוע כי נציג תא חי להראות בתגובה לגירוי מכני מוצגים.

מאמר זה נועד להדריך את הקורא בפעולה של כוח אטומי משולב אופטי מיקרוסקופ הדמיה לגירוי מכני של תאים חיים בתרבות. פרוטוקול צעד אחר צעד מוצג. נתונים נציג קבוצה שמראה תא חי בתגובה לגירוי מכני מוצג.

כדי להבין את המנגנון שבאמצעותו תאים חיים חשים כוחות מכניים, ואת האופן שבו הם מגיבים לסביבתם ומסתגלים אליה, טכנולוגיה חדשה המסוגלת ל...

לימוד תגובת תאים בזמן אמת לגירוי מכני מבוצע תחילה על ידי גידול תאים המבטאים חלבוני איחוי GFP על צלחות בעלות תחתית זכוכית למשך 24 שעות. השלב השני הוא ציפוי קצה ה-AFM בפיברונקטין ביוטינילי. לאחר מכן, קצה ה-AFM הפונקציונלי מובא למגע עם פני התא כדי לאפשר היווצרות של הידבקות מוקדית חזקה מסביב לקצה ה-AFM, דבר המאפשר מניפולציה ישירה של שלד התא מבוסס האקטין באמצעות קישור מטריקס-אינטגרין-אקטין בין הקצה המצופה בפיברונקטין לבין התא.השלב הסופי הוא גירוי מכני של התא החי באמצעות תנועה נשלטת כלפי מעלה של קצה ה-AFM, כך שהכוח האנכי יופעל בנקודת המגע עם התא מבלי לשבור את הדבקות המוקדית (focal adhesion) החזקה. בסופו של דבר, התוצאות מראות כי תאים מגיבים לגירוי המכני על ידי חיזוק היצמדותם למצע ועל ידי השראת ארגון מחדש של שלד התא מאקטין, כפי שתועד באמצעות דימוי אופטי פלואורסצנטי בזמן אמת. שלום, אני אנדריאה טרייק, מרצה בכירה במחלקה לביולוגיה של מערכות ורפואה תרגומית במרכז המדעי לבריאות של Texas A&M.שלום, אני Sum Lim. אני עמית פוסט-דוקטורט במחלקה לביולוגיה של מערכות ורפואה תרגומית ב-Texas A&M Health Science Center. היום נדגים לכם פרוצדורה לחקר עיצוב מחדש תאי אדפטיבי למעוררות מכנית.אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור עיצוב מחדש של השלד התאי בזמן אמת בתאי שריר חלק כלי דם חיים. אז בואו נתחיל. למחקרים אלו, נעשה שימוש במיקרוסקופ הפוך Olympus IX 81 עם התקן פלואורסצנציית הח reflection הפנימי total (TIRF) בשילוב עם ראש סריקה CSU 22 Yokogawa.מיקרוסקופ כוח אטומי מסוג bio scope SZ מורכב מעל מיקרוסקופ אופטי הפוך. המערכת כולה מותקנת על שולחן אופטי ברמה מחקרית ותוארה בעבר בפירוט. מיקרוסקופ משולב זה משתמש בשתי מצלמות quant EM מסוג electron multiplying charge coupled device או E-M-C-C-D.אחד נועד לדימוי שטח (turf imaging) והשני לדימוי קונפוקאלי. המכלול הקונפוקאלי, המורכב מסורק דיסקה מסתובבת, גלגל מסננים חיצוני ומצלמת E-M-C-C-D, מותקן על פלטת בסיס מאלומינום המונחת על רפידת סיליקון הנחוצה לשיכוך רעידות. המכלול הקונפוקאלי כולו מתחבר למיקרוסקופ באמצעות פלאנג' בעל טבעת הברגה.כך ניתן להפריד את המכלול מהמיקרוסקופ במהלך מיקרוסקופיית כוח אטומי או מדידות FM כדי למנוע רעידות מהסורק של הדיסקה המסתובבת. לייזר ארגון-קריפטון משמש כמקור עירור הן למצבי דימוי turf והן למצבי דימוי קונפוקליים. ניתן לחבר את הלייזר לאחד משני הסיבים האופטיים, המעבירים את הלייזר לאביזר ה-turf או לראש הסריקה הקונפוקלי.שני מחשבים שולטים במערכת. אחד משתמש בתוכנת slide book, השולטת בדימות האופטי, והשני בתוכנת nano scope, השולטת ב-AFM. 24 שעות לפני ניסוי הגירוי המכני, העבר תאים חיים המבטאים מבני GFP המכוונים לחלבונים ספציפיים לצלחית תרבית תאים בעלת תחתית זכוכית. ביום הניסוי, החלף את מצע תרבית התאים במצע נטול phenol red.מכיוון שניסוי a FM רגיש מאוד לרעשים, הימנע מדיבור או ממגע בשולחן האופטי או במיקרוסקופ במהלך הניסוי כדי למזער רעשים. במדידות a FM, נתק את ה-spinning disc confocal מהמיקרוסקופ. הניסוי מתחיל בהנחת צלחת תרבית התאים על במת ה-a FM באמצעות טבעת מגנטית להצמדת הצלחת לבמת המיקרוסקופ המגנטית.הקנטילבר בצורת V של גשש ה-AFM מותאם אישית עם חרוץ זכוכית ביוטינילי עם קוטר של שני מיקרון. ניתן לראות את הקנטילבר בקלות באמצעות המיקרוסקופ. החרוץ מודבק בקצהו של הקנטילבר, ושם יש להחיל את תמיסת הציפוי בטיפות.