Name: שיטה בידוד איילט Murine והשתלות כליה Subcapsular (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-13T11:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 42 s
Description: למדו שיטה לבידוד איילטים מלבלב עכברים והשתלתם לתת-קפסולת הכליה. טכניקה זו מאפשרת חקר טיפולים פוטנציאליים בסוכרת מסוג 1 ובהערכת תפקוד השתל בחיות מודל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכת על ידי RO1 DK064938 (עד TH).

<ol><li>Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li>
<li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+as+a+treatment+for+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Optom+Assoc%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation as a treatment for diabetes.</a> J Am Optom Assoc. 69, 727-732 (1998).</li>
<li>Gangemi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+for+brittle+type+1+diabetes%3A+the+UIC+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation for brittle type 1 diabetes: the UIC protocol.</a> Am J Transplant. 8, 10-1111 (2008).</li>
<li>Zmuda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+ATF3%2C+an+adaptive-response+gene%2C+protects+islets+and+ameliorates+inflammation+in+a+syngenic+transplantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Deficiency of ATF3, an adaptive-response gene, protects islets and ameliorates inflammation in a syngenic transplantation model.</a> Diabetologia. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Bottino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+Human+Islets+to+Isolation+Stress+and+the+Effect+of+Antioxidant+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Response of Human Islets to Isolation Stress and the Effect of Antioxidant Treatment.</a> Diabetes. 53, 2559-2568 (2004).</li>
<li>Markmann, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+islet+cell+culture+in+vitro+at+24+degrees+C+on+graft+survival+and+MHC+antigen+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">The effect of islet cell culture in vitro at 24 degrees C on graft survival and MHC antigen expression.</a> Transplantation. 49, 272-277 (1990).</li>
<li>Terasaka, R., Lacy, P. E., Hauptfeld, V., Bucy, R. P., Davie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cyclosporin-A%2C+low-temperature+culture%2C+and+anti-Ia+antibodies+on+prevention+of+rejection+of+rat+islet+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">The effect of cyclosporin-A, low-temperature culture, and anti-Ia antibodies on prevention of rejection of rat islet allografts.</a> Diabetes. 35, 83-88 (1986).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Sterbenz, K., Davie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-temperature+culture+of+human+islets+or+in+vivo+treatment+with+L3T4+antibody+produces+a+marked+prolongation+of+islet+human-to-mouse+xenograft+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Low-temperature culture of human islets or in vivo treatment with L3T4 antibody produces a marked prolongation of islet human-to-mouse xenograft survival.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 8080-8084 (1987).</li>
<li>Schnedl, W. J., Ferber, S., Johnson, J. H., Newgard, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STZ+transport+and+cytotoxicity.+Specific+enhancement+in+GLUT2-expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">STZ transport and cytotoxicity. Specific enhancement in GLUT2-expressing cells.</a> Diabetes. 43, 1326-1333 (1994).</li>
<li>Eckhard, M., Brandhorst, D., Brandhorst, H., Brendel, M. D., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+in+osmolality+and+range+of+density+of+a+continuous+ficoll-sodium-diatrizoate+gradient+for+isopycnic+purification+of+isolated+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Optimization in osmolality and range of density of a continuous ficoll-sodium-diatrizoate gradient for isopycnic purification of isolated human islets.</a> Transplantation Proceedings. 36, 2849-2854 (2004).</li>
<li>Gores, P. F., Rabe, F., Sutherland, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+survival+of+intraportal+versus+subrenal+capsular+transplanted+islet+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Prolonged survival of intraportal versus subrenal capsular transplanted islet allografts.</a> Transplantation. 43, 747-749 (1987).</li>
<li>Nasr, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testicular+Immune+Privilege+Promotes+Transplantation+Tolerance+by+Altering+the+Balance+between+Memory+and+Regulatory+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Testicular Immune Privilege Promotes Transplantation Tolerance by Altering the Balance between Memory and Regulatory T Cells.</a> J Immunol. 174, 6161-6168 (2005).</li>
