Name: זיהוי גנים Dysregulated מושרה על ידי וירוס ההרפס הקשורים סרקומה של קפוסי (KSHV) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: למדו טכניקת תיוג כפול לזיהוי חלבונים ויראליים ותאיים ברקמת סרקומה של קפוסי באמצעות אימונוהיסטוכימיה. השיטה מאפשרת זיהוי גורמי תא מארח מושרים על ידי KSHV ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ג&#39;יימס EK הילדרת, Meharry Medical College, לעצתו וסקירה של כתב היד הזה. אנו מודים גם דיאנה Marver לעריכה של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי ונדרבילט Meharry המרכז לחקר האיידס (NIH מענק AI054999 P30-05); המרכז לחקר בריאות איידס פערים, NIH מענק 5U54 RR019192-05; Meharry המרכז למחקר קליני, NIH גרנט P20RR011792, ועל ידי NIH מענק P01 CA113239. DJA מומן בחלקו על ידי מענקים ממרכז טייס ואנדרבילט-Meharry לאיידס מחקר (כפר) והמרכז Meharry למחקר קליני (CRC).

<ol><li>Sitas, F., Newton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma+in+South+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst+Monogr%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma in South Africa.</a> J Natl Cancer Inst Monogr. 28, 1-4 (2001).</li>
<li>Moore, P. S., Chang, Y. Kaposi's sarcoma associated herpesvirus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoore%2C+PS+%22Field%27s+Virology%22">Field's Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia, PA. 2803-2833 (2002).</li>
<li>Chang, Y., Cesarman, E., Pessin, M. S., Lee, F., Culpepper, J., Knowles, D. M., Moore, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-associated+Kaposi%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma.</a> Science. 266, 1865-1869 (1994).</li>
<li>Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P., Said, J. W., Knowles, D. M., M, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-related+body-cavity-based+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas.</a> N Engl J Med. 18, 1186-1191 (1995).</li>
<li>Cesarman, E., Knowles, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%3A+a+lymphotropic+human+herpesvirus+associated+with+Kaposi%27s+sarcoma%2C+primary+effusion+lymphoma%2C+and+multicentric+Castleman%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Diagn+Pathol%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: a lymphotropic human herpesvirus associated with Kaposi's sarcoma, primary effusion lymphoma, and multicentric Castleman's disease.</a> Semin Diagn Pathol. 14, 54-66 (1997).</li>
<li>Chiou, C. J., Poole, L. J., Kim, P. S., Ciufo, D. M., Cannon, J. S., ap Rhys, C. M., Alcendor, D. J., Zong, J. C., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+gene+expression+and+a+transactivation+function+exhibited+by+the+vGCR+%28ORF74%29+chemokine+receptor+protein+of+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus.</a> J Virol. 76, 3421-3439 (2002).</li>
<li>Staskus, K. A., Zhong, W., Gebhard, K., Herndier, B., Wang, H., Renne, R., Beneke, J., Pudney, J., Anderson, D. J., Ganem, D., Haase, A. T., T, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+gene+expression+in+endothelial+%28spindle%29+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus gene expression in endothelial (spindle) tumor cells.</a> J Virol. 71, 715-719 (1997).</li>
<li>Alcendor, D. J., Zhu, W. Q., Desai, P., Vigil, H. E., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KSHV+downregulation+of+galectin-3+in+kaposi%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">KSHV downregulation of galectin-3 in kaposi's sarcoma.</a> Glycobiology. , (2009).</li>
<li>Ciufo, D. M., Cannon, J. S., Poole, L. J., Wu, F. Y., Murray, P., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+cell+conversion+by+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%3A+formation+of+colonies+and+plaques+with+mixed+lytic+and+latent+gene+expression+in+infected+primary+dermal+microvascular+endothelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Spindle cell conversion by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: formation of colonies and plaques with mixed lytic and latent gene expression in infected primary dermal microvascular endothelial cell cultures.</a> J Virol. 75, 5614-5626 (2001).</li>
<li>Long, E., Ilie, M., Hofman, V., Havet, K., Selva, E., Butori, C., Lacour, J. P., Nelson, A. M., Cathomas, G., Hofman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LANA-1%2C+Bcl-2%2C+Mcl-1+and+HIF-1alpha+protein+expression+in+HIV-associated+Kaposi+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%22%5BJournal%5D)">LANA-1, Bcl-2, Mcl-1 and HIF-1alpha protein expression in HIV-associated Kaposi sarcoma.</a> Virchows Arch. 2, 159-170 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

