שיטה בידוד איילט Murine והשתלות כליה Subcapsular

השתלת לולאה הוצעה כטיפול פוטנציאלי לסוכרת מסוג 1. עם זאת, שתי מגבלות עיקריות מונעות ממנה להיות מציאות קלינית נפוצה. ראשית, יש צורך במספר רב של לולאות לכל מקבל.

מכיוון שלולאות מתקבלות מתורמי איברים, מספר הנמענים הפוטנציאליים מוגבל מאוד. השתלה שנייה דורשת טיפול לכל החיים בתרופות מדכאות חיסון חזקות, מה שמציב את המטופל, במיוחד את אוכלוסיית הילדים, בסיכון לממאירות, זיהום ואי ספיקת כליות. השתלת לולאה מתחת לקפסולת הכליה של העכבר מבוצעת כדי לחקור אסטרטגיות לשיפור תוצאות ההשתלה הקלינית.

לולאות שבודדו מעכברים תורמים בריאים מוינו לקבוצות והוכנו להשתלה. לאחר מכן מושתלים הלולאות בחלל התת-קפסולרי של הכליה. בעכברים מושתלי סוכרת תפקוד השתלת העפעפיים מוערך על ידי ניטור רמות הגלוקוז בדם, מה שמגלה כי כ-250 עד 350 לולאות ישחזרו את הגליקמיה בעכבר מושתל 20 גרם תוך 24 שעות מההשתלה.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית באשר לשלבים לקנולציה. קשה ללמוד את צינור המרה המשותף והעברת הלולאות לחלל התת-קפסולרי של הכליה. שלבים אלה דורשים זיהוי של מבני רקמות, ידיים יציבות ושימוש בטכניקה הממזערת נזק לרקמות.

הניחו עכבר שהומת בשכיבה על מגבת נייר בטווח החיתוך ורססו את הבטן באתנול 70%. השתמש במספריים כדי לפתוח את הבטן עם חתך V מאזור הערווה לשתי הרגליים הקדמיות. העכבר נמצא מתחת לטווח הניתוח.

מקם אותו כשהראש מצביע לעבר הצופה. אתר את כניסת התריסריון של צינור המרה המשותף בעזרת מהדק המוסטט, פתח התריסריון של צינור המרה המשותף. יש למקם את המוסטט כך שכאשר הוא דחוס, הוא עובר בדיוק לאורך גבול מעי הלבלב.

כאן יודגמו שתי שיטות לקנולציה של צינור המרה. שיטת היד החופשית ושיטת המלקחיים מסייעות לקנולציה של צינור המרה. בשיטת היד החופשית, משוך את המוסטט המהודק על התריסריון הרחק מראש העכבר לכיוון הזנב כך שצינור המרה המשותף הופך מתוח.

יש מפגש בצינור המרה קרוב לכבד שבו מרה המתנקזת מכיס המרה ואנזימים מהכבד נפגשים לפני הכניסה למעיים, משוך את צינור המרה בחוזקה כדי לחשוף את החלק הפנימי של מצב V. מחט כפופה בקוטר 27 המחוברת למזרק של חמישה מיליליטר כך שהמחט מחליקה ישר דרך ה-V ומקננת ישירות את החלק התחתון של הצינור. החלק את המחט כמה מילימטרים מעבר לקצה השיפוע כדי למנוע זרימה חוזרת לכבד ולכיס המרה.

לאחר שהקנולציה מוצלחת, יש לחלחל את הלבלב על ידי הוצאת שני מיליליטר של ליאז מהמזרק. שימו לב להרחבת הלבלב מעל הקיבה כאינדיקציה לקנולציה אופטימלית. לחלופין, ניתן לקנולציה של צינור המרה.

שימוש בשיטת ציסטה מלקחיים. משוך את המוסטט C המהודק על התריסריון הרחק מראש העכבר לכיוון הזנב כך שצינור המרה המשותף יהפוך לנזק. לאחר מכן באמצעות מחט כפופה בגודל 27 המחוברת למזרק של חמישה מיליליטר, נקב את הפאשיה מתחת לצינור המרה המשותף קרוב לכבד.