<li>Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+implantation+site+for+pancreatic+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation.</a> British Journal of Surgery. 95, 1449-1461 (2008).</li>
<li>Inoue, M., Maeno, T., Hatchell, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+allografted+pancreatic+islets+in+the+subretinal+space+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Res%22%5BJournal%5D)">Survival of allografted pancreatic islets in the subretinal space in rats.</a> Ophthalmic Res. 35, 48-53 (2003).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בסעיפים לעיל, תיארנו צעדים מפורטת בידוד השתלת הלבלב איים העכבר. כאן, אנו בקצרה להדגיש את הצעדים הם קריטיים להצלחת ההליכים. 1. איילט בידוד השלבים העיקריים הם מזהים זמן אופטימלי עיכול אנזימטי (1.4), מיצוב מהדק hemostat על פתיחת התריסריון של צינור המרה המשותף (2.2.3), cannulating את צינור המרה המשותף (2.3), רועד נמרץ של הלבלב לאחר 37 ° C לעכל (3.2), והסרת זיהום תא אקסוקרינית (3.3.7 ו - 3.3.16). צעדים אלה יש השפעה דרמטית על התשואה איכות, טוהר איים. אולי הצעד הכי מאתגר מבחינה טכנית הוא cannulation של צינור המרה המשותף. בעכברים רבים, את צינור המרה המשותף יכול להיות קשה לדמיין בשל fascia שמסביב. לכן, מקובל כי ניסיונות cannulate צינור המרה המשותף לגרום לחדירה של הרקמה fascia בלבד. במקרים אלה, Liberase מתחיל למלא את רקמת החיבור סביב ואינו perfuse את הלבלב. אם זאת הוא ציין, לעצור את זרימת Liberase למקם את המחט כך שהוא חודר לתוך לומן של צינור המרה. בעזרת תרגול, אפשר לזהות במהירות את המיקום האופטימלי עבור מיקום המחט כדי להשלים את cannulation מבלי לפגוע בצינור פריך. 2. השתלת איילט השלבים הקריטיים הגיוס STZ של סוכרת (5.1) לבין אספקה ​​יעילה של איים על הכיס subcapsular (5.3.14-5.3.16). STZ הוא אנלוגי גלוקוז באופן טבעי כי הוא רעיל באופן סלקטיבי את הפרשת האינסולין בתאי β-תאים של איי 9. עם זאת, רעילות סלקטיבית מתרחשת בטווח ריכוז צר יחסית. עדות לכך היא העובדה כי מינון גבוה של STZ יכול לגרום הקטלניות (2-3 ימים) מהיר בהעדר היפרגליקמיה. לכן, יש להקפיד לזהות את המינון האופטימלי של STZ עבור זן של עכברים וגיל בשימוש לפני כל ניסויים בקנה מידה גדול הם יזמו. המסירה הפיזית של איים על הכיס subcapsular גם צעד מפתח. כדי להשיג תוצאות עקביות, הכרחי כדי לצמצם את אובדן איים במהלך הלידה שלהם. זה יכול להתרחש אם יש פגמים או דמעות הקפסולה כליה מכסה את כיס או אם נפח מוזרק גדול מדי. נזק הקפסולה יכול להימנע על ידי מניפולציה עדינה וזהירה, ועל ידי שימוש בדיקה זכוכית חלקה להכין את הנרתיק subcapsular. בנוסף, נפח הזרקה ניתן למזער בהסרה זהירה של supernatant בשלב 5.3.6.3. אם supernatant יוסר עד לרמה של איים משקעים, יש בדרך כלל יותר מאשר מספיק מקום בכיס subcapsular למקום 400-500 איים. עם זאת, אם נפח הזרקה גדול מדי, איים נוטים לדלוף החוצה של כיס במהלך תהליך ההשתלה, להתפשר על שחזור של הניסוי. במסגרת פרוטוקול זה, אפשר לשנות כמה צעדים, ועדיין להשיג תוצאות משביעות רצון. אלה כוללים את הבאים: (א) השימוש אנזים שונה לעכל את הלבלב, (ב) שיטה אחרת לאספקת האנזים על הלבלב, (ג) שימוש מתמשך Ficoll-נתרן diatrizoate (FSD) שיפוע במקום צעד אחד צפיפות Histopaque1077, (ד) השתלת איון למקומות אחרים מאשר subcapsule את הכליה. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בפרוטוקול זה, Liberase משמש כדי להחליש את הקשר תאים תאים בתוך הלבלב. Liberase היא למעשה תערובת של מטוהרים מאוד collagenases כי הוכיחו שימושי בשחרור איים מהלבלב. עם זאת, collagenases מטוהרים פחות מסוגלים להשיג תוצאה דומה. לכן, ניתן להשתמש אחר ההכנות אנזים זמינים מסחרית עבור לעכל את הלבלב, כל עוד התנאי לעיכול מותאם להשיג איון איכות גבוהה, תשואה וטוהר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו כן ניתן לעכל את הלבלב ללא זלוף ductal של האנזים. מסירת Liberase דרך בצינור המרה המשותף מאפשר חשיפה מרבית של פני השטח כדי הלבלב האנזים. התוצאה היא מערכת העיכול עוד יותר של הלבלב ולשחרר יותר של איים שלמים. עם זאת, צעדים נוספים כדי להגדיל את שטח הפנים של הלבלב כדי האנזים יכול לשמש. לדוגמה, הלבלב מיותרות לפני דוגרים אותו Liberase או ישירות הזרקת Liberase באמצעות הקפסולה הלבלב ניתן להשתמש כדי לבודד איים. עם זאת, אין שיטה אחרת של משלוח Liberase יעיל כמו זלוף דרך בצינור המרה המשותף. לכן, הזרקה ישירה מיותרות או צריכים להישמר כמוצא אחרון, אם את צינור המרה המשותף פגומה ולא perfusable. