Name: Toxoplasma וול gondii ציסטה כינונה ב הופעל מח עצם הנגזרות המקרופאגים והגבלות Bradyzoite (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-12T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: למדו לגרום להיווצרות דופן ציסטה ב-Toxoplasma gondii בתרביות תאים של מקרופאגים ופיברובלסטים. השיטה משתמשת בלקטינים פלואורסצנטיים לצפייה במיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת ויסקונסין במדיסון הרמן א &#39;שפירו נכבדים בוגרת מלגת (CMT), פרס NIH AI072817 (AMP) ו - American Heart Association פרס 0840059N (LJK).

1. הכנת fibroblasts העורלה האדם (HFF) מצופה coverslips <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip סטרילי זכוכית עגול בחלק התחתון של הבארות של צלחת 24 גם בתרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקצור HFFs מתוך בקבוקון ומחוברות 2 150cm, לשטוף את הבקבוק פעמיים עם 1X PBS ומוסיפים 2.5 מ"ל של 0.025% טריפסין-EDTA. דגירה בקבוק ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את הצד הקשה של הבקבוק על כף היד שלך יכול לסייע ניתוק התאים מהבקבוק. לאחר התאים שוחרר מהבקבוק, מוסיפים 150 מ"ל של HFF בינוני (השתנה Dulbecco הנשר בינוני [DMEM] עם 10% FBS, 2 מ"מ L-גלוטמין ו -1% לפניצילין, סטרפטומיצין) ולהשתמש בינוני לשטוף את הבקבוק ולאסוף התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על 1 מ"ל של תאים לכל היטב עם coverslips. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר להפוך תאים ומחוברות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li></ol> 2. הכנת L929 בינוני מותנה (CM) של BMC פיתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> L929 הוא aneuploid Murine fibrosarcoma תא הקו מפריש המושבה macrophage מגרה גורם לאחר תקופות ארוכות של confluency. הפרשה זו מאפשרת ס"מ L929 התאים לשמש לפיתוח תאים במח העצם עכבר מקרופאגים לתוך התרבות תאים 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר L929 תאים ומחוברות, לתת להם לדגור על 7-9 ימים נוספים עד שהם מופיעים כדורי ולהתחיל להרים את הבקבוק. איסוף supernatant ו גלולה כל התאים מנותקת XG ב 425 במשך 10 דקות. Supernatant זהו CM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחת 150 2 ס"מ בקבוק של L929 תאים התשואות 30 מ"ל של CM, אשר מייצר 150 מ"ל של מדיום BMC. BMC בינוני מורכב 10% FBS, CM 20%, 1% פניצילין, סטרפטומיצין, ו -1% ב-L-גלוטמין DMEM. </li></ol> 3. בידוד של מח עצם תרבית תאים של BMCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב C57BL / 6 העכבר בחנק CO 2 משטח לחטא עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הצפק על ידי הרמת עור הבטן ליד הרגל גזירה במספריים. הימנע ניקוב חלל הצפק. צמצמו את הרגל על ​​מנת לחשוף את עצם השוק לבין עצם הירך. גזור רקמת שריר מן העצמות ברגל באמצעות מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את עצם הירך, חתך פעם מתחת לברך, ופעם ליד הירך. מניחים את העצמות בצלחת פטרי בקטריולוגית המכיל קר 1X PBS. אין להשתמש בתרבית רקמה שטופלו צלחות פטרי על צעדים אלה, משום BMCs תדבק לצמיתות. השתמש באזמל כדי לגרד רקמת שריר נוספת. חותכים את העצם בדיוק מעל הברך כדי לחשוף את מח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים (ב) ו - (ג) כדי לאסוף את מח העצם של הירך השנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מזרק 10cc מלאים קר 1X PBS ומחט 25 מד כדי לסלק את מח העצם לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. עצם אמור להופיע פעם לבן טהור מוח מוסר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את התערובת PBS / 22 מח באמצעות מחט מד לשבור את כל אגרגטים מח עצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין את התערובת על XG 425 במשך 10 דקות, ולהסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 8 מ"ל של מדיום BMC. הוסף 1 מ"ל של השעיה התא 9 מ"ל BMC בינוני עד 8 צלחות פטרי בקטריולוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 5, להוסיף 10 מ"ל בינוני BMC על כל צלחת. ביום 7, התאים יפותח במלואו. BMCs ניתן passaged במשך 1-2 שבועות לאחר ההבשלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפצל BMCs, להסיר את בינוני ומוסיפים 5 מ"ל של קר 1X PBS על כל צלחת פטרי. דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, עד שהתאים מתחילים להרים. שוטפים את BMCs מהצלחת עם טפטפת העברת סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת BMCs בצינור חרוטי 50 מ"ל ו גלולה בשעה XG 425 במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה במדיום 10 מ"ל ו - BMC לסמוך hemocytometer. 