שיטות השתמשו בדוח זה יכול להתבצע במגוון רחב של הגדרות מעבדה. הם דורשים ציוד מיוחד או גישה למתקני הגרעין. אמצעי זהירות נאות יש לנקוט כאשר עושים ניסויים מעורבים גורמי מחלה ויראלית מדבקת כמו KSHV אשר עשויה לדרוש את השימוש ברמה biosaftey 3 (BSL-3) המתקנים. רכישות רקמות חייב להיות מאושר על ידי הלוחות המתאימים סקירה מוסדיים (IRBs). מתודולוגיות אלה ביחד יכולים להוות בסיס לזיהוי גנים dysregulated בביטוי במבחנה ל...

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>05-0001DJ</td><td></td></tr><tr><td>TPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>נתרן בוטיראט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19364 (FLUKA)</td><td></td></tr><tr><td>מדיום EBM-2</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3156</td><td>+ תוסף ערכות כדורים </td></tr><tr><td>תאי DMVEC (HMVEC)</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC2543</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי</td><td>Hyclone</td><td>SH30066.03</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומייצין</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות תא (Chamber slides)</td><td>Nalge Nunc international</td><td>154461</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן חד-סגולי (Mab) ל-LANA של KSHV</td><td>Vector Laboratories</td><td>VP-H913</td><td>דילול 1:50/IFA</td></tr><tr><td>נוגדן פוליקלונלי (pAb) לעז נגד Galectin-3</td><td>R&amp;R&D Systems</td><td>AF1154</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני מדונקינג נגד עיזים המסומן ב-FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-095-1</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן שערים נגד עיזים ל-Rho (Donkey-anti-goat Rho)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-295-003</td><td>דילול 1:100/IFA</td></tr><tr><td>תוכני הלבשה</td><td>Vector Laboratories</td><td>H 1500</td><td>Vectashield עם DAPI</td></tr><tr><td>ערכה לבדיקת חלבון BCA</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>ניטרוצלולוז </td><td>Bio-Rad</td><td>161-0112</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן חמור נגד עיזים משתף (Donkey-anti-goat-conj.) </td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC 2020</td><td></td></tr><tr><td>מצע לבלוואן (Western substrate)</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-rabbit-anti goat</td><td>Dako</td><td>305-065-045</td><td></td></tr><tr><td>AP-Strepavidin conj.</td><td>Dako</td><td>K 0492 (ערכה)</td><td></td></tr><tr><td>סט נטול RNase ו-DNase</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>MJ Mini Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>PTC-1148C</td><td></td></tr><tr><td>ביו-פוטומטר</td><td>Eppendorf</td><td>952000006</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה RC 6 Plus</td><td>Sorvall, Thermo Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה Coulter Optima L-90K</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>392052</td><td></td></tr><tr><td>מערכת גילוי Real Time PCR מדגם MYiQ iCycler</td><td>Bio-Rad</td><td>170-9770</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנציה TE 2000S</td><td>Nikon Instruments</td><td>TE2000S</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E 200</td><td>מכשירי Nikon</td><td>E 200</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה Sorvall Legend RT</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>75004377</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי גנים dysregulated מושרה על ידי וירוס ההרפס הקשורים סרקומה של קפוסי (kshv)