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיטה חלופית עבור הפרדת איים מתאי אקסוקרינית כרוךהשימוש שיפוע FSD במקום Histopaque1077 10. הפרדה יעילה של איים מתאי אקסוקרינית בפרוטוקול זה בין השאר בשל צפיפות ההפרש בין שני סוגי התאים. Histopaque1077 יש צפיפות של 1.0771 גרם / מ&quot;ל ​​ב 25 ° C. בטמפרטורה זו, Histopaque הוא צפוף יותר מאשר איים אבל פחות צפוף מאשר תאים אקסוקרינית. לכן, תחת כוח של צנטריפוגה, Histopaque1077 כדורי התאים אקסוקרינית תוך הרמת איים על פני השטח. בעיקרון, כל חומר אחר עם צפיפות כי ניתן להפריד איים מתאי אקסוקרינית ניתן להשתמש בשלב זה ועל שיפוע FSD היא אחת חומר כזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם כל הכבוד למיקום עבור השתלת איונים, הקפסולה כליות להשתמש בפרוטוקול זה הוא אחד האתרים אפשרי מעטים. בעוד subcapsule כליה הוא האתר הנפוצות ביותר שדווחו של השתלה בעכברים, אתרי השתלת אחרים נמצאו כיעילים והם כוללים הפורטל הכבד וריד, מרחב subretinal, testis, כרית שומן epididymal, הטחול, הלבלב אפילו 11-14. בכל המקומות הללו יש יתרונות משלהם ואתגרים. לכן, הבחירה של אתר עבור איון השתלה צריך להיקבע על ידי שאלות פנה ואת הנסיבות הספציפיות של הניסויים. </li></ol> הוא האמין כי אסטרטגיות שיכולות להתגבר על המגבלות על איון השתלה באופן דרמטי לשפר את הפוטנציאל הטיפולי שלה. לכן, השימוש של מודל Murine כמפורט על ידי פרוטוקול זה מציע גישה אטרקטיבי עבור זיהוי אסטרטגיות כאלה.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL</td><td>ריאגנט</td><td>Roche Group</td><td>05401020001</td><td></td></tr><tr><td>סרום עוברי בקר (Fetal Bovine Serum)</td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque1077</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין סטראפטומייצין</td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ציטראט</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטוזוטוצין (Streptozotocin)</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-0130</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>ריאגנט</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>איסופלורן (Isoflurane)</td><td>ריאגנט</td><td>Vedco, Inc.</td><td>ISOSOL</td><td></td></tr><tr><td>צינורות נימיים מזכוכית</td><td>ציוד</td><td>Fisher Scientific</td><td>22362574</td><td></td></tr><tr><td>מזרק אינסולין</td><td>ציוד</td><td>BD Biosciences</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>מחט מזרק Gauge 27</td><td>ציוד</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>מזרק Hamilton #1702</td><td>ציוד</td><td>Fisher Scientific</td><td>14813133</td><td></td></tr><tr><td>צלחיות פטרי 10cm</td><td>ציוד</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875712</td><td></td></tr><tr><td>צלחיות פטרי 6cm</td><td>ציוד</td><td>Fisher Scientific</td><td>07770212</td><td></td></tr><tr><td>חוט תפר 6-0</td><td>ציוד</td><td>Ethicon Inc.</td><td>8726H</td><td></td></tr><tr><td>צינור גמיש PE 50</td><td>ציוד</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9083963</td><td></td></tr><tr><td>מזרק חד-פעמי 5ml</td><td>ציוד</td><td>BD Biosciences</td><td>309603</td><td></td></tr><tr><td>מבחנה קונית 50ml</td><td>ציוד</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>מבחנה קונית 15ml</td><td>ציוד</td><td>BD Biosciences</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>רשת ניילון 0.1mm</td><td>ציוד</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>רשת סוג Wire Mesh 0.419mm</td><td>ציוד</td><td>Newark Wire Cloth Company</td><td>0300241</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור אמבט מים</td><td>ציוד</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-5</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ לדיסקציה</td><td>ציוד</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Stemi SV6</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>ציוד</td><td>Nikon Instruments</td><td>TMS</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור לתרביות רקמה</td><td>ציוד</td><td>Napco</td><td>6300</td><td></td></tr><tr><td>מספרי דיסקציה</td><td>ציוד</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14393</td><td></td></tr><tr><td>מספרי McPherson-Vannas</td><td>ציוד</td><td>Kent Scientific</td><td>INS500260</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה מעוקלת</td><td>ציוד</td><td>Kent Scientific</td><td>INS15915</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה המוסטטית</td><td>ציוד</td><td>Kent Scientific</td><td>INS 500451</td><td></td></tr><tr><td>נבולייזר לאיסופלורן</td><td>ציוד</td><td>Smiths Medical</td><td>ISOTech 4 OHMEDA</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה עם סלי דלי (Swing Bucket)</td><td>ציוד</td><td>Dupont &amp;#8211; Sorvall</td><td>RT6000D</td><td></td></tr><tr><td>רוטור סלי דלי (Swing Bucket)</td><td>ציוד</td><td>Dupont &amp;#8211; Sorvall</td><td>H1000B</td><td></td></tr><tr><td>מד pH</td><td>ציוד</td><td>Mettler Toledo</td><td>09313509</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לטעינת ג'ל</td><td>ציוד</td><td>Fisher Scientific</td><td>05408151</td><td></td></tr><tr><td>טיפים p200</td><td>ציוד</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>111-0730</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטה בידוד איילט murine והשתלות כליה subcapsular