השתמש במחט כדי לנקות את הפאשיה מהצינור כשהמחט עדיין במקומה. הניחו את המוסטט והרימו זוג מלקחיים. השתמש בזרוע אחת של המלקחיים הפתוחים כדי לתמוך בצינור המרה שבו המחט פינתה את הפאשיה תוך משיכת הצינור והמלקחיים קדימה.

החלק את המחט לתוך הצינור באמצעות המלקחיים כמעצור אחורי. קנולציה מוצלחת מסומנת על ידי התרחבות אחידה של אזור הלבלב על גבי הקיבה. לאחר שהלבלב עבר, הסר את המוסטט מהתריסריון.

לאחר מכן השתמש במלקחיים כדי להרים את התריסריון והשתמש בזוג מלקחיים שני כדי להפריד את הלבלב מהמעיים. לאחר מכן, משוך את הלבלב מהחלק העליון של הקיבה והטחול. לבסוף, הרם את הלבלב מהבטן וחתך אותו מחיבורי הפאשיה שנותרו למעי, לקיבה ולטחול.

מניחים את הלבלב בצינור חרוטי של 50 מיליליטר ומניחים אותו על קרח. יש לדגור על הלבלב בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס על פי ההוראות בפרוטוקול הכתוב המצורף. לאחר הדגירה, הוסף 20 מיליליטר מדיה לצינורות ונתק את הרקמה על ידי ניעור נמרץ של הצינורות 40 פעמים תוך 10 שניות.

שלב זה הוא קריטי להתאוששות אופטימלית של סיגליות. תאי ספין הם 800 סיבובים לדקה. Resus מוציאים 15 מיליליטר מדיה ומעבים את הדגימות.

יוצקים את התרחיץ התלוי דרך רשת תיל של 0.419 מילימטר ומשפכים אותו לצינור חרוטי טרי של 50 מיליליטר. שטפו את הצינור הראשון עם 10 מיליליטר נוספים של מדיה המכילה 10% סרום בקר עוברי ושפכו אותו דרך רשת התיל גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ראוס, כופפו את הגלולה בחמישה מיליליטר של טמפרטורת החדר שלו אטום 10 77. לאחר מכן מערבולת בעדינות במשך מספר שניות, הוסף חמישה מיליליטר נוספים של האטום שלו סביב החלק הפנימי של הצינור כדי לשטוף את הלולאות מדופן הצינור לאט לאט כדי לכסות 10 מיליליטר של RPMI חופשי בסרום לאורך צד הצינור בקצב של מיליליטר אחד ל-10 שניות.

ממשק חד צריך להיות ברור. לאחר מכן סובבו את הדגימות בצנטריפוגת דלי מתנדנדת ב-20 מעלות צלזיוס ופי 900 מכוח הכבידה למשך 20 דקות עם תאוצה איטית מאוד וללא בלימה בעקבות הצנטריפוגה, האיים יופרדו מהתאים האקסוקריניים באמצעות פיפטה סרולוגית חד פעמית של 10 מיליליטר. העבר את הלולאות מממשק המדיה histo Paque לצינור חרוטי טרי של 50 מיליליטר.

ניתן לאסוף מספר צינורות בשלב זה כדי להסיר את שאריות הלולאות, צינורות המילוי האטומים שלו עם סרום המכיל מדיה וגלולה את האיים על ידי צנטריפוגה של הצינורות למשך שתי דקות ב-800 סיבובים לדקה. ואז ראוס השעו את האיים במדיה חדשה. חזור על שלב זה לפחות פעמיים. ראוס.

תלו את המזרן בחמישה מיליליטר מדיה. הניחו מסננת תאי ניילון 0.1 מילימטר הפוכה על צינור חרוטי של 15 מיליליטר. פיפטה את תמיסת התאים התלויה דרכו כדי לאסוף את הלולאות.

לאחר מכן שטפו את צינור ה-50 מיליליטר עם שישה מיליליטר מדיה נוספים והעבירו אותו דרך המסננת. מניחים טיפה של שלושה מיליליטר בינוני בצלחת פטרי של 10 סנטימטרים. הפוך את מסננת התאים וטבל אותה בטיפת המדיה כדי לאסוף את הלולאות, פיפטה חמישה עד שבעה מיליליטר נוספים של מדיום תרבית דרך המסננת לתוך צלחת הפטרי.