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

נכון לעכשיו KS הוא השולט ביותר HIV / איידס ממאירות הקשורות בדרום אפריקה, ולכן את העולם. 1,2 הוא מאופיין כגידול angioproliferative לתאי אנדותל של כלי הדם ומייצר נדיר מחלות B תא lymphoproliferative בצורה של לימפומה השתפכות pleural (פל) וכמה צורות של המחלה multicentric של קסלמן. 3-5 רק 1-5% של תאים KS נגעים תומכים באופן פעיל שכפול ממס של קפוסי סרקומה הקשורים של וירוס ההרפס (KSHV), סוכן האטיולוגית הקשורים KS, וברור כי גורמים הסלולר חייב אינטראקציה עם גורמים ויראליים בתהליך של oncogenesis התקדמות הגידול. 6,7 זיהוי מארח גורם רומן הגורמים אשר תורמים KS הפתולוגיה חיונית לפיתוח סמנים פרוגנוסטיים להתקדמות גרורות הגידול, כמו גם לפיתוח הרפוי הרומן לטיפול KS . 8 הפרטים הווידאו המלווה את השיטות בהם אנו משתמשים כדי לזהות את התא המארח הגן ביטוי בתוכניות להשתנות עורי לתאי אנדותל כלי הדם (DMVEC) לאחר ההדבקה KSHV ועל רקמת הגידול KS. 9 לאחר גנים dysregulated מזוהים על ידי ניתוח microarray, שינויים בביטוי החלבונים הם אושר על ידי immunoblot ו immunofluorescence שכותרתו כפול. שינויים בביטוי של גנים תעתיק dysregulated הם אישרו במבחנה על ידי כמותי תגובה בזמן אמת שרשרת פולימרז (qRT-PCR). אימות של הממצאים במבחנה באמצעות ארכיוני KS רקמת הגידול מתבצע גם על ידי immunochemistry שכותרתו כפולה microarrays רקמות. 8,10 הגישה שלנו זיהוי גנים dysregulated ב microenvironment רקמת הגידול KS יאפשר פיתוח של במבחנה ולאחר מכן במערכות מודל עבור vivo גילוי והערכה של פוטנציאל טיפולית חדשנית לטיפול KS.

תא גורמים מארח לשחק תפקיד קריטי בהקמת ותחזוקה של סרקומה של קפוסי (KS). אנו המתאר שיטות לזיהוי התא המארח גורמים להשתנות KSHV תאים הנגועים DMVEC, וכן רקמת הגידול KS. גנים נייד שינו ידי וירוס תשמש יעד פוטנציאלי (ות) עבור הרפוי הרומן.

זיהוי גנים Dysregulated מושרה על ידי וירוס ההרפס הקשורים סרקומה של קפוסי (KSHV)