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

מאז עבודתו החלוצית מוקדם של Ballinger ו Reckard הוכחת כי השתלת איי לנגרהנס לתוך מכרסמים סוכרת יכול לנרמל את רמת הגלוקוז בדם, איון השתלה הוצע להיות טיפול פוטנציאלי עבור 1,2 סוכרת מסוג 1. לאחרונה, ההתקדמות האנושית איון השתלה חיזקו עוד יותר את הדעה הזאת 1,3. עם זאת, שתי המגבלות העיקריות למנוע איון השתלה מלהיות מציאות קליני נרחב: (א) את הדרישה של מספר גדול של איונים לכל מטופל, אשר קשה מפחית את מספר מקבלי פוטנציאליים, (ב) לצורך דיכוי חיסוני כבד, אשר משפיע באופן משמעותי אוכלוסיית הילדים המטופלים בשל פגיעותם החיסון לטווח ארוך. אסטרטגיות שיכולות להתגבר על המגבלות האלה יש פוטנציאל לשפר את התועלת הטיפולית של איון השתלה. איילט השתלת כליה תחת הקפסולה עכבר הוא מודל מקובל לחקור אסטרטגיות שונות כדי לשפר את איון השתלה. ניסוי זה מצריך את בידודו של איים באיכות גבוהה השתלת איים לנמענים סוכרתית. נהלים שניהם דורשים צעדים כירורגית כי ניתן להדגים טוב יותר מאשר באמצעות טקסט על ידי וידאו. הנה, אנחנו המסמך צעדים מפורטים נהלים אלה על ידי וידאו והן בפרוטוקול כתוב. אנחנו גם בקצרה על השתלת מודלים שונים: syngeneic, allogeneic, אוטואימוניות syngeneic ו allogeneic אוטואימוניות.

השתלה של איים מבודדים הוצע להיות טיפול פוטנציאלי עבור סוכרת מסוג 1. כאן אנו מתארים שיטה לבודד איים מהעכבר pancreata ואת השתלת אותם למרחב subcapsular של הכליה.

שיטה בידוד איילט Murine והשתלות כליה Subcapsular

מאז עבודתם החלוצית של Ballinger ו-Reckard, אשר הדגימה כי השתלה של איים של לנגרהס למכרסמים הסובלים מסוכרת יכולה לנרמל...

