תיוג DiOLISTIC של הנוירונים מפני מכרסמים שאינן פרוסות המוח האנושי הפרימאטים

אנו מדגימים את השימוש באקדח הגן להציג צבעי ניאון, כגון DiI, לתוך הנוירונים פרוסות המוח של מכרסמים פרימטים שאינם בני אדם בגילאים שונים. במקרה הספציפי הזה, אנו משתמשים בעכברים בוגרים (3-6 חודשים) וקופים cynomologus מבוגר (9-15 שנים). טכניקה זו, שתוארה לראשונה על ידי במעבדה של ד"ר ליכטמן (גן

שמי גייל סיבל ואני פוסט-דוקטורנטית במעבדה של ד"ר ורוניקה אלווארז במכון הלאומי להתמכרות לאלכוהול ואלכוהוליזם. עבודה זו בוצעה בשיתוף פעולה עם ד"ר קתלין גרנט ואנדרו וואו ממרכז הפרימטים של אורגון וד"ר ג'יימס דין מאוניברסיטת ווייק פורסט, שסיפקו את רקמת הפרימטים הלא אנושית ששימשה במחקר זה. מטרת השיפוץ של הליך זה היא להכניס צבעים פלואורסצנטיים לתאי עצב ולתייג קטעי מוח ממינים שונים כגון מכרסמים ופרימטים בכל גיל.

לצורך חקר המורפולוגיה של דנדריטים וקוצים דנדריטיים, זה מושג על ידי ציפוי T וחרוזים בצבע ליפופילי כמו עין D. השלב השני של ההליך הוא ריפוד צינורות בחרוזים מצופים עין D ולחתוך אותם לחתיכות קטנות המשמשות ככדורים למערכת אקדח הגנים הליוס. השלב השלישי של ההליך הוא לירות חרוזים מצופים עין D לפרוסות מוח באמצעות אקדח הגנים.

השלב האחרון של ההליך הוא אופציונלי מכיוון שניתן לשלב סגנונות עם צביעה חיסונית כדי למקם בו זמנית סמנים אחרים. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות תיוג פלואורסצנטי דליל של נוירונים המתאימים להדמיה ברזולוציה גבוהה, כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית או שני פוטונים, וחקר הסתעפות דנדריטית ומורפולוגיה של עמוד השדרה הדנדריטי. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות שלנו הוא שניתן ליישם סגנונות על קטעי מוח של בעלי חיים מכל המינים, הגילאים והגנוטיפים.

ניתן להשתמש בו בשילוב עם צביעה חיסונית ומייצר תיוג פלואורסצנטי דליל המתאים למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה לפני הכנת כדורים. מצפים חרוזי טונגסטן בצבע ליפופילי במכסה אדים כימי ב-450 מיליליטר מתילן כלוריד ל-13.5 מיליגרם צבע ליפופילי לריכוז סופי של 30 מיליגרם למיליליטר. קח צינור קדם Eloqua אחד המכיל 300 מיליגרם של חרוזי טונגסטן והוסף 300 מיקרוליטר של מתילן כלוריד צינור אותו במרץ כדי להשעות מחדש את החרוזים וליצור תמיסה הומוגנית.

רק 100 מיליגרם של חרוזי טונגסטן משמשים לכל סט כדורים שמתנדנד למעלה ולמטה כדי לשמור על החרוזים תלויים, להוסיף 100 מיליליטר מהחרוזים ועין המות המומסת על שקופית זכוכית ולערבב אותם היטב. בעזרת קצה פיפטה, הניחו לייבוש מלא באוויר עד שהחרוזים הופכים לאפור בהיר. הניחו חתיכה נקייה של נייר לבן שעווה מתחת לשקופית בעזרת להב רייסר נקי לכל צבע של כדורים, מגרדים את החרוזים מהזכוכית, מחליקים וחותכים אותם לקוביות לאבקה דקה.

מגרדים חרוזים מצופים על נייר מי גבינה ומשפכים אותם לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. הוסף שלושה מיליליטר מים וסוניקט באמבט המים למשך 10 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לשבש היטב את כל הגושים. חותכים 0.7 מטר של צינורות צהבהבים עם זווית בקצה אחד ומחברים את הקצה השני למזרק של 12 מיליליטר באמצעות מתאם צינורות, מניחים את הקצה החופשי לתוך צינור המכיל 10 מיליליטר של 10 מיליגרם למיליליטר פוליוויניל פרון או תמיסת PVP, ומושכים את התמיסה לחלוטין דרך הצינור ולתוך המזרק.

מערבולת את תמיסת החרוזים תוך כדי שאיבה עם המזרק ליצירת תערובת הומוגנית הפועלת במהירות כדי למנוע משקעים של החרוזים, משוך את התמיסה לחלוטין לתוך הצינור. הימנע מהכנסת בועות אוויר, מה שימנע מהחרוזים להיצמד לצינור באותו מקום תוך החזקת הצינור מתוח משני הקצוות. הטה אותו מצד לצד באופן שווה.

מחלקים את החרוזים. הזינו את הצינור לתחנת ההכנה והניחו לחרוזים להתיישב למשך 30 עד 60 שניות. השתמש במזרק לאט אך חלק.

הסר את המים והשאיר את החרוזים מאחור. נתק מיד את המזרק והתחל לסובב את הצינור. התאם את זרימת החנקן בתחנת ההכנה לארבעה עד חמישה LPM יבש למשך 10 עד 20 דקות עד שטיפות מים כבר לא נראות לעין.