נכון לעת זו, KS היא הממאירויות השכיחה ביותר הקשורה ל-HIV/AIDS בדרום אפריקה, ובהתאם, בעולם.1,2 היא מאופיינת כתהליך אנגיו-פרוליפרטיבי...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדגים סימון כפול של רקמת גידול של סרקומה של קפושי (Kaposi's sarcoma) באמצעות אימונוהיסטוכימיה לחלבונים של הווירוס ותאי המארח. מטרה זו מושגת תחילה על ידי חשיפת אנטיגנים באמצעות חום. השלב השני של הפרוצדורה הוא יישום של נוגדן ראשוני המשורשר לביוטין.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא הוספת קונג'וגט האנזים strep din. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא הוספת סובסטרט האנזים לרקמה לצורך פיתוח הצבע. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את המיקום של חלבוני הויראלי ושל תאי המארח ברקמת הגידול באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית.שיטה זו יכולה לספק תשובות לשאלות מפתח בתחום הפתולוגיה, כגון זיהוי גורמים זיהומיים וכן גנים תאיים שביטוים השתבש באותה דגימה. תחת מapay מנדף, הנח עד שמונה שקופיות chem eight עם חתכים של 5 µm של רקמה מקובעת ומוטמעת בפראפין בתוך צנצנת coplan עם xylene. הדגר במשך 10 דקות כדי להסיר את הפראפין ולהכין את השקופיות לצביעה אימונוהיסטוכימית כפולה.בצעו רהידרטציה לרקמה בסדרת סריות של תמיסות אתנול בריכוזים של 100%, 95% ו-70% למשך חמש דקות בכל שלב. העבירו את השקופיות למים למשך 10 דקות לפחות לפני חשיפת האנטיגן (antigen unmasking), הידועה גם כשחזור אנטיגן (antigen retrieval). השקיעו את השקופיות בתוך מיכל פלסטיק המכיל תמיסה שהוכנה טרי במטמפר בטמפרטורה של 95 °C.חמם באמבט מיקרוגל בופר ציטראט 50 millimolar כדי לשמור על רתיחה בטמפרטורה של 95 °C למשך 15 דקות. העבר מיד את השקופיות לכלי שטוח מלא במים מזוקקים בטמפרטורת החדר. העבר את השקופיות לכלי Coplan נקי מלא בתמיסת כיבוי (quenching solution) שהוכנה טרם השימוש.הדגרה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי לנטרל את הפרוקסידאז האנדוגני. שטיפה של שלוש פעמים ב-1X PBS בטמפרטורת החדר, למשך חמש דקות בכל שטיפה. הוצאת השקופיות משטיפת ה-PBS וניעור להסרת העודפים; כיסוי הרקמה ב-200 µL של תמיסת חסימה קרה (בקרח) וכיסוי ברצועת פראפין למניעת התייבשות.הניחו את השקופיות בתא לחות והדגירו בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. הסירו את פס paraffin ונערו שאריות של תמיסת החסימה מהשקופית, ולאחר מכן הוסיפו 50 עד 100 µL של נוגדן ראשוני קר מאוד כנגד KSHV Lana המדולל בבופר חסימה כדי לכסות את הרקמה. כסו שוב את הרקמה עם פס paraffin חדש והדגירו בתא הלחות למשך שעה עד שעתיים.שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-1X PBS למשך חמש דקות. לאחר כל שטיפה, הוסיפו 50 עד 100 µL של נוגדן שני ביוטינילי (biotinylated secondary antibody) המדולל ב-1X PBS, והדגירו בתא לח במטמפר בטמפרטורת החדר למשך 30 עד 45 דקות. בזמן הדגירת השקופיות, הכינו את הסטראפטווידין המצומד לפרוקסידאז.בעזרת ערכת daco animation duet, הוסיפו 10 µL מתמיס A ל-1 mL של 1X PBS בתוך פרונטה של 1.5 mL וערבבו בעזרת וורטקס. הוסיפו 10 µL מתמיס B, ערבבו שוב בוורטקס והדרימו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. שטפו את השקופיות ב-1X PBS שלוש פעמים, למשך חמש דקות בכל שטיפה.כפי שנעשה קודם לכן, הוסיפו לשקופיות 100 עד 200 µL של streptavidin המשורשר ל-horseradish peroxidase. דגרו בטמפרטורת החדר בתא לחה למשך 30 עד 45 דקות. שוב, שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-1X PBS למשך חמש דקות לכל שטיפה.חמש דקות לפני סיום השטיפה, הכניסו טבליות DAB אחת למבחנה קונית של 50 milliliter המכילה 20 milliliters של XPBS אחד ו-25 microliters של 3% Hydrogen peroxide. סננו את תמיסת ה-DAB באמצעות מסנן מזרק של 0.45 micrometer, כאשר עובדים עם שמיכה אחת בכל פעם. כסו את הרקמה ב-one milliliter של תמיסת DAB תחת תאורה של שדה בהיר (brightfield) במיקרוסקופ אור.עקוב אחר התפתחות הצבע עבור KSHV Lana בתאים נגועים עד להשגת התפתחות הצבע הרצויה. טבול את השקופיות במים מזוקקים למשך חמש דקות כדי לעצור את התגובה לצורך סימון כפול. התחל מחדש את תהליך חשיפת האנטיגן (antigen unmasking) בבופר ציטראט בטמפרטורה של 95 °C כפי שמתואר בטקסט הנלווה, ובצע צביעה.באותו הליך, קבעו את הרקמה באמצעות תמיסת קיבוע PerMount וכסו בכיסוי זכוכית לצילום תחת תאורה של שדה בהיר. לעיתים קרובות רצוי לשלוח דגימות בודדות רבות הטמיעות בבלוקים של פאראפין כדי שיידגמו, ויסודרו במערך רקמות מזעור (Tissue Microarray) לצורך ניתוח סטטיסטי להלן. תאים חומים החיוביים לחלבון התאי pcam-1 (CD31), המסומנים בחץ אפור, מצטברים סביב כלי דם.תאי דם אדומים חיוביים לחלבון הויראלי. חצים שחורים מסמנים תאים נגועים בנגיף ההרפס הקשור לסרקומה של קפוזי. כאן מוצגת הגדלה נמוכה יותר של תאים חומים חיוביים לחלבון התאי pcam.CD 31 אחד מסומן בחצים אפורים באזור שסביב כלי דם. תאים אדומים חיוביים לחלבון הוויראלי. Lana המסומן בחץ שחור מצביע על תאים שנדבקו לנגיס הרפס הקשור לסרקומה של קפושי.כאן מוצגת ביופסיה של רקמת גידול KS על גבי מערך מיקרו-רקמות (tissue microarray), כאשר תאים חומים הם חיוביים לחלבון ויראלי. החצים מצביעים על תאים שנדבקו לנגיף ההרפס הקשור לסרטן קפושי (kaposi's sarcoma associated herpes virus), ואשר מראים היווצרות של תאי כישק (spindle cells). כאן מוצגת ביופסיה נוספת של רקמת גידול KS על גבי מערך מיקרו-רקמות, כאשר תאים חומים הם חיוביים לחלבון ויראלי.Lana מצביעה על תאים שנדבקו בנגיף ההרפס המשויך לסרקומה של קפושי עם דרגה גבוהה של pembentukan תאי כישכסור (spindle cells). לאחר צפייה בסרטון זה, תשיגו הבנה טובה של אופן ביצוע אימונוהיסטוכימיה עם סימון כפול ברקמות מקובעות בפורמלין ומוטמעות בפראפין. בעת ביצוע ניסוי זה, חשוב מאוד לעקוב אחר התפתחות הצבע תחת המיקרוסקופ ולהפסיק את התגובה באמצעות מים.

