תיוג DiOLISTIC של הנוירונים מפני מכרסמים שאינן פרוסות המוח האנושי הפרימאטים

שמי גייל סיבל ואני עוקבת דוקטורט במעבדה של ד"ר ורוניקה אלבארס במכון הלאומי להשפעות האלכוהול והאלכוהוליזם. עבודה זו בוצעה בשיתוף פעולה עם ד"ר קתלין גרנט ואנדרו וואו במרכז הפרימטים של אורגון ועם ד"ר ג'יימס דני מאוניברסיטת וייק פורסט, שסיפקו את רקמות הפרימטים שאינם בני אדם ששימשו במחקר זה. המטרה הכללית של הליך זה היא להחדיר צבעים פלואורסצנטיים לנוירונים ולסמן חתוכי מוח ממינים שונים, כגון מכרסמים ופרימטים בכל גיל.

לצורך חקר המורפולוגיה של דנדריטים וקוצים דנדריטיים, הדבר מבוצע תחילה על ידי ציפוי של Ts וחרוזיים בצבע ליפופי כגון D eye. השלב השני של הפרוצדורה הוא ריפוד של צינורית בחרוזיים מצופים ב-D eye וחיתוכה לחלקים קטנים המשמשים כ"קליעים" עבור מערכת ה-Helios gene gun. השלב השלישי של הפרוצדורה הוא ירי חרוזיים מצופים ב-D eye לתוך פרוסות מוח באמצעות ה-gene gun.

השלב האחרון של הפרוצדורה הוא רשות, שכן ניתן לשלב את ה-stylistics עם צביעה אימונוהיסטוכימית כדי למקם בו-זמנית סמנים אחרים. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות סימון פלואורסצנטי דליל של נוירונים המתאים לדימוי ברזולוציה גבוהה, כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית או דו-פוטונית, ולמחקר של הסתעפות דנדריטית ומורפולוגיה של קוצים דנדריטיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות שלנו הוא שניתן להחיל את ה-stylistics על חתכי מוח מבעלי חיים מכל המינים, הגילאים והגנוטיפים.

ניתן להשתמש בשיטה זו בשילוב עם צביעה אימונוהיסטוכימית, והיא מניבה סימון פלואורסצנטי דליל המתאים למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. לפני הכנת החרו지를, יש לצפות חרוזי טונגסטן בצבע ליפופילי במנדף כימי, ביחס של 450 milliliters של מתילין כלוריד ל-13.5 milligrams של צבע ליפופילי, כדי להגיע לריכוז סופי של 30 milligrams per milliliter. קחו מבחנת Eppendorf אחת המכילה 300 milligrams של חרוזי טונגסטן והוסיפו 300 microliters של מתילין כלוריד; פלפלו את התמיסה בעוצמה כדי לתלה מחדש את החרוזים וליצור תמיסה הומוגנית.

בכל סט כדורים נעשה שימוש ב-100 milligrams בלבד של חריזי טונגסטן; בצעו שאיבה ושחרור חוזר (pipetting up and down) כדי לשמור על החריזים תלויים, הוסיפו 100 milliliters של החריזים והצבע המומס על עלית זכוכית וערבבו אותם היטב. בעזרת טיפ של פפטה, הניחו לדגימה להתייבש לחלוטין באוויר עד שהחריזים יהפכו לאפור בהיר. הניחו פיסת נייר לבן ומודבק בשעווה נקייה מתחת לעלית, ובעזרת להב תער (racer blade) נקי, גרדו את החריזים מהעלית וגרסו אותם לאבקה דקה עבור כל צבע של הכדורים.

גרדו את החרוזים המצופים על נייר חלב (whey paper) והעבירו אותם באמצעות משפך לשפופרת קונית של 15 milliliter. הוסיפו שלושה milliliters של מים ובצעו סוניקציה במקלחת מים למשך 10 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לפרק לחלוטין גושים. גזרו 0.7 meters של צינור בצבע טורקיז עם חיתוך אלכסוני בקצה אחד, וחברו את הקצה השני למזרק של 12 milliliter באמצעות מתאם לצינור; מקמו את הקצה החופשי בשפופרת המכילה 10 milliliters של תמיסת polyvinyl perone או PVP בריכוז 10 milligram per milliliter, ושאבו את התמיסה באופן מלא דרך הצינור אל תוך המזרק.

יש לערבב את תמיסת החרוזיים ב-Vortex תוך כדי שאיבה עם המזרק כדי ליצור תערובת הומוגנית, תוך עבודה מהירה למניעת שקיעת החרוזיים, ולהעביר את התמיסה במלואה לתוך הפרו-טובמינג. יש להימנע מהחדרת בועות אוויר, שכן אלו ימנעו מהחרוזיים להיצמד לפרו-טובמינג בנקודה זו, תוך החזקת הפרו-טובמינג מתוח משני קצותיו. יש להטות אותו מצד לצד כדי להבטיח פיזור אחיד.

פזרו את החרו지를. הכניסו את הצינורית לתחנת ההכנה והמתינו 30 עד 60 שניות עד שהחרוזים ישקעו. השתמשו במזרק כדי לבצע את הפעולה באיטיות אך באופן חלק.

הסיר את המים כך שהחרוזים יישארו מאחור. נתק מיד את המזרק והתחל בסבב של הפנמיות. כוון את זרימת החנקן בתחנת ההכנה ל-4 עד 5 LPM יבש למשך 10 עד 20 דקות, עד שלא יראו יותר טיפות מים.

