Name: RhoC GTPase Assay Activation (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: למדו את פרוטוקול pull down assay לכימות הרמה של RhoC GTPase פעיל בתאים. שיטה זו מאפשרת למדענים לחקור תפקוד חלבוני ומסלולי מעבר אותות תאיים בצורה אמינה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחלקת הביטחון W81XWH-05-1-0005, W81XWH-06-1-0495, W81XWH-08-1-0029 ו W81XWH-08-1-0356

1. הכן GST-Fusion חלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניות של גליצרול JM109 המכיל חיידקים המוסמכת הראשונה N-מסוף 90 חומצות אמינו של Rho rhotekin מחייב מושלם (RBD) subcloned לתוך pGEX3x BamH1/EcoR1 וקטור נעשים. על מנת להבטיח יעילות גבוהה השלבים הבאים יש לבצע עבור כל ניסוי. מניסיוננו, המוכן טרי GST-RBD היא המפתח assay חזקים ומדויקים ההפעלה GTPase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL (בקירוב, לא להפשיר) של מניות גליצרול כדי מ"ל של 50 אמפר LB ולגדול 37 ° C במשך הלילה עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל ב 01:10 500 מ"ל LB-amp ולגדול עבור ח 1 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות GST-חלבון הייצור עם mM 0.1 IPTG עבור 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פזר באופן שווה לתוך בקבוקי צנטריפוגה ו, צנטריפוגה הרוטור Sorval GSA3 ב 5000 סל"ד 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה בבקבוקים צנטריפוגה, 10 מ"ל של חיץ תמוגה *. * הצפת תמוגה חיידקית: סוכרוז 20%, 10% גליצרול, 50 מ"מ טריס pH 8.0, 0.2 mM Na 2 S 2 O 5, 2 מ"מ MgCl 2, 2 DTT מ"מ, הוסף PMSF טריים, benzamide, aprotinin ו leupeptin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate 2-3 דקות (זה תלוי בסוג של sonicator. אנו משתמשים סוניק פישר Dismembranator דגם 500 נקבע סימן 6, מחזור 50%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , צנטריפוגה Sorvall SS34, 20 דקות 10,000 סל"ד ב 4 ° C. בשלב זה aliquot קטנה ניתן להוציא ומנוהל ע"י SDS-PAGE. הג'ל יכול להיות מוכתם coomassie ו להקה צריכה להיות ברורה ב 46 kDa. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של 50% glutatione Sepharose slurry-4B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה למשך 30 דקות ב 4 ° C עם רוטציה. לשטוף 3 פעמים עם חיץ תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend חרוזים GST-RBD/glutatione-Sepharose כדי slurry של 50% (כ 1 מ"ל) עם חיץ GST דגים **. ** GST-Fish הצפת: גליצרול 10%, 50 מ"מ טריס pH 7.4, 100 mM NaCl, 1% NP-4, 2 מ"מ MgCl 2, הוסף PMSF טריים, benzamide, aprotinin ו leupeptin </li></ol> 2. GST-Fusion לנתץ assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 5-10 x 10 6 תאים / assay </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים פעם קרים PBS, לשמור על צלחות על הקרח (אנו משתמשים צלחת זכוכית שטוחה מלא קרח) ו lyse עם חיץ 0.5 GST דגים מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 5 דקות על הקרח, תאים הקציר בעזרת שוטר גומי או scrapper שטוח, להעביר microfuge צינור צנטריפוגות 20,000 סל"ד 5 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant לצינור microfuge טריים. קח 50 μL לקבוע Rho הכולל (כלומר, התמ"ג + GTP קשור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ"ל ו GST-RBD/glutatione-Sepharose חרוזים דגירה על 4 ° C, לילה עם רוטציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 6x עם חיץ GST דגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים Resuspend במאגר 40 2x-Laemelli μL מדגם בנקודה זו ריכוז aliquot Rho הכולל חלבון נלקח 2.4 צריך להיקבע ו -30 מיקרוגרם מוכן להפעיל על הג'ל עם מדגם ההפעלה המתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מרתיחים על 90 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, צנטריפוגה בקצרה לקחת עומס supernatant (כלומר, למנוע את החרוזים) ו לרוץ על שיפוע של 12 באר 4-20% SDS-PAGE ג'ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ג'ל ב 150 וולט גבוה יותר מאשר לא, להעביר באמצעות קרום חיץ Towbin וקבוע הנוכחי של 100 W. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק קרום עם פתרון חלב / TBST 5% ו בדיקה עם נוגדן RhoC-specfic. </li></ol> 3. נציג תוצאות תוצאות טובות צריך לייצר להקה אחת על כ 22 kDa. תוצאות Bad לייצר להקות מרובות או רקע גבוה. זה מעיד על פירוק חלבונים, כביסה שלם של דגימות או שימוש הישנה GST-RBD. <img src="/files/ftp_upload/2083/2083fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. שלוש שורות תאים נפרדים להביע רמות שונות של RhoC GTPase מוצגים להפגין רמות נמוכות של RhoC פעיל בסך הכל, רמות גבוהות של RhoC פעיל מוחלט או לא RhoC. כתם הופשט אז reprobed עם נוגדן ל אקטין שמירה על הבית הגן לשמש שליטה טעינת לחלבון RhoC מוחלט. <img src="/files/ftp_upload/2083/2083fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. להקות מרובות או רקע תוצאות גבוהות מן פירוק חלבונים, כביסה שלם של דגימות או השימוש הישן GST-RBD.