השתתלת איליים הוצעה כטיפול פוטנציאלי לסוכרת מסוג 1. עם זאת, שתי מגבלות עיקריות מונעות ממנה להפוך למציאות קלינית נפוצה. ראשית, נדרש מספר רב של איליים עבור כל מקבל.מכיוון שאיים של לבלב מופקים מתורמי איברים, מספר המקבלים הפוטנציאליים מוגבל מאוד. השתלה שנייה מחייבת טיפול לכל החיים במדכאי חיסון חזקים, דבר המעמיד את המטופל, ובמיוחד את האוכלוסייה הפדיאטרית, בסיכון לממאירות, זיהומים וכשל כלייתי. השתלת איים של לבלב תחת קפסולת הכליה של עכבר מבוצעת כדי לבחון אסטרטגיות לשיפור תוצאות ההשתלה הקליניות.איlets בודדו מעכברי תורמים בריאים, חולקו לקבוצות והוכנו להשתלה. לאחר מכן, ה-eyelets מושתלים לחלל התת-קפסולרי (subcapsular space) של הכליה. בעכברי מקבלים סוכרתיים, תפקוד הש Transplant של ה-eyelets מוערך על ידי ניטור רמות הגלוקוז בדם, המראות כי כ-250 עד 350 eyelets ישחזרו רמות סוכר תקינות (euglycemia) בעכבר מקבל במשקל 20 גרם בתוך 24 שעות מההשתלה.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית עבור שלבי הקניולציה של צינור המרה המשותף והעברת הלולאות למרחב התת-קפסולרי של הכליה, שכן קשה ללמוד אותם. שלבים אלו דורשים זיהוי של מבני רקמה, ידיים יציבות ושימוש בטכניקה הממזערת את הנזק לרקמה.הניחו עכבר שהורדם במצב גב (supine) על נייר סופג תחת מיקרוסקופ הדיסקציה ורססו את הבטן ב-70% ethanol. השתמשו במספריים כדי לפתוח את הבטן באמצעות חתך בצורת V מאזור הפוביס ועד לשתי הרגליים הקדמיות. העכבר נמצא מתחת למיקרוסקופ הדיסקציה.מקמו את הדגימה כך שהראש פונה לעבר הצופה. אתרו את פתח הכניסה של צינור המרה המשותף לתריסון באמצעות תפס המוסטט, פתח התריסון של צינור המרה המשותף. יש למקם את ההמוסטט כך שבזמן לחיצה, הוא יעבור בדיוק לאורך הגבול שבין הלבלב למעי.כאן יודגמו שתי שיטות לקיבול (cannulation) של תעלת המרה: שיטת היד החופשית ושיטת הסיוע באמצעות פינצטה. בשימוש בשיטת היד החופשית, משכו את ההמוסטט המוצמד לתריסריסון הרחק מראש העכבר לכיוון הזנב, כך שתעלת המרה המשותפת תימתוח.קיים התמזגות בצינור המרה קרוב לכבד, שם נפגשות המרה המתנקזת מכיס המרה ואנזימים מהכבד. לפני הכניסה למעיים, משכו את צינור המרה כדי לחשוף את החלק הפנימי של מיקום ה-V. השתמשו במחט כיפופה בכי মাপ 27gauge המחוברת למזרק של 5 mL, כך שהמחט תחליק ישירות דרך ה-V ותבצע קניולציה של החלק התחתון של הצינור. החליקו את המחט מספר מילימטרים מעבר לקצה הbevel כדי למנוע זרימה חוזרת לכבד ולכיס המרה.לאחר שהקנולציה הצליחה, יש לבצע פרפוזיה ללבלב על ידי הזרקת שני מיליליטר של liase מהמזרק. יש לשים לב להתרחבות הלבלב מעל הקיבה כאינדיקציה לקנולציה אופטימלית. לחלופין, ניתן לבצע קנולציה לתעלת המרה.באמצעות שיטת מלקחי הציסטה. משכו את ההמוסטט C המהדק את התריסריון הרחק מראשה של העכבר לכיוון הזנב, כך שצינור המרה המשותף יהיה מקומט. לאחר מכן, בעזרת מחט כיפופה מדגם 27 המחוברת למזרק של 5 mL, נקבו את הפציה מתחת לצינור המרה המשותף קרוב לכבד.השתמשו במחט כדי לנקות את הפסציה מהתעלה כאשר המחט עדיין במקומה. הניחו את ההמוסטט וקחו פינצטה. השתמשו בזרוע אחת של הפינצטה הפתוחה כדי לתמוך בתעלת המרה במקום שבו המחט ניקתה את הפסציה, תוך משיכת התעלה והפינצטה קדימה.החליקו את המחט אל תוך הניצב תוך שימוש בפינצטה כמשענת. קנולציה מוצלחת תתבטא בהתרחבות אחידה של אזור הלבלב מעל הקיבה. לאחר פרפוזיית הלבלב, הסירו את ההמוסטט מהתריסריון.לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי להרים את התריסריון (duodenum) ובזוג פינצטות שני כדי להפריד את הלבלב מהמעיים. בשלב הבא, משכו את הלבלב כדי לשחררו מהחלק העליון של הקיבה ומהטחול. לבסוף, הרימו את הלבלב אל מחוץ לבטן וחתכו את שאריות חיבורי הפציה למעי, לקיבה ולטחול.הניחו את הלבלב במבחנה קונית של 50 מיליליטר והניחו אותה על קרח. דגרו את הלבלב בטמפרטורה של 37 °C לפי ההוראות בפרוטוקול הכתוב המצורף. לאחר הדגירה, הוסיפו למבחנות 20 מיליליטר של מצע ופרקו את הרקמה על ידי ניעור חזק של המבחנות 40 פעמים במשך 10 שניות.שלב זה קריטי עבור התאוששות אופטימלית של הויולט. סובב את התאים ב-800 rotations per minute. השהה את המשקעים ב-15 milliliters של מדיום ורכז את הדגימות.