2x105 Seed BMCs היטב לכל צלחת 24 גם עם coverslips זכוכית עגול על התחתונה. בואו BMCs לדבוק לילה לפני הדבקה עם ט ' gondii. BMCs עודף ניתן reseeded על צלחות פטרי לשימוש מאוחר יותר. </li></ol> 4. מדביק תאים עם ט ' gondii <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק 25 ס"מ 2 בקבוק של HFFs ומחוברות עם 2x10 6 ט gondii ולגדול עד התאים מתחילים lyse (כ 2-3 ימים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מגרד תא להסיר את monolayer נגוע התא המארח מהבקבוק בתרבית רקמה מכן שחרר את הטפילים מן התאים לארח על ידי העברת monolayer וחילצה באמצעות מחט 27-מד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש hemocytometer כדי לקבוע את מספר טפילים במדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק 10 5 טפילים לכל היטב עם coverslip של HFF monolayers מ 1 לפרוטוקול, או BMCs מן הפרוטוקול 3. בואו הטפילים לפלוש במשך 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li></ol> 5. ייזום ט gondii bradyzoite פיתוח על ידי לחצים סביבתיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Bradyzoite פיתוח HFFs עם עלייה pH בינוני 2 CO רעב <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני פיתוח. פיתוח בינוני מכיל RPMאני 1640 בלי סודה לשתייה, 1% FBS, 1% פניצילין, סטרפטומיצין, ו 42 HEPES מ"מ. pH 8.0 כדי לעקר ולסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר DMEM מ HFFs נגועים, יש לשטוף עם 1X PBS, ולהוסיף 1ml של התפתחות המדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 3 ימים ב 37 מעלות צלזיוס עם הסביבה האוויר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלת BMCs <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני להפעיל BMCs. בינוני ההפעלה היא מדיום BMC בתוספת 100U/ml IFN-γ ו - 100 ng / ml LPS. Sonicate LPS באמבט מים למשך 2 דקות לפני השימוש כדי לשבש אגרגטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר BMC בינוני מבארות ולהחליף עם 1 מ"ל של מדיום ההפעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 3 ימים. </li></ol></li></ol> 6. Immunofluorescence זיהוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף נגוע בארות שלוש פעמים עם 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את monolayer עם 200ul של פורמלדהיד 3% למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מקבע ולשטוף בארות עם 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200μl של 0.1 M גליצין לבארות ולתת לשבת במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר גליצין ולשטוף בארות עם 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של 3% BSA/0.2% TritonX-100 ב 1X PBS כדי permeabilize ולחסום את monolayer במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון חסימת ולשטוף בארות עם 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של דילול 1:250 של rhodamine לבלב biflorus agglutinin ב 3% BSA/0.2% Triton X-100 ב 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים בצלחת ומניחים על מצע שייקר בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את coverslips 3 פעמים עם 0.2% Triton X-100 ב 1X PBS במשך 5 דקות כל אחד על שייקר פלטפורמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslips הר באמצעות מדיום VectaShield הרכבה המכיל 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ויטראז ט gondii ניתן דמיינו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן מתאים עבור rhodamine בהגדלה של 100x. </li></ol> 7. נציג תוצאות איור 1 מציג DBA נציג מכתים של ט ' gondii ב BMMs ו HFFs מופעל תחת לחץ pH. שני DBA להראות מכתים סביב טפיל המכיל vacuoles, המעידים על נוכחות של מרכיבים קיר הציסטה. התמונה BMM מופעל מראה מכתים DBA העולה בקנה אחד עם פני השטח של vacuole. חתך של ט ' gondii ב-pH הדגיש HFFs מציגה את קיר הציסטה ללא מבנים פנימיים מוכתם. <img src="/files/ftp_upload/2091/2091fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. DBA מכתים של ט הדגיש gondii. טפילים תאיים בתנאי סטרס, BMMs מופעל או pH הדגיש HFFs, הוכתמו DBA מצומדות rhodamine (אדום). הפרעה דיפרנציאלי ניגודיות (DIC) מציגה את קווי המתאר של ציסטה לבין בר סולם שחור שווה 2 מיקרומטר. לניסויים בבעלי חיים ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי אוניברסיטת ויסקונסין Animal Care ועדת שימוש.