<ol><li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase%2C+a+novel+transforming+oncogene+for+human+mammary+epithelial+cells+that+partially+recapitulates+the+inflammatory+breast+cancer+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype.</a> Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).</li>
<li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase+overexpression+modulates+induction+of+angiogenic+factors+in+breast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase overexpression modulates induction of angiogenic factors in breast cells.</a> Neoplasia. 2 (5), 418-425 (2000).</li>
<li>Golen, K. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversion+of+RhoC+GTPase-induced+inflammatory+breast+cancer+phenotype+by+treatment+with+a+farnesyl+transferase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Reversion of RhoC GTPase-induced inflammatory breast cancer phenotype by treatment with a farnesyl transferase inhibitor.</a> Mol Cancer Ther. 1 (8), 575-583 (2002).</li>
<li>Golen, K. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen+activated+protein+kinase+pathway+is+involved+in+RhoC+GTPase+induced+motility%2C+invasion+and+angiogenesis+in+inflammatory+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Mitogen activated protein kinase pathway is involved in RhoC GTPase induced motility, invasion and angiogenesis in inflammatory breast cancer.</a> Clin Exp Metastasis. 19 (4), 301-311 (2002).</li>
<li>Yao, H., Dashner, E. J., van Golen, C. M., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase+is+required+for+PC-3+prostate+cancer+cell+invasion+but+not+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase is required for PC-3 prostate cancer cell invasion but not motility.</a> Oncogene. 25 (16), 2285-2296 (2006).</li>
<li>Hall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+Collagen+receptor+%28alpha2beta1%29+signaling+promotes+prostate+cancer+cell+invasion+through+RhoC+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Type I Collagen receptor (alpha2beta1) signaling promotes prostate cancer cell invasion through RhoC GTPase.</a> Neoplasia. 10 (8), 797-803 (2008).</li>
<li>Sequeira, L., Dubyk, C. W., Riesenberger, T. A., Cooper, C. R., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+in+PC-3+prostate+cancer+cell+morphology%2C+invasion+and+tumor+cell+diapadesis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases in PC-3 prostate cancer cell morphology, invasion and tumor cell diapadesis.</a> Clin Exp Metastasis. 25, 569-579 (2008).</li>
<li>van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2+Induces+Prostate+Cancer+Transendothelial+Cell+Migration+via+Activation+of+the+Small+GTPase+Rac%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">CCL2 Induces Prostate Cancer Transendothelial Cell Migration via Activation of the Small GTPase Rac.</a> J Cell Biochem. 104, 1587-1597 (2008).</li>
<li>Chatterjee, M., van Golen, K. L. Int J Cancer. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Sander, E. E., ten Klooster, J. P., van Delft, S., van der Kammen, R. A., Collard, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac+downregulates+Rho+activity%3A+reciprocal+balance+between+both+GTPases+determines+cellular+morphology+and+migratory+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rac downregulates Rho activity: reciprocal balance between both GTPases determines cellular morphology and migratory behavior.</a> J Cell Biol. 147 (5), 1009-1022 (1999).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השלב הקריטי ביותר של ההליך הוא דור של טרי GST-RBD. אי לשים לב בשלב זה היא הסיבה העיקרית לכישלון. כל המדרגות, מדור של GST-RBD (1.2) כדי הדגירה לילה עם lysate התא (2.5), צריך להיעשות ביום אחד. צעד נוסף הוא חיוני כדי לוודא שיש מספיק תאים כדי להפיק את lysates התא. זו היא בעלת חשיבות מיוחדת כאשר מסתכלים RhoC GTPase, שנוטה להיות נוכח רמות נמוכות בתא.