להכנת גשוש FM עבור הניסוי, ראשית התקינו את הראש במחזיק הזכוכית ולאחר מכן הניחו את מחזיק הזכוכית על מעמד השולחן כדי לצפות את הראש. שטפו את הראש על ידי טפטוף זהיר של 10 µL של docos phosphate buffered saline או DPBS בקצה הראש, ולאחר מכן השתמשו בנייר Kimwipe כדי לייבש את הראש. חזרו על הליך זה חמש פעמים לאחר שטיפה עם DPBS בריכוז של 1 mg/mL.Avid בתמיסה. הוספה בטיפות מעל לקצה. יש להמתין חמש דקות לאינקובציה של הקצה לאחר ציפוי ה-avadon.שטפו את הקצה חמש פעמים נוספות ב-DPBS. לאחר מכן, בצעו קישור צולב של פיברונקטין ביוטינילי (biotinylated fibronectin) על ה-avadon על ידי הוספה של תמיסה בריכוז של 1 mg/mL. טפטפו את התמיסה על הקצה והדגירה למשך חמש דקות.לבסוף, שטפו את הקצה שוב חמש פעמים ב-DPBS והשאירו את הטיפה האחרונה על הקצה. לאחר הכנת הקצה, התקינו את הקצה על סורק a FM. לאחר התקנת קצה ה-a FM, הניחו חצאית סיליקון מגינה מסביב למחזיק.לאחר מכן, הגדירו את המיקרוסקופ לצפייה בווידאו. בשלב הבא, מרכזו את קצה ה-FM במרכז שדה הראייה. הגדירו את המנוף האופטי על ידי מיקום קרן הלייזר בקצהו של הקנטיליוור.לאחר מכן, החליפו לעדשה בעלת ההגדלה הגבוהה המתאימה לדימוי של תא בודד. לאחר מכן, הביאו לשדה הראייה את התא, אשר יעבור גירוי מכני, ובחרו את המיקום שבו קצה ה-AFM אמור לנחות על פני שטח התא. לבסוף, הורידו את קצה ה-AFM עד שייגע בתא הספציפי.לאחר הבאת החוד במגע עם התא, המתינו כ-20 דקות. המתנה זו מאפשרת היווצרות של הדבקה מוקדית (focal adhesion) חזקה בנקודת המגע של ה-FM על פני התא. לאחר תקופת ההמתנה, ניתן להתחיל בהליך הגירוי המכני כהכנה לניסוי הגירוי המכני.עברו ממצלמת הווידאו למצלמת E-M-C-C-D כדי לאפשר צפייה בתאים הפלורסצנטיים לצורך הדמיה. לאחר מכן, רכשו תמונה ראשונית של התא במצב מנוחה. השתמשו במיקרוסקופיה בעלת דיסק מסתובב ובמיקרוסקופיה ווקאלית (vocal microscopy) להדמיות של שלד התא (cytoskeleton) לאורך גוף התא.לעומת זאת, השתמש ב-turf כדי להדמיא הידבקויות מוקדיות (focal adhesions) לצורך גירוי התא. השתמש בקניסול (cantilever) כדי להפעיל תנועה עולה מבוקרת במדרגות בדידות מדי שלוש עד חמש דקות. במהלך רכישת נתוני ה-A FM, חשוב שהמפעיל ינטר ללא הרף את המתח של מיקום ה-Z piso כדי לקבוע את התזמון הנכון עבור המוט האנכי.במקביל לרכישת נתוני FM, הקליטו תמונה קונפוקאלית או תמונת Turf של התא לאחר כל מתיחה אנכית באמצעות תוכנת slide book. לבסוף, הוציאו את קצה ה-FM מהתא עם סיום ניסוי הגירוי. תא שריר חלק כלי דם שעבר טרנספקציה עם actin MRFP ו-vcul.ה-GFP צולם באמצעות FM לפני השטח האפיקלי של התא. אותו תא צולם באמצעות turf לפני השטח הבזאלי של התא. כאן שתי התמונות מוצגות בחפיפה.תמונה של אותו תא נרכשה גם באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם דיסקה מסתובבת (spinning disc confocal) לאורך גוף התא, והיא מוצגת כהשלכה מקסימלית (maximum projection) של ערימה תלת-ממדית. נראית חפיפה טובה בין תמונות ה-A FM ותמונות ה-spinning disc Confocal. תא שריר חלק של כלי דם שטרנספקט עם actin MRFP עבר גרייה מכנית על ידי ה-A FM ודגימה תמונית באמצעות מיקרוסקופיית spinning disc confocal.השגיאות מעידות על סיבי אקטין המראים ארגון מחדש ניכר בעקבות גירוי FM. חלק מסיבי האקטין פולימריזים בעוד שאחרים דה-פולימריזים כתוצאה מהגירוי המכני, וסיבי אקטין אחרים מתקבצים יחד. בשל ארגון מחדש של האקטין, הרגשנו להראות לכם כיצד לגרות מכנית תרבית תאים חיה באמצעות EFM תוך כדי הקלטה בו-זמנית של סידור מחדש של ה-CY באמצעות שיטות דימיון אופטי.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי ניסוי FM הוא רועש ורגיש ביותר. זהו כל הפרוצדורה. תודה שצפיתם ובהצלחה עם המדידות שלכם.