<ol><li>Tomida, M., Yamamoto-Yamaguchi, Y., Hozumi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+factor+inducing+differentiation+of+mouse+myeloid+leukemic+M1+cells+from+conditioned+medium+of+mouse+fibroblast+L929+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification of a factor inducing differentiation of mouse myeloid leukemic M1 cells from conditioned medium of mouse fibroblast L929 cells.</a> J Biol Chem. 259 (17), 10978-10980 (1984).</li>
<li>Matrajt, M., Donald, R. G., Singh, U., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+differentiation+mutants+in+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of differentiation mutants in the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Mol Microbiol. 44, 735-747 (2002).</li>
<li>Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+tachyzoite+to+bradyzoite+differentiation+mutants+in+Toxoplasma+gondii+reveals+a+hierarchy+of+gene+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction.</a> Mol Microbiol. 44, 721-733 (2002).</li>
<li>J, P., Knoll, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Toxoplasma+gondii+development+mutants+identifies+a+potential+proteophosphogylcan+that+enhances+cyst+wall+formation.+Molecular+and+Biochemical+Parasitology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Isolation of Toxoplasma gondii development mutants identifies a potential proteophosphogylcan that enhances cyst wall formation. Molecular and Biochemical Parasitology.</a> 169 (2), 120-123 (2010).</li>
<li>Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Bradyzoite-Specific+Toxoplasma+gondii+Antigens+in+Gamma+Interferon-Treated+Mouse+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Induction of Bradyzoite-Specific Toxoplasma gondii Antigens in Gamma Interferon-Treated Mouse Macrophages.</a> Infection and Immunity. 61 (3), 1141-1145 (1993).</li>
<li>Ibrahim, H. M., Bannai, H., Xuan, X., Nishikawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+Cyclophilin+18-Mediated+Production+of+Nitric+Oxide+Induces+Bradyzoite+Conversion+in+a+CCR5-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii Cyclophilin 18-Mediated Production of Nitric Oxide Induces Bradyzoite Conversion in a CCR5-Dependent Manner.</a> Infection and Immunity. 77 (9), 3686-3695 (2009).</li>
<li>Lyons, R. E., McLeod, R., Roberts, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+tachyzoite-bradyzoite+interconversion%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii tachyzoite-bradyzoite interconversion.</a> Trends in Parasitology. 18 (5), 198-201 (2002).</li>
<li>Berghaus, L. J., Moore, J. N., Hurley, D. J., Vandenplas, M. L., Fortes, B. P., Wolfert, M. A., Boons, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+responses+of+primary+murine+macrophage-lineage+cells+and+RAW+264.7+cells+to+ligands+of+Toll-like+receptors+2%2C+3%2C+and+4%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Immunol+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors 2, 3, and 4.</a> Comp Immunol Microbiol Infect Dis. , (2009).</li>
<li>Mordue, D. G., Scott-Weathers, C. F., Tobin, C. M., Knoll, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+patatin-like+protein+protects+Toxoplasma+gondii+from+degradation+in+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A patatin-like protein protects Toxoplasma gondii from degradation in activated macrophages.</a> Mol Microbiol. 63 (2), 482-496 (2007).</li>
<li>Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+replication+of+Toxoplasma+gondii+is+necessary+for+induction+of+bradyzoite-specific+antigens%3A+a+possible+role+for+nitric+oxide+in+triggering+stage+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion.</a> Infection and Immunity. 62 (5), 1761-1777 (1994).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בעוד מנגנון הפיתוח bradyzoite לא מובנת לחלוטין, מנתח גנטיקה מולקולרית של ט &#39; המרה gondii הבמה בתרבות רקמה הובילה לגילוי של גנים המעורבים ביצירת ציסטה bradyzoite 2,3,4. מנתח הוביל גם תצפית שכמה סמנים bradyzoite באים לידי ביטוי אחרים בתנאי עקה מתמשך, כולל גידול מקרופאגים מופעל 5,6. השיטות לעיל לתאר איך לגדל ט gondii ולגרום להתפתחות קיר DBA חיובי ציסטה מבנה בשתי BMCs ו HFFs. תוצאות אלו מדגישות כי מסלול התפתחות ציסטה יכול להיגרם על ...