הסר את הצינור מתחנת ההכנה, חתוך כדורים לאורכים של 13 מילימטר עם חותך הצינורות שנצפה ועל כדורים טובים יהיה אובך אפור קלוש המצפה באופן אחיד את הפנים. הניחו את הכדורים בבקבוקוני נצנוץ עטופים בנייר כסף המכילים חומר ייבוש כגון סידן גופרתי נטול מים. אחסן אותו בטמפרטורת החדר עד שהוא מוכן לצילום.

ניתן להשתמש בתיוג Diic כדי לצבוע נוירונים ברקמת מוח ממינים וגילאים שונים ולשמר אותם בשיטות שונות. הניחו פרוסות מוח שקובעו לפני או אחרי החיתוך לבארות של 24. ובכן צלחת.

שטפו את הפרוסות ב-XPB S3 אחד במשך חמש עד 10 דקות בכל כביסה. פיפטה מה- PBS השתמש במכחול כדי למרכז את הפרוסה בבאר. הנח חתיכה של מסנן 3.0 מיקרומטר בין שני מסכי הדיפוזיה המתכתיים בקצה תוחם הקנה של אקדח הגנים.

החזק את אקדח הגנים כך שקצה תוחם הקנה יהיה במרחק של 1.5 סנטימטרים מהדגימה. ירה את החרוזים לתוך הפרוסה בלחץ גז הליום של 120 עד 180 PSI. שוטפים את הפרוסות במהירות שלוש פעמים עם XPBS אחד כדי להסיר צבע נוסף.

הקפד לשמור על משטח הזריקה של הפרוסה כלפי מעלה במהלך כל שלבי הטיפול בנוזלים. אחסן את הפרוסות ב-PBS למשך שלוש עד שש שעות כדי לאפשר ל-DAI להתפשט לאורך מכסה הדנדריטים בנייר כסף. מכיוון שדאי רגיש לאור, ניתן להרכיב את הפרוסות בשלב זה או לעבור צביעה נוספת בנוגדנים כמפורט בסעיף הבא כדי להמשיך בצביעה ב-300 עד 500 מיקרוליטר של תמיסת חדירה המכילה 0.01% TRITTON X 100 ב-XPBS אחד לכל פרוסה, לדגור בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות בדיוק.

הסר את תמיסת החדירה מהבארות, חסום את הפרוסות בתמיסה המכילה 10% סרום עיזים ו-0.01% טריטן X 100 בדגירה אחת של XPBS בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. הוסף 300 עד 500 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני מדולל בתמיסת חסימה לכל אחד. יש לדגור היטב בטמפרטורת החדר למשך שעה עד שעתיים או למשך הלילה, תלוי בפרוסות שטיפת הנוגדנים שלוש פעמים עם XPBS אחד למשך חמש עד 15 דקות כל שטיפה, הסר את התמיסה מהבאר.

הוסף 300 עד 500 מיקרוליטר של נוגדן משני מדולל בתמיסת חסימה לכל אחד. יש לשטוף היטב ארבע פעמים עם XPBS אחד למשך חמש עד 15 דקות כל שטיפה כמו קודם, להרכיב את הפרוסות על מגלשת זכוכית עם מדיום הרכבה פלואורסצנטי ולכסות ב-18 על 18 מילימטר. יש להניח לכיסוי לייבוש במשך שש עד 12 שעות בטמפרטורת החדר לפני איטום הקצוות בלק שקוף המאוחסן בחושך או מכוסה בארבע מעלות צלזיוס.

תמונות לדוגמה של חלקי מוח מסומנים מוצגות כאן. שני מאפיינים חשובים שיש לחפש הם דפוס תיוג דליל בהגדלה נמוכה והיכולת לזהות רכיבים תאיים בודדים. הכנה לא נכונה של הכדורים או קיבוע יתר של הרקמה עלולים להוביל לתיוג גרוע כפי שמוצג כאן.

טיפים לפתרון בעיות מסופקים בטקסט כאן. יש תמונה קונפוקלית של נוירון מסתובב מדיום TAL ממוח העכבר והדפוס המורכב שלו של הסתעפות דנדריטית. החתך האופטי המתקבל בעת שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשר בידוד של תאים מסומנים בודדים בקטע הרקמה.

תמונות בהגדלה גבוהה מראות מקטעי דנדריטים ממוח של מכרסם ומוח של פרימטים לא אנושיים. שימו לב, העוצמה הגבוהה של צביעה פלואורסצנטית המושגת בטכניקה זו וכתוצאה מכך קוצים דנדריטיים מוגדרים היטב בעת שילוב ICS עם צביעה חיסונית. תמונה זו מציגה דוגמה לקולוקליזציה של תיוג עיניים D באדום עם צביעה חיסונית לביטוי GFP בירוק.

תמונה זו תואמת לפרוסת סאל מעכבר טרנסגני המבטא את החלבון הפלואורסצנטי GFP תחת מקדם קולטן הדופמין D one. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להכין כדורים ולהשתמש באקדח ג'ינג לתאי עצב דלילים עם צבעים פלואורסצנטיים. טכניקה זו מאפשרת הדמיה ברורה של מורפולוגיה עצבית ולחקר הסתעפות ועמוד שדרה.