הסיר את הצינורית מתחנת ההכנה, חתוך את הקליעים לאורכים של 13 מילימטר באמצעות חותך הצינוריות כפי שניתן לראות; קליעים תקינים יהיו מצופים בשכבה אחידה ודקה של ערפל אפור בחלקם הפנימי. הנח את הקליעים בבקבוקוני סינצילציה עטופים בנייר כסף המכילים חומר מייבש כגון סידן סולפט אנहाइडרי. אחסן אותם בטמפרטורת החדר עד למועד הירי.

ניתן להשתמש בסימון Diic לצביעת נוירונים ברקמת מוח ממינים ובגילאים שונים, שנשמרו בשיטות שונות. הניחו פרוסות מוח שקובעו, לפני או אחרי הפריסה, לתוך בארות של פלטת 24 בארות.

שטפו את הפרוסות ב-PBS פעם אחת, ושוב 3 פעמים למשך חמש עד 10 דקות לכל שטיפה. שאבו את ה-PBS בעזרת פיפט והשתמשו במברשת ציור כדי למרכז את הפרוסה בבאר. הניחו פיסת מסנן של 3.0 micrometer בין שני מסכי הדיפוזיה המתכתיים בקצה מעטפת הקנה של רובה הגנים.

החזיקו את תותח הגנים כך שקצה ציפוי הקנה יהיה במרחק של 1.5 סנטימטרים מהדגימה. ירו את החרו지를 אל תוך הפרוסה בלחץ גז הליום של 120 עד 180 PSI. שטפו את הפרוסות במהירות שלוש פעמים עם 1X PBS כדי להסיר צבע עודף.

יש לוודא שפני השטח של הפרוסה שבה בוצעו היריים פונים כלפי מעלה במהלך כל שלבי העבודה עם הנוזלים. יש לאחסן את הפרוסות ב-PBS למשך שלוש עד שש שעות כדי לאפשר ל-DAI להתפשט לאורך הדנדריטים, תוך כיסוי ברדיל. מכיוון ש-DAI רגיש לאור, ניתן לבצע בשלב זה הרכבה של הפרוסות או להעביراً לצביעה נוספת עם נוגדנים כפי שפורט בסעיף הבא; כדי להמשיך בצביעה, יש להוסיף 300 עד 500 µL של תמיסת חדירה המכילה 0.01% TRITTON X 100 ב-XPBS לכל פרוסה, ולהדגיר בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות בדיוק.

הססירה את תמיסת החדירה מהבארות וחסמו את הפרוסות בתמיסה המכילה 10% goat serum ו-0.01% tritan X 100 ב-1X PBS; הדגירה תתבצע בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. הוסיפו לכל בארה 300 עד 500 µL של נוגדן ראשוני המדולל בתמיסת החסימה. הדגירה תתבצע בטמפרטורת החדר למשך שעה עד שעתיים או למשך הלילה, בהתאם לנוגדן. שטפו את הפרוסות שלוש פעמים ב-1X PBS למשך 5 עד 15 דקות לכל שטיפה, והססירה את התמיסה מהבאר.

הוסיפו 300 עד 500 µL של נוגדן משני מדולל בתמיסת חסימה לכל באר. שטפו ארבע פעמים עם 1X PBS למשך 5 עד 15 דקות לכל שטיפה כפי שבוצע קודם לכן, העבירו את הפרוסות לעל slides של זכוכית באמצעות תווך קיבוע פלואורסצנטי וכסו בכיסוי זכוכית (coverslip) של 18 על 18 מילימטר. הניחו לדגימות להתייבש במשך 6 עד 12 שעות בטמפרטורת החדר לפני איטום הקצוות בלק שקוף, ואחסנו בחושך או תחת כיסוי בטמפרטורה של 4 °C.

תמויות לדוגמה של חתכי מוח מסומנים מוצגות כאן. שני מאפיינים חשובים שיש לחפש הם תבנית סימון דלילה בהגדלה נמוכה והיכולת לזהות רכיבים תאיים בודדים. הכנה שגויה של ה-bullets או קיבוע יתר של הרקמה עלולים להוביל לסימון לקוי כפי שמוצג כאן.

טיפים לפתרון בעיות מסופקים בטקסט כאן. מוצגת תמונה קונפוקלית של נוירון מסוג TAL medium spinning ממוח של עכבר ודפוס הסניע הדנדריטי המורכב שלו. החיתוך האופטי המושג בעת שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשר בידוד של תאים בודדים מסומנים בתוך חיתוך הרקמה.

תמונות בהגדלה גבוהה מציגות מקטעי דנדריטים ממוח של מכרס וממוח של פרימט שאינו אדם. שימו לב לעוצמה הגבוהה של הצביעה הפלואורסצנטית שהושגה בטכניקה זו, אשר מובילה לדוקרנים דנדריטיים מוגדרים היטב כאשר משלבים ICS עם צביעה אימונוהיסטוכימית. תמונה זו מראה דוגמה לקולוקליזציה של סימון D eye באדום עם צביעה אימונוהיסטוכימית לביטוי GFP בירוק.

תמונה זו מתאימה לחתך של SAL מעכבר טרנסגני המבטא את החלבון הפלואורסצנטי GFP תחת הפרומוטור של קולטן הדופמין D1. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן הכנת ה-pellets והשימוש ב-Jing gun כדי לסמן באופן דליל נוירונים באמצעות צבעים פלואורסצנטיים. טכניקה זו מאפשרת ויזואליזציה ברורה של מורפולוגיית הנוירונים ובחינה של הסתעפויות דנדריטיות וקוצים.