Toxoplasma וול gondii ציסטה כינונה ב הופעל מח עצם הנגזרות המקרופאגים והגבלות Bradyzoite
12 באוגוסט 2010
Toxoplasma gondii ממיר כדי ליצור ציסטה בתגובה מדגיש סביבתיים, אשר ניתן חיקה במודלים של תרביות רקמה. וידאו זה מדגים טכניקות כדי לבחון הקמת קיר הציסטה על ידי הפעלת מח עצם הנגזרות מקרופאגים או שינוי בינוני צמיחה pH בתאים פיברובלסטים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להשרות ולהדגים ויזואלית היווצרות של דופן ציסטה ב-Toxoplasma Gandhi in vitro. זאת על ידי תרבית של מקרופאגים ופיברובלאסטים בשלב ראשון.
לאחר מכן, על ידי הדבקת תאי מאחים אלה בטפיל, ניתן להשרות תגובות למע tatsächlich בעין של te gde באמצעות הלם של פיברובלסטים באמצעות pH או הפעלת מקרופאגים, ששניהם יובילו להיווצרות דופן הציסטה. לבסוף, מוסיפים לתרביות לקטין פלורסצנטי הנקשר לדופן הציסטה, כך שניתן להדמות את הציסטה באמצעות מיקרוסקופיה אימונופלורסצנטית. שלום, אני קריסטל טובין מהמעבדה של ד"ר לורה נואל במחלקה למיקרוביולוגיה רפואית ואימונולוגיה באוניברסיטת ויסקונסין מדסון.
אני אנג'לה פולארד, גם אני ממעבדת No Lab. היום נדגים לכם פרוצדורה ליצירת דופן ציסטה של Toxoplasma Gandhi במעבדה (in vitro). אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את תגובות הטפיל לתנאי עקה.
בואו נתחיל. התחילו בהנחת כיסוי זכוכית עגול וסטרילי לתחתית כל באער של פלטת תרבית רקמות בעלת 24 באערים, כדי להשרות את המרת Toxoplasma gondii ל-Bradyzoites בפיברובלסטים של עור פריפומלי אנושי בתנאים של pH גבוה ומחסור בפחמן דו-חמצני. התחילו עם בקבוק של 150 square centimeter של פיברובלסטים של עור פריפומלי אנושי בשכבה תאית רציפה (confluent) תחת מנדף תרביות רקמה.
שטפו פעמיים את הבקבוק עם התרבית הצפופה (confluent) של פיברובלסטים מעור של אדם באמצעות XPBS, ולאחר מכן הוסיפו 2.5 milliliters של 0.025%tripsin EDTA. דגרו את הבקבוק בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך חמש עד 10 דקות. לאחר דגירה של חמש עד 10 דקות, הקשו על הבקבוק מספר פעמים כדי לשחרר את התאים מפני השטח של הפלסטיק.
בשלב הבא, הוסיפו 150 milliliters של מצע HFF או מצע delcos modified eagles מועשר. השתמשו במצע כדי לשטוף את הבקבוק ולאסוף את התאים. חלקו 1 milliliter של תאים לכל באער בלוח 24 באערים עם למינציה (cover slips) ואפשרו לתאים להגיע למצב של התכנסות (confluency) בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide.
התאים יהיו כעת מוכנים להדבקה עם טפיל ה-Toxoplasma Gandhi. תחת מנדף לתרביות רקמה, הדביקו בבקבוק של 25 square centimeter המכיל תרבית קונפלואנטית של פיברובלסטים מעור אנושי (human foreskin fibroblasts) כ-2×10⁶ טפילים, והדגרירו בטמפרטורה של 37 °C עד שהתאים יתחילו להתפרק. לאחר כיומיים עד שלושה ימים, השתמשו במגרדת תאים (cell scraper) כדי להסיר את השכבה החד-שכבתית של הפיברובלסטים המודבקים מבקבוק תרבית הרקמה.
לאחר מכן, שחררו את הטפילים מהתאי המארחים על ידי העברת השכבה החד-שכבתית (monolayer) שהופרשה דרך מחט בכילוי (gauge) 27. השתמשו בהמוסייטומטר (hemo cytometer) כדי לקבוע את מספר הטפילים במצע הגידול, ולאחר מכן הדביקו 10⁵ טפילים לכל אחת מ-24 הבארות של תאי פיברובלסטים של עור הפורה אנושי (human foreskin fibroblasts) שהגיעו למצב של התלכדות (confluent) והוכנו מראש.