כדי לאסוף את כל הלולאות שנותרו מהמסננת תחת יעד פי ארבעה, בחר לולאות בנפרד עם פיפטה P 200 והעביר אותן לצינור מיקרו פוגה של 1.5 מיליליטר. תמונות אלה מראות לולאות מבודדות משישה עכברים שחורים בני 12 שבועות C 57. ניתן להעריך את טוהר ואיכות הלולאות במיקרוסקופ עם סיום הליך הבידוד.

לדוגמה, שתי התמונות המוצגות כאן מציגות שדה מייצג שבו נמצאים פסולת וזיהום תאים אקסוקריניים. בעת בחירת לולאות לניסוי, הימנע מלקטוף תאים אקסוקריניים מזהמים או לולאות שנראות לא בריאות. לולאות עם מרכזים נמקיים אינן בריאות כפי שמוצג באיור זה שצולם 24 שעות לאחר הבידוד, מרכזים נמקיים לא ייראו מיד לאחר הבידוד.

לולאות שהן תאים נשפכים הן בלתי נמנעות וניתן להשתמש בהן בהשתלת לולאות בסרטון זה של 24 שעות של לולאות. מיד לאחר הבידוד, מרכזים נמקיים מתפתחים בתוך רבות מהלולאות. נראה כי מרכזים נמקיים אלה נפלטים מהעינית לקראת סוף ההקלטה תוך כדי קטיף לולאות.

קבץ אותם כך שלכל צינור תהיה חלוקה אחידה של איכות וגודל העפעפיים. לדוגמה, כל קבוצה של 15 לולאות עשויה להכיל ארבע לולאות גדולות, שש לולאות בינוניות וחמש לולאות קטנות. מקום. ניתן להשתמש בצינור על לולאות קרח באופן מיידי להשתלה או לתפעל אותו.

לפני השימוש. הנח קצה טעינת ג'ל סטרילי לתוך פתח של צינור מיקרו התמזג בנפח 1.5 מיליליטר כך שתהיה כיפוף עדין, מה שיוצר צורת U בקצה הצר של הקצה. שני פתחי הקצה צריכים להיות פונים ישירות כלפי מעלה מחוץ לצינור האשפה המיקרו

הסר בעדינות צינור לולאות מהקרח. ודא שכל הלולאות התיישבו בתחתית הצינור. בעזרת פיפטה P 200 אוספים בעדינות את הלולאות בנפח מינימלי מתחתית הצינור ומעבירים אותן לקצה המעוקל המוכן.

לאחר שהלולאות שקעו, הסר כמה שיותר מהמדיה מהקצה על ידי שאיבת המדיה דרך הפתח הגדול של קצה טעינת הג'ל הנושא את העפעפיה עם קצה טעינת ג'ל טרי המחובר לפיפטה P 200. חבר את הקצה הלא משופע של הצינור לפתח הצר של קצה טעינת הג'ל הנושא את האי. לאחר מכן חבר את הקצה לפיפטה P 200 ודחף בעדינות את האיים לתוך הצינור.

לאחר מכן, חבר את הקצה הלא משופע של צינור PE 50 למחט של מזרק המילטון בנפח 25 מיקרוליטר. כשהבוכנה נמשכת כדי ללחוץ על הבוכנה של המזרק עד שהלולאות נמצאות במרחק של כ- 0.5 סנטימטרים מהפתח המשופע. הניחו את המזרק בצד כך שהלולאות יוכלו להתיישב במסה אחת ליד הפתח המשופע של הצינור בזמן שהכליה מוכנה לקבל את הלולאות.

הכן את מקום הניתוח על ידי גזירת שיער וקרצוף העור עם בטדין לסירוגין עם 70% אלכוהול איזופרופיל שלוש פעמים. התחל את הליך השתלת העפעפיים על ידי ביצוע צביטה בבוהן כדי לאשר הרדמה בעכבר המקבל. הנח את ציר מוט הזכוכית ישירות מתחת לעכבר ומתחת לכליה בניצב לחוט השדרה.