<table><tbody><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11960-051</td><td></td></tr><tr><td>סרום עוברי בקר (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>השבתה תרמית</td></tr><tr><td>Rhodamine &lt;em&gt;Dolichos biflorus&lt;/em&gt; agglutinin</td><td>Vector Laboratories</td><td>RL-1032</td><td></td></tr><tr><td>פורמאלדהיד (16%)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18814</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN&amp;#947;</td><td>PeproTech Inc</td><td>315-05</td><td>יש לאחסן באליקוטים לשימוש חד-פעמי</td></tr><tr><td>L-glutamine (200mM)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>ליפופוליסכריד (LPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4391-1MG</td><td>יש לאחסן באליקוטים לשימוש חד-פעמי</td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי למיקרוסקופ</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80 12CIR-1</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומייצין</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>אבקת מצע RPMI 1640 (עם L-glutamine, ללא ביקרבונט)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>מצע קיבוע VectaShield עם DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

toxoplasma וול gondii ציסטה כינונה ב הופעל מח עצם הנגזרות המקרופאגים והגבלות bradyzoite

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii הוא טפיל תאיים לחייב שניתן לפלוש בכל תא גרעיני של דם חם לבעלי חיים. במהלך זיהום, ט gondii מפיצה כמו צורה שכפול מהיר שנקרא tachyzoite. Tachyzoites להמיר לצורה הגדלים לאט encysted שנקרא bradyzoite בתהליך מאותת כי לא מאופיין היטב. בתוך בעלי חיים, ציסטות bradyzoite נמצאים במערכת העצבים המרכזית ורקמות שרירים מייצגים את שלב כרוני של זיהום. הסבת bradyzoites ניתן לדמות בתרבות רקמה ברעב CO 2, באמצעות מדיום עם pH גבוה, או תוספת של אינטרפרון גאמה (IFNγ). Bradyzoites מאופיינים על ידי נוכחות של קיר הציסטה, אשר לקטינים לבלב biflorus agglutinin (DBA) נקשר. DBA שכותרתו fluorescently משמש כדי להמחיש את קיר הציסטה ב טפילים הגדלים fibroblasts העורלה האדם (HFFs) כי נחשפו CO 2 נמוך ובינוני pH גבוה. באופן דומה, טפילים המתגוררים מח עצם Murine הנגזרות מקרופאגים (BMMs) להציג קיר הציסטה לזיהוי על ידי DBA לאחר BMMs מופעלים עם IFNγ ו lipopolysaccharide (LPS). פרוטוקול זה יהיה להדגים כיצד לגרום ההמרה של ט &#39; gondii כדי bradyzoites באמצעות מדיום הגידול pH גבוה עם CO 2 הפעלה נמוך של BMMs. תאים מארח יהיה מתורבת על coverslips, נגוע tachyzoites והופעל גם עם תוספת של IFNγ ו LPS (BMMs) או חשיפה בינונית צמיחה גבוה pH (HFFs) במשך שלושה ימים. עם השלמת זיהומים, התאים המארחים יהיה קבוע, permeabilized, וחסמו. קירות הציסטה יהיה דמיינו באמצעות DBA rhodamine עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Toxoplasma gondii ממיר כדי ליצור ציסטה בתגובה מדגיש סביבתיים, אשר ניתן חיקה במודלים של תרביות רקמה. וידאו זה מדגים טכניקות כדי לבחון הקמת קיר הציסטה על ידי הפעלת מח עצם הנגזרות מקרופאגים או שינוי בינוני צמיחה pH בתאים פיברובלסטים.