live-cell-response-to-mechanical-stimulation-studied-integrated

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הרבייה מכאנית מושרה גירוי סיד גל בmonolayers הסלולרי: דוגמה לתאי אנדותל קרני שור

מסמך זה מדגים פרוטוקול כדי לאפיין את התכונות מכאניות של תאי חיים באמצעות microindentation באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM).

מדידת התכונות המכאניות של תאי חיים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

פרוטוקול הדמיה חדשני פותח באמצעות מפעיל מכני מונע מנוע מותאם אישית כדי לאפשר מדידה של תגובות בזמן אמת למתח מכני בתאים חיים. רלוונטית למכניוביולוגיה, המערכת יכולה ליישם זנים של עד 20% תוך שהיא מאפשרת הדמיה כמעט בזמן אמת עם מיקרוסקופ כוח קונפוקלי או אטומי.

הדמיה של תא חי במהלך מכאני למתוח

כאן נתאר שיטות להערכת הסלולר בתגובה חריפה גירוי מכני. ב וזמינותו מבוסס מיקרוסקופיה, אנו בוחנים לוקליזציה של ביולוגיים שכותרתו fluorescently בעקבות גירוי קצרה עם הטיה זרימה. אנחנו גם בדיקת ההפעלה של חלבונים שונים עניין בתגובה חריפה גירוי מכני מבחינה ביוכימית.

