Name: Assay למדידת פעילות Escherichia coli ועין מתנהלת ליזין Decarboxyase (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: למדו למדוד פעילות אנזים lysine decarboxylase ב-Escherichia coli באמצעות מבחן צבעוני. השיטה כוללת הפרדת מוצרי תגובה בתולואן ומדידת ספיגה ב-340 ננומטר לקביעת קינטיקת האנזים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד&quot;ר ד&quot;ר מיכאל קאשל (National Institutes of Health, Bethesda, מסצ&#39;וסטס, ארה&quot;ב) לשליחת לנו זני חיידקים, פלסמידים, ופרוטוקולים הצורך. אנו מודים לד&quot;ר ג&#39;ון גלובר (המחלקה לביוכימיה, אוניברסיטת טורונטו) לשימוש של הקורא צלחת SpecraMax. בבריטניה הוא מקבל הלאומית למדעים והנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC) מלגות לתארים מתקדמים, המכון הקנדי של תוכנית הבריאות הדרכה אסטרטגי מחקר בביולוגיה מבנית של חלבונים בממברנה הקשורים למחלה, וכן אוניברסיטת אחוות פתח טורונטו. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם המכון הקנדי לחקר הבריאות (MOP-67210) כדי וואה.

1) ריאגנטים וציוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, להכין את הדברים הבאים שלושה פתרונות: 1 מ"ל של פתרון אשר מורכב של 8 מ"מ L-ליזין, נתרן 100 mM 2 - (N-Morpholino) ethanesulphonic חומצה (MES) pH 6.5, 0.2 מ"מ נוקלאוטיד, שם הוא נוקלאוטיד או: diphosphate guanosine (תמ"ג), guanosine טריפוספט (GTP), guanosine 5'-diphosphate, diphosphate 3'-(ppGpp), או guanosine 5'-טריפוספט, diphosphate 3'-(pppGpp), 0.1 מ"מ pyridoxal 5'-פוספט (PLP), ו - 1 mM β-mercaptoethanol / (β-ME). 1 מ"ל של B פתרון המורכב נתרן 100 mM MES-pH 6.5, 0.1 מ"מ PLP, 1 mM β-ME, ו - 50 ננומטר LdcI. LdcI היה מטוהרים כמתואר סניידר et al. 6 ו Kanjee et al. 14. 1 מ"ל של C הפתרון הזהה ל-B אך הפתרון אינו מכיל LdcI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 100 מ"ל של הפתרון להפסיק המורכב נתרן קרבונט M 1 (10.6 g/100 מ"ל) ו aliquot 50 μL לבאר כל צלחת 96-באר קלקר באמצעות פיפטה רב ערוצי. הוסף 30 μL מים לצלחת ואז לכסות. שים לב כי סכום של נפח המים הוסיף נפח מדגם שחולצו במהלך התגובה חייב אנזים שווה 50 μL. במקרה זה, 20 μL המדגם התגובה אנזים יוסרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 5 מ"ל של תמיסת TNBS על 10 מ"מ על ידי דילול 294 μL של 5% (w / v) מניות TNBS עם מים לעטוף μL 4706, בנייר אלומיניום ולשמור על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את התרמוסטט Eppendorf פלוס בשעה 37 ° C. פלוס תרמוסטט יש 24 בארות 6 עמודות. ראה איור 2 עבור סכמטית. 1.5 תווית מ"ל Eppendorf צינורות המציין את זהותו של נוקלאוטיד כי תיבחן (אחד לכל עמודה): GTP (עמודה A), התוצר המקומי הגולמי (עמודה B), ppGpp (עמודה C), pppGpp (עמודה D), לא נוקלאוטיד (E עמודה ), דגימות חלבון (עמודה F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Rack כמה קופסאות של 200 טיפים μL כך שכל שורה חלופי מושמט נותן סך של ארבע שורות של עצות. זה הכרחי לשימוש פיפטה רב ערוצי עם תרמוסטט פלוס heatblock במהלך assay האנזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן דיגיטלי Heatblock (VWR) בשעה 42 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 96-גם צלחת 2.0 מ"ל פוליפרופילן על הקרח להתקרר. </li></ol> 2) LdcI Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 Aliquot μL של פתרון עם נוקליאוטידים מתאימים 1.5 צינורות מ"ל Eppendorf בכל אחד מחמשת עמודי התרמוסטט Eppendorf. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 330 μL של B פתרון לשלושה צינורות F טור ולהוסיף 330 μL הפתרון C (שליטה ללא חלבון) אל הצינור הסופי בעמודה F. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את הפתרונות על 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. טיפ: לאחר 5 דקות, לנתק את כמוסות של הצינורות במרכז הבלוק חימום כדי למנוע מהם להפריע פיפטה רב לשמש הבאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש VWR μL 5-50 מרובת ערוצים פיפטה, 50 μL העברת צינורות בפה טור לתוך אחד הצינורות בעמודות AE. הפעל את שעון העצר ברגע הצינור הראשון הוא מעורב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב 2, 4 ו 6 דקות להסיר 20 μL המדגם באמצעות פיפטה רב ערוצי ולהוסיף הפתרון להפסיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: דגימות פתרון להפסיק יכול