Toxoplasma וול gondii ציסטה כינונה ב הופעל מח עצם הנגזרות המקרופאגים והגבלות Bradyzoite

*Toxoplasma gondii* הוא טפיל תוך-תאי מחייב שיכול לפלוש לכל תא בעל גרעין של בעלי דם חם. במהלך זיהום, *T. gondii* ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשרות ולהדגים ויזואלית היווצרות של דופן ציסטה ב-Toxoplasma Gandhi in vitro. זאת על ידי תרבית של מקרופאגים ופיברובלאסטים בשלב ראשון.לאחר מכן, על ידי הדבקת תאי מאחים אלה בטפיל, ניתן להשרות תגובות למע tatsächlich בעין של te gde באמצעות הלם של פיברובלסטים באמצעות pH או הפעלת מקרופאגים, ששניהם יובילו להיווצרות דופן הציסטה. לבסוף, מוסיפים לתרביות לקטין פלורסצנטי הנקשר לדופן הציסטה, כך שניתן להדמות את הציסטה באמצעות מיקרוסקופיה אימונופלורסצנטית. שלום, אני קריסטל טובין מהמעבדה של ד"ר לורה נואל במחלקה למיקרוביולוגיה רפואית ואימונולוגיה באוניברסיטת ויסקונסין מדסון.אני אנג'לה פולארד, גם אני ממעבדת No Lab. היום נדגים לכם פרוצדורה ליצירת דופן ציסטה של Toxoplasma Gandhi במעבדה (in vitro). אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את תגובות הטפיל לתנאי עקה.בואו נתחיל. התחילו בהנחת כיסוי זכוכית עגול וסטרילי לתחתית כל באער של פלטת תרבית רקמות בעלת 24 באערים, כדי להשרות את המרת Toxoplasma gondii ל-Bradyzoites בפיברובלסטים של עור פריפומלי אנושי בתנאים של pH גבוה ומחסור בפחמן דו-חמצני. התחילו עם בקבוק של 150 square centimeter של פיברובלסטים של עור פריפומלי אנושי בשכבה תאית רציפה (confluent) תחת מנדף תרביות רקמה.שטפו פעמיים את הבקבוק עם התרבית הצפופה (confluent) של פיברובלסטים מעור של אדם באמצעות XPBS, ולאחר מכן הוסיפו 2.5 milliliters של 0.025%tripsin EDTA. דגרו את הבקבוק בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך חמש עד 10 דקות. לאחר דגירה של חמש עד 10 דקות, הקשו על הבקבוק מספר פעמים כדי לשחרר את התאים מפני השטח של הפלסטיק.בשלב הבא, הוסיפו 150 milliliters של מצע HFF או מצע delcos modified eagles מועשר. השתמשו במצע כדי לשטוף את הבקבוק ולאסוף את התאים. חלקו 1 milliliter של תאים לכל באער בלוח 24 באערים עם למינציה (cover slips) ואפשרו לתאים להגיע למצב של התכנסות (confluency) בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide.התאים יהיו כעת מוכנים להדבקה עם טפיל ה-Toxoplasma Gandhi. תחת מנדף לתרביות רקמה, הדביקו בבקבוק של 25 square centimeter המכיל תרבית קונפלואנטית של פיברובלסטים מעור אנושי (human foreskin fibroblasts) כ-2×10⁶ טפילים, והדגרירו בטמפרטורה של 37 °C עד שהתאים יתחילו להתפרק. לאחר כיומיים עד שלושה ימים, השתמשו במגרדת תאים (cell scraper) כדי להסיר את השכבה החד-שכבתית של הפיברובלסטים המודבקים מבקבוק תרבית הרקמה.