<table><tbody><tr><td>חרוזי Gluthione-sepharose 4B</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0756-01</td><td></td></tr><tr><td>ג'לים של Criterion 4-20% Tris-HCl</td><td>Bio-Rad</td><td>345-0032</td><td></td></tr></tbody></table>

rhoc gtpase assay activation

RhoC GTPase Activation Assay

RhoC GTPase יש הומולוגיה 91% ל RhoA GTPase. בגלל השכיחות שלה בתאים, ריאגנטים רבים וטכניקות RhoA GTPase פותחו. עם זאת, RhoC GTPase מתבטא תאים סרטניים עם גרורות ברמות נמוכות יחסית. לכן, כמה RhoC ספציפי ריאגנטים פותחו. יש לנו להתאים assay ההפעלה Rho GTPase כדי לזהות RhoC. טכניקה זו משתמשת GST-Rho תחום מחייב היתוך חלבון לשלוף פעיל GTPase RhoC. בנוסף, אנחנו יכולים לקצור חלבון הכולל בתחילת assay כדי לקבוע רמות בסך הכל (GTP והתוצר כבול) GTPase RhoC. זה מאפשר להגדרה של GTPase RhoC פעיל לעומת סך בתא. כמה גירסאות מסחריות של הליך זה פותחו עם זאת, ערכות המסחרי מותאמים RhoA GTPase ובדרך כלל אינם פועלים היטב עבור RhoC GTPase. חלקים של assay שונו, כמו גם פיתוח של נוגדנים RhoC ספציפי.

פרוטוקול זה מנצל לנתץ assay כדי לקבוע את רמות של GTPase RhoC פעיל בתוך התאים.

RhoC GTPase Assay Activation

ל-RhoC GTPase יש הומוגניה של 91% ל-RhoA GTPase. בשל שכיחותו בתאים, פותחו ריאגנטים וטכניקות רבות עבור RhoA GTPase.

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

השיטה המוצגת כאן מתארת ​​assay לעקוב אחר ההפעלה של RhoA ספציפיים GDP / GTP גורמים חליפין (GEFs) בתאים בתרבית על ידי שימוש בחלבון RhoA GST היתוך מוטציה שיש לו זיקה גבוהה עבור GEFs מופעל. GEFs הם זירז מ lysates סלולריים, שזוהו על ידי סופג המערבי לכמת ידי צפיפות.

הזיקה של רטיבות פעילים Rho-GEFs שימוש GST-מתויג מוטנטי חלבון Rho (GST-RhoA (G17A)) מ lysates תא אפיתל

סרטון זה מדגים מבחן תחרות לחקר שותפי חלבון קושרי GTPase. באמצעות שימוש בחלבון GTPase הקשור לנוקלאוטידים המשותק על חרוזים מגנטיים, ניתן לחקור את הקישור התחרותי בין שני שותפי חלבון המקיימים אינטראקציה עבור אותו אתר קישור ב- GTPase כדי להעריך את זיקות הקישור של שותפי החלבון.

מבחן מחייב תחרות לחקר שותפי חלבון קושרי GTPase מתחרים

Assay הגיוס שתואר כאן הקרינה מבוססת סידן הוא מערכת הקרנת פרמקולוגיה ההפוכה בינוני תפוקה לזיהוי ליגנד תפקודי הפעלה (ים) של קולטני G-חלבון בשילוב יתום (GPCRs).