שפכו את תמיסת הסלרי (slurry) לאחר השספension דרך רשת חוטים של 0.419 מילימטר והעבירו אותה למסננת לתוך פפלת קונית נקייה של 50 מיליליטר. שטפו את הפפלה הראשונה עם 10 מיליליטר נוספים של מדיום המכיל 10% fetal bovine serum ושפכו אותם דרך רשת החוטים. רספו את התאים על ידי סנטריפוגציה, השספנו את המשקע בחמישה מיליליטר של HBOPaque בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, ערבבו בעזרת וורטקס בעדינות למשך מספר שניות, הוסיפו חמישה מיליליטר נוספים של HBOPaque סביב הדופן הפנימית של הפפלה כדי לשטוף את התאים מדופן הפפלה. העבירו באיטיות באמצעות פיפטה 10 מיליליטר של RPMI ללא סרום במורד דופן הפפלה, בקצב של מיליליטר אחד לכל 10 שניות.ממשק חד אמור להיות נראה לעין. לאחר מכן, סובבו את הדגימות בצנטריפוגה עם סלסלאות נדנדות (swinging bucket centrifuge) בטמפרטורה של 20 °C ובכוח של 900 ×g למשך 20 דקות, עם האצה איטית מאוד וללא בלימה. לאחר הצנטריפוגציה, יש להפריד את האיים (islets) מהתאים האקסוקריניים באמצעות פיפטה סרולוגית חד-פעמית של 10 mL. העבירו את האיים מממשק מדיום ה-histo Paque לשפופרת קונית נקייה של 50 mL.ניתן לאחד מספר מבחנות בשלב זה כדי להסיר שאריות של איעלטים, למלא את המבחנות התעלקותיות במדיום המכיל סרום, ולשקע את האיעלטים על ידי סבב של המבחנות בצנטריפוגה למשך שתי דקות במהירות של 800 סל"ד. לאחר מכן, השביו את האיעלטים במדיום טרי. חזרו על שלב זה לפחות פעמיים.שַסְעו את המשקע בחמישה מיליליטר של מצע. הניחו מסננת תאים מניילון של 0.1 מילימטרה בצורה הפוכה על גבי מבחנה קונית של 15 מיליליטר. העבירו בפיפט את תמיסת התאים המשוערת דרכה כדי לאסוף את ה-eyelets.לאחר מכן, שטפו את המבחנה בנפח 50 מיליליטר עם שישה מיליליטרים נוספים של מצע ועבירו אותם דרך המסננת. הניחו טיפה של 3 מיליליטר מצע בתוך צלחת פטרי בקוטר 10 סנטימטרים. הפכו את מסננת התאים וטבלו אותה בטיפת המצע כדי לאסוף את העיןולטים; השתמשו בפיפטה כדי להעביר חמישה עד שבעה מיליליטרים נוספים של מצע תרבית דרך המסננת אל תוך צלחת הפטרי.כדי לאסוף את שארית העיןולטים (eyelets) מהמסנן תחת עדשה פי 4, בחרו את העיןולטים בבודד באמצעות פפית P 200 והעבירו אותם לנבובת מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר. תמונות אלו מציגות עיןולטים שבודדו מעכברי C 57 black six בני 12 שבועות. ניתן להעריך את טהרות ואיכות העיןולטים באופן מיקרוסקופי עם השלמת הליך הבידוד.לדוגמה, שתי התמונות המוצגות כאן מראות שדה מייצג שבו קיימים פסולת וזיהום של תאים אקסוקריניים. בעת בחירת עיניות (eyelets) לניסוי, הימנעו מבחירת תאים אקסוקריניים מזוהמים או עיניות שנראות לא בריאות. עיניות עם מרכזים נמקרוטיים אינן בריאות, כפי שמוצג בדמות זו שצולמה 24 שעות לאחר הבידוד; מרכזים נמקרוטיים לא יהיו נראים מיד לאחר הבידוד.תאי עינית (eyelets) השואבים תאים הם בלתי נמנעים וניתנים לשימוש בהשתלת עיניות, כפי שניתן לראות בסרטון time lapse זה של 24 שעות של עיניות. מיד לאחר הבידוד, מתפתחים מרכזים נמקריים בתוך רבות מהעיניות. נראה כי מרכזים נמקריים אלו נדחפים החוצה מהעינית לקראת סוף ההקלטה בעת בחירת העיניות.קבצו אותם כך שבכל מבחנה יהיה פיזור שווה של איכות וגודל הלולאות. לדוגמה, כל קבוצה של 15 לולאות עשויה להכיל ארבע לולאות בגודל גדול, שש לולאות בגודל בינוני וחמש לולאות בגודל קטן. הניחו את המבחנה על קרח. ניתן להשתמש בלולאות מיד להשתלה או לעבד אותן.לפני השימוש, הכניסו טיפ סטרילי לטעינת ג'ל לתוך הפתח של מבחנה מיקרו-צנטריפוגית של 1.5 מיליליטר, כך שייווצר כיפוף עדין בצורת U בקצה הצר של הטיפ. שני פתחי הטיפ צריכים לפנות ישירות כלפי מעלה מחוץ למבחנה המיקרו-צנטריפוגית.הוציאו בעדינות מבחנה של eyelets מהקרח. ודאו שכל ה-eyelets שקעו לתחתית המבחנה. בעזרת פיפט P 200, אספו בעדינות את ה-eyelets בנפח מינימלי מתחתית המבחנה והעבירו אותם לטיפ העקומם שהוכן.