לאחר מכן, שחררו את הטפילים מהתאי המארחים על ידי העברת השכבה החד-שכבתית (monolayer) שהופרשה דרך מחט בכילוי (gauge) 27. השתמשו בהמוסייטומטר (hemo cytometer) כדי לקבוע את מספר הטפילים במצע הגידול, ולאחר מכן הדביקו 10⁵ טפילים לכל אחת מ-24 הבארות של תאי פיברובלסטים של עור הפורה אנושי (human foreskin fibroblasts) שהגיעו למצב של התלכדות (confluent) והוכנו מראש.דגרו את התאים במשך שלוש שעות ב-37 °C ו-5% carbon dioxide כדי לאפשר לטפילים לפלוש לתאי המארח. המשיכו להשראת המעבר של הטפילים לשלב ה-Brady Zeolite. הסירו את ה-DMEM מהפיברובלסטים של עור פרי השפה האנושי המודבקים.שטוף אותם ב-XPBS אחד ולאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של תווך פיתוח. תווך מבוסס RPMI ללא ביקרבונט שהותאם ל-pH 8. הדגר את התאים למשך שלושה ימים ב-37 °C באוויר סביבתי.התאים מוכנים כעת לניתוח לבדיקת נוכחות של Brady zos. נוכחותם של Brady ZOS נקבעת באמצעות הלקטין docos המסומן פלואורסצנטית על ידי glutenin פלואורסצנטי או DBA, הנקשר לדפף של Toxoplasma Gandhi, כדי להכין את התאים המודבקים לדימיון פלואורסצנטי. שטפו את הבארות שלוש פעמים ב-1X PBS.בשלב הבא, קבעו את השכבות המונו-מולקולריות של התאים באמצעות 200 µL של 3% formaldehyde למשך 20 דקות. הסירו את חומר הקיבוע ושטפו את הבארות עם XPBS אחד. הוסיפו לבארות 200 µL של glycine בריכוז 0.1 M והמתינו חמש דקות.הסיר את הגליצין ושטוף את הבארות ב-XPBS אחד כדי לחסום ולהחדיר את התרופות לתאים. הוסף 250 microliters של תמיסת חסימה. הדגר את התאים למשך 30 דקות.הסיר את תמיסת החסימה ושטוף את הבארות באמצעות XPBS אחת. הוסף לבארות 50 µL של DBA בדילול של 1:250, אשר קושר לרומין. כסה את הפלטה ונער בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת על רעידה פלטפורמה (platform shaker).לאחר הדגירה, הסר את ה-DBA המסומן פלואורסצנטית על ידי שטיפת לוחות הכיסוי שלוש פעמים ב-0.2% Triton X 100 ב-1x PBS למשך חמש דקות בכל פעם על שייקר פלטפורמה, ובסיום הצמד את לוחות הכיסוי באמצעות תווך הצמדה beta shield המכיל dpi. ניתן להדגים את הצביעה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן המתאים ל-rhodamine בהגדלה של 100x. כשיטה חלופית להשראת היווצרות Bradyzoites, ניתן להפעיל מקרופאגים המופקים ממוח העצם של תאים נגועים באמצעות interferon gamma וליפופוליסכריד או LPS. כדי להתחיל, הכן תחילה מצע מותנה (conditioned medium) של תאי L929 לתהליך זה.L 9 29 הוא קו תאים של פיברוסרקומה יישומית המפריש גורם מעורר התפתחות של מושבות מקרופאגים לאחר תקופות ארוכות של צמיחה עד למצב של התקהלות (confluency). ניתן להשתמש במדיום מותנה זה כדי להבדיל תאי מח עצם של עכבר למקרופאגים בתרבית תאים. כדי להכין מדיום מותנה, גדלו בקבוק של 150 square centimeter של תאי L 9 2 9 עד להתקהלות ב-37 °C. לאחר מכן, דגרו אותם למשך שבעה עד תשעה ימים נוספים, עד אשר ייראו כספריים ויתחילו להתנתק מפני השטח של הבקבוק.