דגרו את התאים במשך שלוש שעות ב-37 °C ו-5% carbon dioxide כדי לאפשר לטפילים לפלוש לתאי המארח. המשיכו להשראת המעבר של הטפילים לשלב ה-Brady Zeolite. הסירו את ה-DMEM מהפיברובלסטים של עור פרי השפה האנושי המודבקים.
שטוף אותם ב-XPBS אחד ולאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של תווך פיתוח. תווך מבוסס RPMI ללא ביקרבונט שהותאם ל-pH 8. הדגר את התאים למשך שלושה ימים ב-37 °C באוויר סביבתי.
התאים מוכנים כעת לניתוח לבדיקת נוכחות של Brady zos. נוכחותם של Brady ZOS נקבעת באמצעות הלקטין docos המסומן פלואורסצנטית על ידי glutenin פלואורסצנטי או DBA, הנקשר לדפף של Toxoplasma Gandhi, כדי להכין את התאים המודבקים לדימיון פלואורסצנטי. שטפו את הבארות שלוש פעמים ב-1X PBS.
בשלב הבא, קבעו את השכבות המונו-מולקולריות של התאים באמצעות 200 µL של 3% formaldehyde למשך 20 דקות. הסירו את חומר הקיבוע ושטפו את הבארות עם XPBS אחד. הוסיפו לבארות 200 µL של glycine בריכוז 0.1 M והמתינו חמש דקות.
הסיר את הגליצין ושטוף את הבארות ב-XPBS אחד כדי לחסום ולהחדיר את התרופות לתאים. הוסף 250 microliters של תמיסת חסימה. הדגר את התאים למשך 30 דקות.
הסיר את תמיסת החסימה ושטוף את הבארות באמצעות XPBS אחת. הוסף לבארות 50 µL של DBA בדילול של 1:250, אשר קושר לרומין. כסה את הפלטה ונער בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת על רעידה פלטפורמה (platform shaker).
לאחר הדגירה, הסר את ה-DBA המסומן פלואורסצנטית על ידי שטיפת לוחות הכיסוי שלוש פעמים ב-0.2% Triton X 100 ב-1x PBS למשך חמש דקות בכל פעם על שייקר פלטפורמה, ובסיום הצמד את לוחות הכיסוי באמצעות תווך הצמדה beta shield המכיל dpi. ניתן להדגים את הצביעה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן המתאים ל-rhodamine בהגדלה של 100x. כשיטה חלופית להשראת היווצרות Bradyzoites, ניתן להפעיל מקרופאגים המופקים ממוח העצם של תאים נגועים באמצעות interferon gamma וליפופוליסכריד או LPS. כדי להתחיל, הכן תחילה מצע מותנה (conditioned medium) של תאי L929 לתהליך זה.
L 9 29 הוא קו תאים של פיברוסרקומה יישומית המפריש גורם מעורר התפתחות של מושבות מקרופאגים לאחר תקופות ארוכות של צמיחה עד למצב של התקהלות (confluency). ניתן להשתמש במדיום מותנה זה כדי להבדיל תאי מח עצם של עכבר למקרופאגים בתרבית תאים. כדי להכין מדיום מותנה, גדלו בקבוק של 150 square centimeter של תאי L 9 2 9 עד להתקהלות ב-37 °C. לאחר מכן, דגרו אותם למשך שבעה עד תשעה ימים נוספים, עד אשר ייראו כספריים ויתחילו להתנתק מפני השטח של הבקבוק.
אספו את המצע ואת כל התאים שהסתרו לשפופרת של 50 milliliter וסובבו ב-420 5G למשך 10 דקות. התוצר הוא המצע המעשיר (conditioned medium). בקבוק של 150 square centimeter של תאי L 9 29 יניב 30 milliliters של מצע מעשיר, שזהו הנפח הדרוש להכנת 150 milliliters של מצע BMC. זכרו להכין DMEM עבור BMC עם ה-L 9 29 cm שיהיה בשימוש לפיתוח ה-BMC.
לצפייה בפרוטוקולי וידאו מפורטים המדגימים את השיטה לבידוד תאי מוח עצם. עבור פמור של עכבר, אנא צפו בפרוטוקולי הווידאו הבאים לאחר שתאי ה-BMC שגוברו עברו דגירה למשך חמישה ימים. לצלחונות פטרי בקטריולוגיים, הוסיפו 10 milliliters של מצע BMC, אשר יכיל מצע מותנה מתאי L 9 2 9, לכל צלחת והדגירו למשך יומיים נוספים, שלאחריהם התאים יהיו מפותחים במלואם.