להיות מכוסה בניילון קפוא ב -20 ° C לעיבוד שלאחר מכן. הצלחות יש להפשיר בטמפרטורת החדר לפני תגובה עם TNBS. </li></ol> 3) TNBS תגובת ופיתוח צבע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL של פתרון 10 mM TNBS לפתרון להפסיק את השימוש הרב ערוצית פיפטה ואז לדגור על 42 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות. הפתרון יהפוך צבע צהוב / כתום כהה כמו TNBS מגיב עם ליזין לבין קדברין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 6 דקות, לצנן את הצלחת על קרח כדי להאט את התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 100 μL של המדגם באמצעות 20-200 VWR פיפטה μL מרובת ערוצים ומניחים את צלחת 2 מ"ל עמוק היטב כי היה מקורר על הקרח. העברת קרח בדלי כדי fumehood. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 μL טולואן זה גם באמצעות HandyStep (מותג) pipettor לחזור ו 12.5 מ"ל פיפטה קצה (Plastibrand). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגבי את כל טולואן עודף באמצעות kimwipe ולכסות את הצלחת עם רצועות של סרט האריזה. הקפד ולחץ בחוזקה כלפי מטה כדי לקבל חותמת טוב. מכסים את צלחת 96-היטב עם מכסה שטוח ולאחר מכן ללחוץ בחוזקה במשך דקה 1 ו 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו הפתרונות להתיישב במשך 5 דקות. TNP-קדברין כעת בשלב טולואן העליון, בעוד TNP-ליזין נשאר מסיס במים (ראה איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 200 μL של טולואן באמצעות פיפטה 20-200 μL רב ערוצי לתוך צלחת 96-היטב לקריאה. הערה: הקפד לבדוק שכל מדגם סולקו ברורה אין שום שלב מימית בתחתית. הערה: מחסום להשתמש טיפים כדי למנוע נזק רב ערוצי פיפטה של ​​טולואן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרא את ספיגת ב 340 ננומטר קורא SpectraMax 340 צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנקות את הצלחת קוורץ, לשטוף את טולואן עם מים במקום צלחת קוורץ גדולמגש זכוכית בשכונה קטר. יוצקים מעל 100 מ"ל של תערובת 07:03 של 70% (v / v) חומצה חנקתית: 95% (v / v) אתנול לכסות את הצלחת קוורץ עם מגש הזכוכית השני. אזהרה: התגובה היא הגנה ללבוש אקסותרמית מאוד נפיץ לפעמים מתאימים להבטיח כי אבנט ברדס עשן מוגדר הרמה הנמוכה "6 אחרי קירור, לשטוף חומצה חנקתית עם מים ואז אתנול 95%.. </li></ol> 4) נציג תוצאות 1) קדברין רגיל Curve (איור 3) Assay בוצע כמתואר אך ללא L-ליזין או LdcI וריכוזים שונים במקום קדברין שימשו כדי לקבוע באופן אמפירי את הטווח הליניארי של assay. Assay היה ליניארית OD 340 של 0.25, המקביל ל ~ 22 nmoles של קדברין (איור 3). 2) פעילות LdcI (איור 4) הפעילות של LdcI לבד היה נחוש בדעתו להיות 153.5 (± 18.1) nmoles קדברין min-1 מיקרוגרם LdcI-1 ב-pH 6.5. פעילות LdcI אינו מושפע בנוכחות 100 מיקרומטר GTP או התמ"ג אך הוא חזק עכבות (&gt; 10 פי) בנוכחות pppGpp ו ppGpp (איור 4). <img src="/files/ftp_upload/2094/2094fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. תרשים סכמטי של התגובה LdcI. התגובה decarboxylation של L-ליזין לייצר CO 2 ו קדברין מוצג כמו גם התגובה הבאים עם TNBS ב-pH גבוה כדי לייצר N, N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-קדברין) ו-N, N "-bistrinitrophenyllysine (TNP-ליזין). בהתבסס על et Phan al.11 <img src="/files/ftp_upload/2094/2094fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. ההתקנה של טרמוסטט Eppendorf. הפריסה של דגימות התרמוסטט Eppendorf 24 גם מוצג יחד עם תיאור של הצעדים של assay (מסומן באותיות מודגשות). החצים מצביעים על העברת התגובה פתרונות על פי הפרוטוקול. הסרת פתרון התגובה לפתרון להפסיק בצלחת 96-טוב מצוין גם. <img src="/files/ftp_upload/2094/2094fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. קדברין Curve רגיל. העלילה של ספיגת ב 340 ננומטר לעומת nmoles של קדברין מוצג. ברים שגיאה מייצגים את סטיית התקן של לפחות שלוש מדידות עצמאיות. הקו של בכושר הטוב ביותר מוצג גם ויש לו R2 של 0.996. <img src="/files/ftp_upload/2094/2094fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. תוצאות LdcI assay. חלקת קצב הפעילות LdcI (ב nmoles קדברין המיוצר min-1-1 מיקרוגרם LdcI) מוצגת נוכחותם של 100 מיקרומטר GTP, תוצר, pppGpp, ppGpp ובהעדר של נוקלאוטיד. נוקלאוטידים תגובה מחמירים (p) ppGpp מסוגלים פעילות LdcI עיכוב משמעותי. ברים שגיאה מייצגים את סטיית התקן של לפחות שש מדידות עצמאיות.