אספו את המצע ואת כל התאים שהסתרו לשפופרת של 50 milliliter וסובבו ב-420 5G למשך 10 דקות. התוצר הוא המצע המעשיר (conditioned medium). בקבוק של 150 square centimeter של תאי L 9 29 יניב 30 milliliters של מצע מעשיר, שזהו הנפח הדרוש להכנת 150 milliliters של מצע BMC. זכרו להכין DMEM עבור BMC עם ה-L 9 29 cm שיהיה בשימוש לפיתוח ה-BMC.לצפייה בפרוטוקולי וידאו מפורטים המדגימים את השיטה לבידוד תאי מוח עצם. עבור פמור של עכבר, אנא צפו בפרוטוקולי הווידאו הבאים לאחר שתאי ה-BMC שגוברו עברו דגירה למשך חמישה ימים. לצלחונות פטרי בקטריולוגיים, הוסיפו 10 milliliters של מצע BMC, אשר יכיל מצע מותנה מתאי L 9 2 9, לכל צלחת והדגירו למשך יומיים נוספים, שלאחריהם התאים יהיו מפותחים במלואם.ניתן להעביר מקרופאגים בוגרים המופקים ממח עצם (BMS) למצע חדש במשך שבוע עד שבועיים לאחר שהבשילו. כדי לפצל את ה-BMS, יש להסיר את המצע ולהוסיף חמישה מיליליטר של 1x PBS קר שחומם ב-4°C למשך 30 דקות, עד שהתאים מתחילים להתנתק. יש לשטוף את התאים מהפלטה באמצעות פיפטת העברה סטרילית. העבירו את ה-BMS למבחנה קונית של 50 מיליליטר ורספו את התאים ב-420 ×g למשך 10 דקות.יש להשעות מחדש את המשקע ב-10 milliliters של מצע BMC ולאחר מכן להשתמש ב-hemo cytometer כדי לקבוע את צפיפות התאים לזריעה. 2×10⁵ תאי BMS לבאר. בלוח 24 בארות המכיל כיסויי זכוכית עגולים בתחתית, יש להמתין להצמדות התאים למשך לילה לפני ההדבקה ב-T Gandhi.ניתן להעביר תאי עודף לצלחוני פטרי לשימוש מאוחר יותר. כדי להפעיל את ה-BMS, הכין מצע הפעלה: בצע סוניקציה ל-LPS באמבט מים למשך שתי דקות כדי לפרק אגרגטים. לאחר מכן, הוסף למצע BMC כ-100 ng/mL LPS ו-100 U/mL IFN gamma.לבסוף, הסר את מצע ה-BMC מהבארות והחלף אותו במצע הפעלה. דגירה ב-37 °C, 5% carbon dioxide למשך שלושה ימים. ניתן לצבוע BMCs כפי שהודגם בעבר עם פיברובלסטים של עורת הדגדגן.בדוגמאות אלו, toxoplasma Gandhi I Bradys מסומנים ב-DBA פלואורסצנטי בפיברובלסטים של עור דגדגן אנושי. תחת עקה של pH. דופן הציסטה מסומנת פלואורסצנטית כפי שמוצג בחתך רוחב זה של ציסטה in vitro ב-dms שהופעלו באמצעות IFN Gamma ו-L-P-S-D-V-A.צביעה קיימת גם כאן, כפי שניתן לראות על פני השטח של הוואקואולה. הרגע הצגנו כיצד לצבוע in vitro את ה-Toxoplasma gondii, בציסטות בפיברובלסטים ובמקרופאגים מופעלים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לתכנן כך שהטפילים ותאי המאכסן יהיו מוכנים באותו היום.זהו זה. תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.