הערכה של Dictyostelium discoideum בתגובה חריפה גירוי מכני

כלים חדשים למחקר mechanobiology יש צורך להבין כיצד מכאניים מפעילה מסלולים ביוכימיים, מעורר תגובות ביולוגיות. כאן, אנחנו ראווה שיטה חדשה עבור סלקטיבית גירוי מכני של חיות קיבוע עם מלכודת microfluidic ומאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של תגובות הסלולר.

שימוש בהתקן מיקרופלואידיקה גירוי מכני, רזולוציה גבוהה הדמיה של C. elegans

באמצעות התקן שתוכנן בעבר כדי להחיל זן מכני לתאים חסיד, נייר זה מתאר גיאומטריה תת שכבה מחדש מכשיר מותאם אישית עבור ברזולוציה גבוהה תא יחיד הדמיה של תאים מתוחים עם המטרה טבילה 100x שמן.

ברזולוציה גבוהה הדמיה של דינמיקה גרעינית בתאים חיים תחת מתיחה Uniaxial המתח

אנו מציגים פרוטוקול לפונקציונליזציה של מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) התלויה מנופים עם תא T יחיד וחלקיק חרוז למחקרים אימונולוגיים. הליכים לחקור בודד זוג תא תא דנדריטי כריכה על ידי AFM ולפקח על התגובה התאית בזמן אמת של מקרופאגים לחלקיק אחיד אחד על ידי AFM עם הדמיה פלואורסצנטית מוצגים.

הפונקציונליזציה של מיקרוסקופ כוח אטומי מנופים עם תאים חד-טי או חלקיק יחיד לספקטרוסקופיית של כוח בודד אימונולוגיים

כוחות מכניים חשובים לשליטה בהעברת תאים. פרוטוקול זה מדגים את השימוש של הידרוג'לים אלסטיים שיכולים להיות מעוותים באמצעות מיקרופיפטה זכוכית מיקרומניפולציה כדי לגרות תאים עם מעבר קשיות מקומי כדי לעורר שינויים במבנה התא והגירה.

מערכת בודדת של תא להערכת בקרה מכנית של התנועה הסלולרית ואירועי איתות קשורים

להלן הפרוטוקול של טכניקת קונפוקל, המשלבת מיקרוסקופיה של כוח קונפוקלי ואטומי לפלטפורמת מכשיר יחיד. Conpokal מספק תא זהה, אותו אזור, ליד הדמיה קונפוקאלית בו זמנית אפיון מכני של דגימות ביולוגיות חיות.

ליד סריקת לייזר בו זמנית מיקרוסקופיה קונפוקל וכוח אטומי (Conpokal) על תאים חיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקור את התכונות המכניות התאיות של תאי זברה עובריים מבודדים בכליאה תלת מימדית עם מדידת כוח ישירה על ידי מלכודת אופטית.

מדידות כוח ישירות של מכניקה תת-תאית בכליאה באמצעות פינצטה אופטית

מאמר זה מתאר פרוטוקול לאפיון מכני של ספרואידים חיים בתוך מטריצה תלת-ממדית באמצעות מיקרוספקטרוסקופיית ברילואין. שיטה אופטית מלאה זו מאפשרת ויזואליזציה ספרואידית ברזולוציה מיקרוסקאלית ותכונות מכניות כמותיות. גישה זו משפיעה על פנוטיפינג מכני; לדוגמה, קביעת מצבים פתולוגיים של ספרואידים גידוליים בתוך מיקרו-סביבה תלת-ממדית.

מיפוי מכני של ספרואידים באמצעות ספקטרוסקופיית ברילואין

למד כיצד לחקור תגובות תאים חיים לגירוי מכני באמצעות מיקרוסקופ משולב אופטי אטומי. השיטה מאפשרת תיעוד בזמן אמת של ארגון מחדש של ציטוסקלטין האקטין בתאים.

תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית

גלה סרטונים נוספים