ניתן להעביר מקרופאגים בוגרים המופקים ממח עצם (BMS) למצע חדש במשך שבוע עד שבועיים לאחר שהבשילו. כדי לפצל את ה-BMS, יש להסיר את המצע ולהוסיף חמישה מיליליטר של 1x PBS קר שחומם ב-4°C למשך 30 דקות, עד שהתאים מתחילים להתנתק. יש לשטוף את התאים מהפלטה באמצעות פיפטת העברה סטרילית. העבירו את ה-BMS למבחנה קונית של 50 מיליליטר ורספו את התאים ב-420 ×g למשך 10 דקות.
יש להשעות מחדש את המשקע ב-10 milliliters של מצע BMC ולאחר מכן להשתמש ב-hemo cytometer כדי לקבוע את צפיפות התאים לזריעה. 2×10⁵ תאי BMS לבאר. בלוח 24 בארות המכיל כיסויי זכוכית עגולים בתחתית, יש להמתין להצמדות התאים למשך לילה לפני ההדבקה ב-T Gandhi.
ניתן להעביר תאי עודף לצלחוני פטרי לשימוש מאוחר יותר. כדי להפעיל את ה-BMS, הכין מצע הפעלה: בצע סוניקציה ל-LPS באמבט מים למשך שתי דקות כדי לפרק אגרגטים. לאחר מכן, הוסף למצע BMC כ-100 ng/mL LPS ו-100 U/mL IFN gamma.
לבסוף, הסר את מצע ה-BMC מהבארות והחלף אותו במצע הפעלה. דגירה ב-37 °C, 5% carbon dioxide למשך שלושה ימים. ניתן לצבוע BMCs כפי שהודגם בעבר עם פיברובלסטים של עורת הדגדגן.
בדוגמאות אלו, toxoplasma Gandhi I Bradys מסומנים ב-DBA פלואורסצנטי בפיברובלסטים של עור דגדגן אנושי. תחת עקה של pH. דופן הציסטה מסומנת פלואורסצנטית כפי שמוצג בחתך רוחב זה של ציסטה in vitro ב-dms שהופעלו באמצעות IFN Gamma ו-L-P-S-D-V-A.
צביעה קיימת גם כאן, כפי שניתן לראות על פני השטח של הוואקואולה. הרגע הצגנו כיצד לצבוע in vitro את ה-Toxoplasma gondii, בציסטות בפיברובלסטים ובמקרופאגים מופעלים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לתכנן כך שהטפילים ותאי המאכסן יהיו מוכנים באותו היום.
זהו זה. תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
סרטון זה מדגים טכניקות להשראה וויזואליזציה של יצירת דופן הציסטה ב-Toxoplasma gondii באמצעות מקרופאגים ופיברובלסטים. המחקר מתמקד באופן שבו גורמי עקה סביבתיים יכולים להוביל ליצירת ציסטות, תהליך שניתן לצפות בו באמצעות מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מיקרוביולוגיה
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- Toxoplasma gondii יכול להוות ציסטות בתגובה למעמקים סביבתיים.
- ניתן לדמות היווצרות ציסטות in vitro באמצעות טכניקות של תרביות רקמה.
- מקרופאגים ופיברובלסטים משמשים כתאי מאכסן עבור הטפיל.
- לקטינים פלואורסצנטיים משמשים להדמיית דפנות הציסטה.
מטרת המחקר
- להשראת היווצרות דופן הציסטה ב-Toxoplasma gondii.
- לוויזואליזציה של הציסטות באמצעות מיקרוסקופיה של אימונופלואורסצנציה.
- להבנת תגובות העקה של הטפיל בתאי מאחסן.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תרבית של מקרופאגים המופקים ממח עצם ותאי פיברובלסט.
- הדבקת תאי מאכסן ב-Toxoplasma gondii.
- השראה של תגובות דחק על ידי שינוי pH או הפעלת מקרופאגים.
- יישום של לקטינים פלואורסצנטיים להדמיית דפנות הציסטה.
תוצאים עיקריים
- השראת היווצרות דופן הציסטה בוצעה בהצלחה in vitro.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית אפשרה ויזואליזציה ברורה של הציסטות.
- הן שינוי ב-pH והן הפעלת מקרופאגים הובילו להיווצרות ציסטות.