identifying-dysregulated-genes-induced-kaposi-s-sarcoma-associated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי תפקידי מפתח של מולקולות איתות מארחת בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס מודל, גמא 68 ההרפס (γHV68). ניצול זני עכבר מהונדס גנטי ופיברובלסטים עובריים לשכפול ממוסס γHV68, הפרוטוקול מאפשר גם אפיון פנוטיפי וחקירה מולקולרית של אינטראקציות וירוסים מארחים בשכפול ממוסס נגיפי.

אינטראקצית מארח וירוס ביתור בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס דגם

שיטה של ​​מולקולות דנ"א בודדות התבוננות בתאים חיים מתוארת. הטכניקה מתבססת על הכריכה של חלבון מתויג fluorescently lac repressor לאתרי קישור מהונדס לתוך הדנ"א של עניין. שיטה זו יכולה להיות מותאמת למעקב DNAs רקומביננטי רב בתאי חיים לאורך זמן.

ניטור כפול פלסמיד בתאי יונקים חיים דרך מספר דורות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי

רטרווירוסים אנושיים אנדוגני (HERV), אשר תופסים 8% של הגנום האנושי, לשמור על יכולות קידוד נדירות אבל מאה אלף חזרות ארוכות מסוף (LTRs). Microarray Affymetrix מותאם אישית תוכנן כדי לזהות ביטוי לוקוס HERV הבודד והיה בשימוש ברקמות סרטן ערמונית כהוכחה של מושג למחקרים קליניים בעתיד.

זיהוי מבוסס microarray של פרט HERV לוקוסים ביטוי: בקשה לגילוי סמן ביולוגי בסרטן הערמונית

אנו מתארים פרוטוקול למדוד את ייצור ציטוקינים אנטי בעכברים נגועים בוירוס ההרפס מודל, וירוס ההרפס עכברי גמא 68 (γ HV68) הקשור-הדוק לההרפס של קפוסי האנושי הקשורים סרקומה (KSHV) ווירוס אפשטיין בר (EBV). ניצול זני עכבר מהונדס גנטי וfibroblasts העכבר העוברי (MEFs), אנחנו הערכנו את ייצור ציטוקינים אנטי גם in vivo לשעבר vivo. "בנייה מחדש" את הביטוי של מרכיבי חיסון מולדים בfibroblasts העוברי בנוקאאוט על ידי התמרה lentiviral, אנחנו עוד לאתר מולקולות חיסון מולדים ספציפיות ולנתח את אירועי איתות מפתח...