לאחר מכן אתר את הכליה דרך העור והניח וילון כירורגי סטרילי. לאחר איתור הכליה, השתמש במספריים של McFerson banis כדי לבצע חתך של שני סנטימטרים דרך הדרמיס ישירות מעליו בניצב לחוט השדרה. חתך זה יחשוף את דופן הצפק בעזרת המספריים.

בצע חתך של סנטימטר אחד דרך דופן הצפק באותו כיוון כמו החתך דרך שכבת העור באמצעות פיר מוט הזכוכית כמעצור אחורי, כפה את הכליה דרך פתח הצפק על ידי לחיצה כלפי מטה על המשטח הסמוך. הרטיבו את פני הכליה החשופה עם PBS קר וסטרילי כקרח באמצעות אפליקטור ספוג כותנה. חזור על השלב כל כמה דקות לפי הצורך כדי למנוע את התייבשות קפסולת הכליה.

בעזרת מחט בגודל 27, בצע חתך של 0.2 סנטימטר דרך קפסולת הכליה על פני המשטח הקדמי של הכליה. נע מהצד הצדדי השמאלי לכיוון הצד הצדדי הימני, הכנס צינור נימי זכוכית נמשך להבה. בדוק דרך החתך שנעשה קודם לכן והזיז אותו בכיוון אחורי לאורך המשטח הצדדי הגבי של הכליה.

כדי ליצור כיס בין קפסולת הכליה לפרנכימת הכליה, העבר את הלולאות במזרק המילטון המוכן בנפח 25 מיליליטר לקצה הפתח המשופע של הצינור הגמיש. לאחר מכן הכנס את הקצה המשופע כלפי מעלה לתוך השקית התת-קפסולרית. הקצה הארוך נמצא במגע עם פרנכימת הכליה.

העבר את הצינור לקצה האחורי ביותר של הקפסולה. לאחר מכן העבירו לאט את הלולאות מצינור PE 50 לתוך השקית התת-קפסולרית על ידי לחיצה על הבוכנה של המזרק. כאשר הלולאות ממלאות את השקית, החזר לאט לאט את הצינור הגמיש החוצה כדי לפנות יותר מקום.

לאחר הוצאת הצינור מהשקית, החלק את בדיקת הזכוכית לאורך המשטח החיצוני של הכליה מלפנים לאחור כדי לדחוס בעדינות את הלולאות לקצה הפרוקסימלי של השקית. בעזרת מלקחיים כפופים של הזרוע, הרם את רירית הצפק הסמוכה לפתח המיועד לכליה. לאחר מכן השתמש באפליקטור ספוג PBS עם קצה כותנה כדי לדחוף בעדינות את הכליה בחזרה לחלל הצפק.

סגור את העכבר על ידי הנחת תפרים על דופן הצפק וקליפס פצע לשכבת העור. החזר את העכבר לכלוב ולצג שלו. לצורך התאוששות, יש לספק מי אצטו מיין למעי העכבר.

C לולאות עכבר מבודדות. באמצעות השיטות המתוארות בסרטון זה ומינון מרפא הושתל בשישה עכברים שחורים אלוגניים C 57. רמות הגלוקוז בדם ללא צום נוטרו החל מהיום הראשון שלאחר הניתוח.

ניתן לראות דחייה בסביבות היום ה-17 בעכברים מושתלים של 20 גרם שקיבלו 300 לולאות מתורם אלוגני כאן. ההתאוששות נוטרה בעכברים שקיבלו 150 לולאות או 300 לולאות מתורמים סינגניים. לא נראית דחייה בהשתלות אלה מכיוון שהלולאות הן מתורמים סינגניים.

מינון העיניים הניתן מודד את התפקוד העיקרי של הלולאות מיד לאחר ההשתלה. בעוד שהחלמה שולית נצפתה עם 150 לולאות, התאוששות מלאה נצפתה כאשר הושתלו 300 לולאות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע את הצעדים הקריטיים הנדרשים לבידוד לולאות עכבר ולהשתיל את הלולאות הללו מתחת לחלל התת-קפסולרי של הכליה.

עם תרגול, תפתח את היכולת לשרוף במהירות את צינור המרה המשותף, שהוא השלב הקשה ביותר בפרוטוקול זה.