- ניתן ליישם את הטכניקות שהודגמו במחקרים נוספים על Toxoplasma gondii.
מסקנות
- המחקר מספק שיטה מהימנה להשראה וויזואליזציה של ציסטות.
- הבנת היווצרות הציסטות יכולה לסייע בחקר הביולוגיה של Toxoplasma gondii.
- טכניקות אלו עשויות להועיל למחקרים עתידיים על אינטראקציות בין מאכסן לטפיל.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר הפחתת סיכונים מכנית (de-risking) של המרת bradyzoite של Toxoplasma gondii, שלב מרכזי בהבנת זיהום כרוני וסיכון להחמרה. באמצעות מידול של היווצרות ציסטות בהשראת סטרס in vitro, חוקרים יכולים להעריך השפעות של תרכובות על מסלולי הישרדות של הטפיל. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות ובסריקה פנוטיפית בשלבי גילוי מוקדמים של התערבויות אנטי-פרזיטיות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות סביב מסלולי תגובת הסטרס של הטפיל השולטים בדיפרנציאציה של tachyzoite ל-bradyzoite.
- ערך תפעולי: מספק מערכת הניתנת לשחזור לצורך תיקוף תפקודי של מטרות המעורבות ביצירת דופן הציסטה ובהישרדות הטפיל.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: ייצור של צורות ברדיזואיט רלוונטיות למחלה עם סממני דופן ציסטה מדידים להכנה לבדיקה.
- ערך תפעולי: מאפשר סריקה סטנדרטית של תרכובות המעכבות או מעודדות היווצרות ציסטות תחת תנאי pH מבוקרים או תנאי הפעלת מערכת החיסון, המבוססת על קריאה פלואורסצנטית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך בפיתוח מודלים פרה-קליניים על ידי קישור בין יצירת ציסטות in vitro לבין פנוטיפים של זיהום כרוני הרלוונטיים לטרופיזם של רקמות עצביות ושריריות.
- ערך תפעולי: מקל על הערכה של עומס הציסטות המותאמת לסמנים ביולוגיים (biomarkers) כמדד תרגומי ליעילות תרופתית במודלים של התמדה (persistence).
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של גילוי מוקדם וזיהוי מובילים, ומספקת פלטפורמה לסריקה פנוטיפית של תרכובות המכוונות להמרה של שלבי הטפיל.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על מסלולי איתות של עקה בטפילים ובהפחתת סיכונים ביולוגיים של מנגנוני הישרדות.
- סריקה: מספק סטנדרטיזציה של הבדיקה ופלטי פלואורסצנציה כמותיים להערכה אמינה של תרכובות בפורמטים של 24 בארות.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה של היווצרות דופן הציסטה כמשתנה תלוי לצורך השוואה בין תנאי עקה או טיפולים בתרכובות.
- מחקר תרגומי: מתחבר להמשכיות פרה-קלינית באמצעות מידול של היווצרות bradyzoite הנצפית ברקמות מערכת העצבים המרכזית (CNS) וברקמות שריר.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר לחקר המרת שלבים של טפילים מקבוצת ה-apicomplexan על פני סוגים שונים של תאי מאכסן.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי במיקוד של מסלולי התמיינות טפילים, המפחית עמימות מכניסטית במודלים של זיהום כרוני.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של השראת ציסטות וויזואליזציה במערכות של פיברובלסטים ומקרופאגים משפרת את השחזוריות.
- ערך אסטרטגי: מספק מידע לקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקה (go/no-go) באמצעות זיהוי תרכובות המווסתות את היווצרות הברדיזואיטים, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים של תוכניות אנטי-פרזיטיות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מועמדים מותאם-סיכון בהתבסס על השפעות על היווצרות דופן הציסטה כסמן ביולוגי להישרדות (persistence).
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בגידול טפילים, תחזוקת תאי מאחס ומיקרוסקופיה של פלואורסצנציה עקיפה (immunofluorescence).
- גישה למיקרוסקופיית פלואורסצנציה עם סטים של מסננים מתאימים לזיהוי rhodamine היא חיונית.
- סטנדרטיזציה של פרוטוקולי הפעלה של IFNγ ו-LPS מבטיחה עקביות בניסויים המבוססים על מקרופאגים.
- הסתגלות לקווי תאי מאחס שונים דורשת תיקוף של חדירות דופן הציסטה ונגישות ללקטין.
- בקרת סביבתית של רמות CO2 ו-pH היא קריטית להשראה הדירה במערכות פיברובלסטים.