אפיון של רצפטורים מצמידים גרמו חלבון על ידי Assay גיוס סיד הקרינה מבוססת

פרוטוקול זה משווה את הזיקות היחסיות של שותפים מחייבים ל-GTPases ממשפחת Rho, כולל Rac1. in vivo, חלבונים קושרים Rac1 מתחרים על ממשק מחייב יחיד, שהקונפורמציה שלו מוכתבת על ידי נוקלאוטיד קשור. הנוקלאוטיד חשוב וקשה לשליטה בניסוי, בשל קצב ההידרוליזה הגבוה.

השוואת הזיקה של חלבונים מחייב GTPase באמצעות מבחני תחרות

ספיחה של פפטידים לכלי פלסטיק במהלך דילולים סדרתיים מסורתיים מבוססי קצה יכולה להשפיע באופן משמעותי על קביעת העוצמה ולבלבל את ההבנה של קשרי מבנה-פעילות המשמשים לזיהוי עופרת ושלבי אופטימיזציה של עופרת בגילוי תרופות. כאן מתוארות שיטות לדילול סדרתי אקוסטי אוטומטי ללא מגע של דגימות פפטיד.

אקוסטית אוטומטית מחלק עבור דילול סדרה של אגוניסטים פפטיד ב מבחני קביעת און

Guanosine triphosphate (GTP) מחייב הוא אחד האירועים המוקדמים G-Protein-Coupled קולטן (GPCR) ההפעלה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לאפיין באופן פרמקולוגי אינטראקציות ספציפיות GPCR-ligand על ידי ניטור מחייב של אנלוגי GTP, שכותרתו רדיו, [ 35 S] guanosine-5'-O- (3-thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS), in תגובה ליגנד של עניין.

מדידת G- חלבון מצמידים איתות באמצעות רדיו שכותרתו GTP מחייב

כאן נתאר פרוטוקול לחקור את prenylation ואת guanosine-5'-טריפוספט (GTP)-טעינה של GTPase רו. פרוטוקול זה מורכב משתי שיטות מפורט, כלומר assay ממברנה fractionation ו- immunosorbent של GTPase-מקושרים. הפרוטוקול יכול לשמש כדי למדוד את prenylation ואת GTP העמסת שונים GTPases קטנים אחרים.

זיהוי של GTPase Prenylation קטן ו GTP איגוד באמצעות ממברנה Fractionation ו GTPase-מקושרים Immunosorbent Assay

דו ח זה מתאר הקרנה של דטרגנטים שונים להכנת GPCR החזותית, הרודופסין ומתחם המורכב שלו עם mini-Go. השיטות הביוכימי המאפיינים את איכות הקומפלקס בשלבים שונים במהלך הטיהור מומחש. פרוטוקול זה ניתן להכליל למערכות חלבון ממברנה אחרים עבור המחקרים העתידיים שלהם במבנה.

הקרנה אסטרטגית ואפיון של הקומפלקס החזותי של החלבון GPCR-mini-G של התגבשות מוצלחת

בעבודה זו מתוארת בדיקה פלואורסצנטית של סידן תוך-תאי בעל תפוקה גבוהה עבור צלחות של 384 בארות לסינון ספריות מולקולות קטנות על קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי (GPCRs). המטרה, קולטן קינין מקרציית קדחת הבקר, Rhipicephalus microplus, מתבטאת בתאי CHO-K1. בדיקה זו מזהה אגוניסטים ואנטגוניסטים המשתמשים באותם תאים במבחן "תוספת כפולה" אחת.

בדיקת סידן פלואורסצנטית "דו-תוספת" לבדיקת תפוקה גבוהה של קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי

הקמנו בדיקת הרכבה מחדש של לוציפראז מפוצל כדי לפקח על המגעים האנדופלסמיים בין הרשתית למיטוכונדריה בתאים חיים. באמצעות בדיקה זו, אנו מתארים פרוטוקול למדידה כמותית של רמת הצימודים הבין-אברונים הללו בתאי HEK293T, בתנאי של טיפול כימי.

בדיקת הרכבה מחדש של Split-Luciferase למדידת מגעים אנדופלסמיים בין הרשתית למיטוכונדריה בתאים חיים

למדו את פרוטוקול pull down assay לכימות הרמה של RhoC GTPase פעיל בתאים. שיטה זו מאפשרת למדענים לחקור תפקוד חלבוני ומסלולי מעבר אותות תאיים בצורה אמינה.

RhoC GTPase Assay Activation

גלה סרטונים נוספים