<ol><li>Gale, E. F., Epps, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+the+pH+of+the+medium+during+growth+on+the+enzymic+activities+of+bacteria+%28Escherichia+coli+and+Micrococcus+lysodeikticus%29+and+the+biological+significance+of+the+changes+produced%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The effect of the pH of the medium during growth on the enzymic activities of bacteria (Escherichia coli and Micrococcus lysodeikticus) and the biological significance of the changes produced.</a> Biochem J. 36, 600-618 (1942).</li>
<li>Foster, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+acid+resistance%3A+tales+of+an+amateur+acidophile%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli acid resistance: tales of an amateur acidophile.</a> Nat Rev Microbiol. 2, 898-907 (2004).</li>
<li>Castanie-Cornet, M. P., Penfound, T. A., Smith, D., Elliott, J. F., Foster, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+acid+resistance+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Control of acid resistance in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 181, 3525-3535 (1999).</li>
<li>Iyer, R., Williams, C., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine-agmatine+antiporter+in+extreme+acid+resistance+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Arginine-agmatine antiporter in extreme acid resistance in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 185, 6556-6561 (2003).</li>
<li>Sabo, D. L., Boeker, E. A., Byers, B., Waron, H., Fischer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+physical+properties+of+inducible+Escherichia+coli+lysine+decarboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and physical properties of inducible Escherichia coli lysine decarboxylase.</a> Biochemistry. 13, 662-670 (1974).</li>
<li>Snider, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+a+distinctive+complex+between+the+inducible+bacterial+lysine+decarboxylase+and+a+novel+AAA%2B+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Formation of a distinctive complex between the inducible bacterial lysine decarboxylase and a novel AAA+ ATPase.</a> J Biol Chem. 281, 1532-1546 (2006).</li>
<li>Kashiwagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+the+genes+for+putrescine+transport+protein+and+ornithine+decarboxylase+at+16+min+on+Escherichia+coli+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Coexistence of the genes for putrescine transport protein and ornithine decarboxylase at 16 min on Escherichia coli chromosome.</a> J Biol Chem. 266, 20922-20927 (1991).</li>
<li>Schneider, G., Kack, H., Lindqvist, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+manifold+of+vitamin+B6+dependent+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">The manifold of vitamin B6 dependent enzymes.</a> Structure. 8, 1-6 (2000).</li>
<li>Cashel, M., Gentry, D. R., Hernandez, V. J., Vinella, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCashel%2C+M+%22Escherichia+coli+and+Salmonella+%3A+cellular+and+molecular+biology%22">Escherichia coli and Salmonella : cellular and molecular biology</a>. Curtiss, R., Neidhardt, F. C. , ASM Press. Washington, D.C. 1458-1496 (1996).</li>
<li>Magnusson, L. U., Farewell, A., Nystrom, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ppGpp%3A+a+global+regulator+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">ppGpp: a global regulator in Escherichia coli.</a> Trends in Microbiology. 13, 236-242 (2005).</li>
<li>Phan, A. P., Ngo, T. T., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+assay+for+lysine+decarboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric assay for lysine decarboxylase.</a> Anal Biochem. 120, 193-197 (1982).</li>
<li>Park, Y. K., Bearson, B., Bang, S. H., Bang, I. S., Foster, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+pH+crisis%2C+lysine+decarboxylase+and+the+acid+tolerance+response+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Internal pH crisis, lysine decarboxylase and the acid tolerance response of Salmonella typhimurium.</a> Mol Microbiol. 20, 605-611 (1996).</li>
<li>Merrell, D. S., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cadA+gene+of+Vibrio+cholerae+is+induced+during+infection+and+plays+a+role+in+acid+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The cadA gene of Vibrio cholerae is induced during infection and plays a role in acid tolerance.</a> Mol Microbiol. 34, 836-849 (1999).</li>
<li>Kanjee, U., Gutsche, I., Alexopoulos, E., Zhao, B., Bakkouri, M. E. l, Thibault, G., Liu, K., Ramachandran, S., Snider, J., Pai, E. F., Houry, W. A., A, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage+between+the+Bacterial+Acid+Stress+and+Stringent+Responses+Revealed+by+the+Structure+of+the+Inducible+Lysine+Decarboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Linkage between the Bacterial Acid Stress and Stringent Responses Revealed by the Structure of the Inducible Lysine Decarboxylase.</a> EMBO Journal. 30, 931-944 (2011).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