toxoplasma-gondii-cyst-wall-formation-activated-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מחקר זה מתאר את התפתחות שיטת CsCl שונה בקלות מטהר ט שביצים gondii מצואה של חתולים נגועים המתאימים ביולוגית מולקולרית תרבות מניפולציה...

קבלת מטוהרים Toxoplasma gondii שביצים ידי Gradient כלוריד רציפה וצזיום

קדימה הגנטיקה היא שיטה רבת עוצמה לחשוף את הרמה המולקולרית של...

מסך גנטית לבודד Toxoplasma gondii מארח תאים יציאה מוטציות

סרטון זה מדגים בדיקה לכימות הצמיחה התוך-תאית של טפילים במקרופאגים שמקורם במח עצם (BMM). תאי המקרופאגים נגועים בשלבים הפולשניים התנועתיים והלא תנועתיים של לישמניה, פרומסטיגוטים מטאציקליים ואמסטיגוטים, בהתאמה. הטפילים פולשים למקרופאגים, מופנמים לחלל טפילי ומתרבים בפנים. צמיחת הטפיל התוך-תאי מכומתת באמצעות מיקרוסקופ על צביעה פלואורסצנטית של גרעיני המקרופאגים והטפילים.

בדיקה חוץ גופית לכימות הצמיחה התוך-תאית של טפיל במקרופאגים

כאן אנו מדווחים שיטה לשימוש בסוג I וסוג...

מניפולציה גנטית ב<em&gt; Δku80</em&gt; זנים לאנליזה גנומית תפקודית של<em&gt; Toxoplasma gondii</em

המקרופאגים כבר מזמן מוכרים כמרכיב קריטי של תגובות חיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות. הפיצוץ האחרון של ידע הנוגע להיבטים אבולוציוניים, גנטיים, והביוכימי של האינטראקציה בין מקרופגים וחיידקים חידש את תשומת לב מדעית למקרופאגים. מאמר זה מתאר שיטה להבדיל מקרופאגים ממח העצם של עכבר.

מח עצם נגזרות Macrophage הפקה

השימוש בפרוטוקול זה, הצלחנו חלקים במוח העבה מיקרומטר 160 תמונה מעכברים נגועים בטפיל טוקסופלזמה גונדי, המאפשר הדמיה וניתוח של היחסים מרחביים בין טפיל encysting ונוירון הנגוע.

הדמיה 3-D וניתוח של נוירונים נגועים In vivo עם Toxoplasma gondii

Forward genetics היא גישה רבת עוצמה לזיהוי גנים בפתוגנים תוך-תאיים החשובים לעמידות לחסינות אוטונומית של התאים. הגישה הנוכחית משתמשת בתאי חיסון מולדים, במיוחד מקרופאגים, כדי לזהות גנים חדשים של טוקסופלזמה גונדי החשובים להתחמקות חיסונית.

קדימה גנטיקה מסכי שימוש המקרופאגים לזיהוי<em&gt; Toxoplasma gondii</emחסינות אוטונומית נייד להתנגדות לIFN-γ-Dependent&gt; גנים חשובים

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להנחות כיצד לחלץ, לתחזק, ו הנתק מורטין אסטרוציט ו מיקרוגליה תאים ממערכת העצבים המרכזית, ואחריו זיהום עם טפילים פרוטותים.

בידוד הראשוני של אסטרוציטים ומיקרוגליה לזיהום טפיל

מחקר זה מראה פרוטוקול מפורט לביצוע מיקרוסקופ הרחבת אולטרה-מבנה בשלושה שלבי מחזור חיים במבחנה של טריפנוזומה קרוזי, הפתוגן האחראי למחלת צ'אגאס. אנו כוללים את הטכניקה האופטימלית עבור חלבונים ציטו-שלד ותיוג פאן-פרוטאום.

מיקרוסקופ הרחבה אולטרה-סטרוקטורלי בשלושה שלבי מחזור חיים חוץ גופי של טריפנוזומה קרוזי

אנו מדגימים כאן reprogramming epigenetic באמצעות העברה תא סומטי גרעיני (SCNT) יכול לשמש ככלי לייצור מודלים העכבר עם קולטן T מוגדרים מראש תא (TCR) ספציפיות. עכברים אלה transnuclear לבטא את TCR המתאימה מוקד אנדוגניים שלהם תחת שליטה של ​​האמרגן אנדוגני.

עכברים Transnuclear עם מוגדרים מראש תא קולטן T ספציפיות נגד Toxoplasma gondii לקבל ע&quot;י SCNT

למדו לגרום להיווצרות דופן ציסטה ב-Toxoplasma gondii בתרביות תאים של מקרופאגים ופיברובלסטים. השיטה משתמשת בלקטינים פלואורסצנטיים לצפייה במיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

Toxoplasma וול gondii ציסטה כינונה ב הופעל מח עצם הנגזרות המקרופאגים והגבלות Bradyzoite

גלה סרטונים נוספים