הביתור מולדת איתות חיסון בהתחמקות ויראלי של ציטוקין ייצור

הקמנו ניאון בפרוטוקול הכלאה באתרו לצורך זיהוי של גנום נגיף ה-DNA מתמשך בתוך סעיפי רקמות של מודלים של בעלי חיים. פרוטוקול זה מאפשר לימוד תהליך זיהום על ידי codetection של הגנום הנגיפי, מוצרי RNA שלו, וחלבונים נגיפיים או סלולריים בתוך תאים בודדים.

איתור של הגנום והתמלילים של וירוס ה-DNA מתמיד ברקמות עצבית על ידי פלורסנט באתרו הכלאת שילוב עם Immunostaining

סרקומה קפוסי (קאי אס) הוא גידול הנגרמת על ידי זיהום עם oncogenic וירוס ההרפס-8/KS ההרפס האנושי (HHV-8/KSHV). המודל התרבות תאי אנדותל המתואר כאן הוא לצורכיכם לימוד המנגנון שבאמצעותו KSHV המרות התאים המארחים.

מודל במבחנה עבור לימודי טרנספורמציה התאית על ידי ההרפס סרקומה קפוסי

מפעלים תעתיק ויראלי הם מבנים בדידים מועשר עם הסלולר RNA פולימראז II כדי להגדיל את שעתוק גנים ויראליים במהלך הפעלה מחדש. . הנה, מתוארת שיטה לאיתור אתרים של פעיל תעתיק כרומטין ויראלי במרחב תלת-ממדי גרעינית על ידי שילוב של immunofluorescence מכתים, בחיי עיר RNA הכלאה.

הדמיה תפקודית של מפעלי שעתוק ויראלי באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות תלת-ממד

כאן נתאר פרוטוקול להעסקת תפוקה גבוהה ההקרנה RNAi לחשוף את מטרות המארח יכול להיות מניפולציות כדי לשפר את הטיפול וירוס oncolytic, במיוחד rhabodvirus וטיפול וירוס vaccinia, אבל ניתן בקלות להתאים oncolytic אחרים וירוס פלטפורמות או לגילוי גנים המארח לווסת את שכפול וירוס בדרך כלל.

ברמת הגנום RNAi ההקרנה כדי לזהות גורמים מארח לווסת את הטיפול Oncolytic וירוס

אנו מתארים פרוטוקול ניצול הקרינה היברידיזציה באתרו (דג) כדי להמחיש RNAs מרובים של הרפס בתוך תאים אנושיים נגועים ליקיה, או בהשעיה או חסיד. פרוטוקול זה כולל כימות של זריחה המייצרת יחס נוקלאוציטוסמטי וניתן להארכה להדמיה סימולטני של חלבונים מארחים ונגיליים עם immunofluorescence (IF).

פלואורסצנטית כמותי באתרו היברידיזציה (דג) ו Immunofluorescence (IF) של מוצרים גנטיים ספציפיים בתאים שנדבקו KSHV

פרוטוקול זה מתאר מערכת חוץ גופית למודל זיהום ליטי דה נובו של נגיף ההרפס הקשור לסרקומה של קפוסי באמצעות נגיפים שמקורם ב-BAC16. השיטה מאפשרת לחקור שכפול והפצה מוקדמים של הנגיף. ייצור הנגיף הזיהומי מכומת על ידי בדיקות יחידות זיהומיות מבוססות GFP ו-PCR בזמן אמת של גנומים נגיפיים עטופים.

ביסוס וכימות של זיהום ליטי דה נובו על ידי וירוס הרפס הקשור לסרקומה של קפוסי נטול תאים

למדו טכניקת תיוג כפול לזיהוי חלבונים ויראליים ותאיים ברקמת סרקומה של קפוסי באמצעות אימונוהיסטוכימיה. השיטה מאפשרת זיהוי גורמי תא מארח מושרים על ידי KSHV ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות.

זיהוי גנים Dysregulated מושרה על ידי וירוס ההרפס הקשורים סרקומה של קפוסי (KSHV)

גלה סרטונים נוספים