ב assay decarboxylase ליזין, TNBS הוא הגיב עם אמינים העיקרי של L-ליזין קדברין כדי ליצור TNP-ליזין TNP-קדברין adducts (איור 1). בשל נוכחותם של הקבוצה חומצה carboxylic על TNP-ליזין, adduct זה נשאר מסיסים במים בעוד TNP-קדברין, חסרה הקבוצה חומצה carboxylic, הוא מסוגל מחיצות לתוך טולואן 11. סוג זה של assay יכול להיות מנוצל באופן נרחב יותר על סוגים אחרים של חומצות האמינו שבו הפסד של קבוצת חומצה carboxylic מתרחשת במהלך התגובה. זו מתרחשת במהלך decarboxylation של ornithine-L על ...

<table><tbody><tr><td>2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2297</td><td></td></tr><tr><td>0.1 mM pyridoxal 5&amp;rsquo;-phosphate (PLP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9255</td><td></td></tr><tr><td>Cadaverine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D22606</td><td></td></tr><tr><td>לוחיות פוליסטירן בעלות 96 בארות</td><td>Sarstedt Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>לוחית קוורץ בעלת 96 בארות</td><td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בלוק חימום דיגיטלי VWR</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThermoStat Plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>לוחיות פוליפרופילן בעלות 96 בארות, 2.0 mL</td><td>Axygen Scientific</td><td>P-DW-20-C</td><td></td></tr><tr><td>פיפטור חוזר Handy Step</td><td>Brand GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טיפים לפיפטור חוזר, 12.5 mL</td><td>Brand GmbH</td><td>702378</td><td></td></tr><tr><td>קורא לוחות SpectraMax 340PC</td><td>SpectraMax</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assay למדידת פעילות escherichia coli ועין מתנהלת ליזין decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli הוא חיידק enteric כי הוא מסוגל לגדול על פני טווח רחב של ערכי ה-pH (pH 5-9) 1, לא ייאמן, הוא מסוגל לשרוד חומצה קיצונית מדגיש כולל מעבר דרך הקיבה יונקים שבו pH יכול ליפול נמוך כמו pH פבואר 01-02. כדי לאפשר כזה מגוון רחב של הישרדות pH חומצי, א coli בעלת ארבעה שונה ועין מתנהלת חומצה אמינית decarboxylases כי המצע שלהם decarboxylate חומצות אמינו בצורה פרוטון תלויי ובכך להעלות את ה-pH הפנימי. Decarboxylases כוללים חומצה גלוטמית decarboxylases GadA ו GadB 3, decarboxylase ארגינין עדיה 4, decarboxylase ליזין LdcI 5, 6 ו decarboxylase ornithine SpeF 7. כל אנזימים אלה לנצל pyridoxal-5&#39;-phospate כגורם משותף 8 ולתפקד יחד עם המצע מוצר antiporters-הקרום הפנימי להסיר מוצרים decarboxylation למדיום חיצוני תמורת מצע טרי 2. במקרה של LdcI, antiporter ליזין-קדברין נקרא CadB. לאחרונה, אנו נקבע את מבנה רנטגן של גביש LdcI ל 2.0, ואנו גילו מולקולה קטנה, רומן חייב LdcI התגובה מחמירים הרגולטור guanosine 5&#39;-diphosphate, diphosphate 3&#39;-(ppGpp) 14. התגובה מחמירים מתרחשת כאשר התאים גדל באופן אקספוננציאלי ניסיון חסך תזונתי או אחת למספר מדגיש אחרים 9. כתוצאה מכך, התאים לייצר ppGpp שמוביל מפל איתות ששיאה במעבר גידול מעריכי לגידול שלב נייח 10. אנחנו הוכיחו כי ppGpp הוא מעכב ספציפי של LdcI 14. כאן אנו מתארים את assay decarboxylase ליזין, שונה מן assay שפותחה על ידי Phan et al. 11, שיש לנו כדי לקבוע את הפעילות של LdcI והשפעת pppGpp / ppGpp על פעילות זו. התגובה decarboxylation LdcI מסיר את קבוצת α-carboxy של L-ליזין מייצרת פחמן דו חמצני קדברין polyamine (1,5-diaminopentane) 5. L-ליזין קדברין ניתן הגיבו 2,4,6-trinitrobenzensulfonic חומצה (TNBS) ב-pH גבוה כדי לייצר N, N&#39;-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-קדברין) ו-N, N&#39;-bistrinitrophenyllysine (TNP-ליזין), בהתאמה 11. TNP-קדברין ניתן להפריד TNP-ליזין כמו לשעבר הוא מסיס בממסים אורגניים כגון טולואן בזמן האחרון הוא לא (ראו תרשים 1). טווח ליניארי של assay נקבע באופן אמפירי באמצעות מטוהרים קדברין.