לאחר שאי כריות הבטא שקעו, הסירו כמה שיותר מהמדיום מקצה הטיפ על ידי שאיבת המדיום דרך הפתח הגדול של טיפ טעינת הג'ל הנושא את כריות הבטא, באמצעות טיפ טעינת ג'ל חדש המחובר לפפיט P 200. חברו את הקצה שאינו משופע של הפרוטור לפתח הצר של טיפ טעינת הג'ל הנושא את כריות הבטא. לאחר מכן, חברו את הטיפ לפפיט P 200 ודחפו בעדינות את כריות הבטא אל תוך הפרוטור.בשלב הבא, חברו את הקצה שאינו משופע של צינור ה-PE 50 למחט של מזרק Hamilton בנפח 25 microliter. כאשר הבוכנה נסוגה, לחצו על בוכנת המזרק עד שהעיניות נמצאות במרחק של כ-0.5 centimeters מהפתח המשופע. הניחו את המזרק בצד כדי שהעיניות יוכלו להצטופף למסה אחת ליד הפתח המשופע של הצינור, בזמן שהכליה מוכנה לקבלת העיניות.הכינו את אזור הניתוח על ידי גילוח שיער וקרצוף העור עם Betadine לסירוגין עם 70% isopropyl alcohol שלוש פעמים. התחילו את הליך השתלת ה-eyelet על ידי ביצוע צביטה של הבוהן כדי לוודא הרדמה בעכבר המקבל. מקמו את מוט זכוכית ישירות מתחת לעכבר, מתחת לכליה ובזווית ניצבת לעמוד השדרה.לאחר מכן, אתרו את הכליה דרך העור והניחו סביב חיתוי כירורגי סטרילי. ברגע שמיקום הכליה אותרה, השתמשו במספרי McFerson banis כדי לבצע חתך של שני סנטימטרים דרך הדרמיס ישירות מעליה, בניצב לעמוד השדרה. חתך זה יחשוף את דופן הפריתוניאום בעזרת המספריים.בצעו חתך של סנטימטר אחד דרך הדופן הפריטוניאלית באותו כיוון של החתך בשכבת העור, תוך שימוש בגוף מוט הזכוכית כמשענת, והוציאו את הכליה דרך הפתח הפריטוניאלי על ידי לחיצה על המשטח הסמוך. הרטיבו את פני השטח של הכליה החשופה ב-PBS סטרילי קר מאוד (בטמפרטורת קרח) באמצעות מקלוני צמר גפן ספוגים. חזרו על שלב זה מדי כמה דקות לפי הצורך, כדי למנוע את התייבשות קפסולת הכליה.באמצעות מחט בכיול 27 gauge, בצעו חתך של 0.2 סנטימטר דרך קפסולת הכליה על פני השטח הקדמיים של הכליה. החלו מהצד הלטרלי השמאלי לכיוון הצד הלטרלי הימני, והחדירו צינור נימי מזכוכית שנמשך בלהבה. חקרו דרך החתך שבוצע קודם לכן והזיזו אותו לכיוון אחורי לאורך השטח הלטרלי הגבי של הכליה.כדי ליצור כיס בין קפסולת הכליה לפרנכימה של הכליה, העבירו את פתחי היציאה במזרק המילמטר של Hamilton בנפח 25 מיליליטר לקצה הפתוח של הפיה האלכסונית של הפחית הגמישה. לאחר מכן, הכניסו את הקצה האלכסוני כאשר הוא פונה כלפי מעלה אל תוך הכיס התת-קפסולרי. הקצה הארוך נמצא במגע עם פרנכימת הכליה.העבירו את השפופרת לקצה האחורי ביותר של הקפסולה. לאחר מכן, העבירו באיטיות את הלולאות משפופרת ה-PE 50 אל תוך השקיק התת-קפסולרי על ידי לחיצה על בוכנת המזרק. ככל שהלולאות ממלאות את השקיק, משכו לאט את השפופרת הגמישה החוצה כדי לפנות מקום נוסף.לאחר הוצאת המבחנה מהכיס, החלק את גשושית הזכוכית לאורך פני השטח החיצוניים של הכליה, מכיוון קדמי לאחורי, כדי לדחוס בעדינות את הלולאות לקצה הפרוקסימלי של הכיס. באמצעות פינצטה זוויתית, הרם את ריפוד הפריטונאום הסמוך לפתח שנוצר עבור הכליה. לאחר מכן, השתמש במקלון צמר ספוג ב-PBS כדי לדחוף בעדינות את הכליה חזרה אל חלל הפריטונאום.סגרו את העכבר על ידי החלת תפרים בדופן הפריטונאום וסגירת שכבת העור באמצעות סיכות (wound clips). החזירו את העכבר לכלובו ועקבו אחריו. לצורך ההחלמה, יש לספק לעכבר מים עם aceto meine למען מערכת העיכול.בודדו עיניות עכבר C. תוך שימוש בשיטות המתוארות בסרטון זה, הועבר מינון ריפוי לתוך עכברי C 57 black six אלוגניים. רמות גלוקוז בדם במצב לא צום נוטרו החל מהיום הראשון לאחר הניתוח.דחייה צפויה להופיע סביב היום ה-17 בעכברי מקבל ששוקלם 20 גרם שקיבלו 300 eyelets מתורם אלוגני כאן. ההחלמה נוטרה בעכברים שקיבלו 150 eyelets או 300 eyelets מתורמים סינגניים. לא נצפתה דחייה בהשתלות אלו כיוון שה-eyelets הגיעו מתורמים סינגניים.מינון האיליטים שניתן מודד את התפקוד הראשוני של האיליטים מיד לאחר השתלה. בעוד שעם 150 איליטים נצפתה התאוששות חלקית, השתלה של 300 איליטים הובילה להתאוששות מלאה. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה כיצד לבצע את השלבים הקריטיים הנדרשים לבידוד איליטים של עכבר ולהשתלתם במרווח התת-קפסולרי של הכליה.עם התמדה, תפתחו את היכולת לבצע קנולציה מהירה של תעלת המרה המשותפת, שמהווה את השלב המאתגר ביותר בפרוטוקול זה.