הפעילות של decarboxylase ועין מתנהלת ליזין מנוטר על ידי מגיבים המצע L-ליזין לבין המוצר קדברין עם חומצה 2,4,6 trinitrobenzensulfonic-לטופס adducts כי יש מסיסות ההפרש ב טולואן.

Assay למדידת פעילות Escherichia coli ועין מתנהלת ליזין Decarboxyase

Escherichia coli הוא חיידק מעייים המסוגל לגדול בטווח רחב של ערכי pH (pH 5 - 9)1 ו, באופן מדהים, מסוגל לשרוד תנאים קיצוניים של...

המטרה הכללית של הליך זה היא למדוד את הפעילות של lysine decarboxylase הניתן להשראה מ-e coli באמצעות בדיקה קולורימטרית. הדבר מושג תחילה על ידי תגובת התסבסב L lysine עם האנזים LDCI בתוך מבחנה מסוג EOR, ולאחר מכן על ידי הוצאת דגימות בשלוש נקודות זמן לתוך תמיסת עצירה. השלב השני של ההליך הוא תגובת הדגימות בתמיסת העצירה עם 2 4 6 TRI nitro benzene SUL acid או T-M-B-S-T-M-B-S, אשר מגיב עם הקבוצה הראשונית של התסבסב ומייצר את המוצרים TMP lysine ו-TMP cadaver בהתאמה.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא הפרדת ה-TMP lysine המסיס במים מה-TMP cadaver שאינו מסיס במים, על ידי מיצוי של ה-TMP cadaver לתוך טולואן. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא מדידת הבליעה באורך גל של 340 ננומטר של ה-TMP cadaver בפאזה של הטולואן. לבסוף, ניתן לקבל את התוצאות.פעילות ה-CHO LDCI מווסתת על ידי נוכחותם של מולקולות השמסור לתגובת העומד (stringent response). P-P-G-P-P ו-P-P-P-G-P-P. שלום, אני Hir מהמעבדה של ד"ר Wali, מהמחלקה לביוכימיה באוניברסיטת טורונטו.היום נדגים לכם פרוצדורה למדידת הפעילות של lysine decarboxylase האינדוקיבילי של E. coli, המכונה LDCI. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדתנו כדי לחקור את ההשפעה של רגולטורים חדשים על LDCI ועל מסלול התגובה לעקה חומצית של חיידקים מעייים. אז בואו נתחיל.כדי להתחיל בהליך זה, הכין את כל התמיסות הדר

an-assay-for-measuring-activity-escherichia-coli-inducible-lysine

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים עלות נמוכה, גבוה שיטת התפוקה למסך לפעילות endoglucanase פטרייתי...

הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli</em

דיווחנו לאחרונה גישה חדשנית להפקת בדיקות DNAzyme fluorogenic כי ניתן להחיל על הקמת פשוט, "תמהיל-and-לקרוא" assay ניאון לגילוי חיידקי. אלו בדיקות דנ"א מיוחד לזרז את המחשוף של מצע ה-DNA-RNA-chromophore שונה chimeric בנוכחות תערובת תאי גולמי (CEM) המיוצר על ידי חיידק מסוים, ובכך לתרגם את גילוי החיידק לדור אותות הקרינה. בדוח זה נתאר את הליכי הניסוי העיקריים שבהם בדיקה DNAzyme מסוים כונה "RFD-EC1" מועסק לצורך זיהוי של החיידק...

זיהוי של חיידקים באמצעות DNAzymes Fluorogenic

אוטומטי קיימא ויסות מערכת חיידקים לטיפול של זיהומי נפט תוכנן באמצעות חלקי DNA החלפה סטנדרטיים (BioBricks).

Toolkit כדי לאפשר גיור פחמימן בסביבות מימיות

סרטון זה מדגים בדיקה ביולוגית מהירה לחקירת פעילות אנדוטוקסין בדגימת דם שלמה באמצעות שיטה מבוססת כימילומינסנציה. בדיקה זו היא בדיקת סמן ביולוגי מהירה ורגישה לאבחון בשלב מוקדם של אלח דם בתיווך אנדוטוקסין.

בדיקת פעילות אנדוטוקסין: בדיקה ביולוגית מבוססת כימילומינסנציה לחקר פעילות אנדוטוקסין בדגימת דם

אנו מתארים assay איכותי לפקח תחרות חיידקים מתווכת על...

Assay חזותי לפקח תחרות קטריאלי T6SS בתיווך

גישה יעילה לבדיקות סקר לאיתור הביטוי של חלבונים בממברנה רקומביננטי בcoli Escherichia מבוסס על היתוך לחלבון פלואורסצנטי ירוק מוצגת.

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

בזאת אנו מציגים פרוטוקול למדוד במיטה את פעילות האנדוטוקסין של דגימות הדם האנושיות. הבדיקה של פעילות אנדוטוקסין היא מבחן פשוט לבצע והוא עשוי להיות ביוארקר שימושי בחולים באורח אנוש חולה עם אלח דם.

שיטת פעילות אנדוטוקסין לאיתור דם כולו אנדוטוקמיה בחולים חולי אנוש

כאן מוצג פרוטוקול לבדיקת אנזימים לחילוף חומרים של חומצות גרעין, תוך שימוש בדוגמאות של אנזימי ליגאז, נוקלאז ופולימראז. הבדיקה משתמשת באוליגונוקלאוטידים מסומנים פלואורסצנטית ולא מסומנים שניתן לשלב ליצירת דופלקסים המחקים נזקי RNA ו/או DNA או מתווכי מסלול, ומאפשרים אפיון התנהגות אנזימים.

שימוש באוליגונוקלאוטידים סינתטיים שעברו שינוי כדי להעריך אנזימים לחילוף חומרים של חומצות גרעין

מחקר זה קבע שיטה המשתמשת בהרחבת הקוד הגנטי כדי לשלב בהצלחה את לקטיל-ליזין (Klac) באתרים ספציפיים של האנולאז-1 (hENO1) והסופרפולקציה GFP (sfGFP) באשריכיה קולי ותאי יונקים.

לקטילציה ליזין ספציפית לאתר באמצעות התרחבות קוד גנטי ב-E. coli ובתאים יונקים

אנו מציגים שיטה באמצעות MALDI ספקטרומטריית מסה וכימיה מתילציה רדוקטיבי לכמת שינויים מתילציה ליזין.

יישום MassSQUIRM עבור מדידות כמותיות של פעילות Demethylase ליזין

למדו למדוד פעילות אנזים lysine decarboxylase ב-Escherichia coli באמצעות מבחן צבעוני. השיטה כוללת הפרדת מוצרי תגובה בתולואן ומדידת ספיגה ב-340 ננומטר לקביעת קינטיקת האנזים.

Assay למדידת פעילות Escherichia coli ועין מתנהלת ליזין Decarboxyase

גלה סרטונים נוספים