a-method-for-murine-islet-isolation-subcapsular-kidney

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

פרוטוקול שלנו פותחה כדי נקייה בקלות לספק איים או תאים תחת הקפסולה הכליה של עכברים. תאים מרוכזים לתוך כדורי בצינור הסופי משמש השתלת התאים תחת הקפסולה כליות. הקלות של טכניקה זו מפחיתה את הלחץ על התאים ואת העכבר.

השתלת איי הלבלב לקופסית הכליה בעכברים סוכרתיים של

השתלת כליה בעכברים היא הליך מאתגר מבחינה טכנית זה דורש טיפול זהיר שלאחר הניתוח והטיפול להצלחה.

Murine נוהל השתלת כליה

בסרטון זה, אנו מתארים הליך להחדיר תאי איון הלבלב לתוך וריד פורטל הכבד, ואחריו יישום של קצף ג'ל כדי למנוע בהצלחה דימום. דימום לאחר ניתוח הוא גורם שכיח לתמותה גבוהה במהלך השתלת איון.

מודל מורין להשתלת איילט: שיטה כירורגית להחדיר איי לבלב בווריד הפורטל ומניעת דימום לאחר הניתוח

גישה חדשה המשלבת השתלת תוך עיני ומיקרוסקופיה confocal מאפשרת הדמית אורכית, לא פולשנית בזמן אמת עם רזולוצית תא בודד בתוך רקמות...

השתלה ללשכה הקדמית של העין לאורך, לא פולשני<em&gt; בחי</em&gt; הדמיה ברזולוצית תא בודד בזמן אמת

מטרת כתב היד הזה היא לתאר את השלבים הנדרשים לביצוע השתלת כליה בעכבר, תוך שימת לב מיוחדת לפרטי האנסטומוזיס העורקי.

טכניקת השתלת כליה בעכברים

פרוטוקול זה מדגים בידוד איים Murine וזרע על פיגום decellularized. איים נתמך פיגומים הושתלו לתוך כרית שומן האפידידימלי של streptozotocin (STZ), המושרה עכברים סוכרתית. איים שרדו באתר ההשתלות והפכו את מצב ההיפרגליקמיה.

פיגום נתמך השתלת איים בשומן השומן האפידידימלי של עכברים סוכרתית

שיטה השתלת עם פגיעה של איים ב עכבר הוא הציג. איים מבודדים מעורבבים עם הידרוג, התערובת ימוקם לתיק עם פגיעה של עכבר סוכרתית. לאחר מכן, הסוכר מנוטר, מבוצע ניתוח חיסונית-פתולוגיה.

שיטת השתלת איון כדי Omentum העכבר

השתלת הלבלב איון היא דרך להשיג normoglycemia על סוכרת מסוג 1. מאמר זה מתמקד בטכניקה השתלת מהנתיב intraportal כדי לשמור על רמות גלוקוז נורמלי בעכברים סוכרתיים.

השתלת intraportal של לנגרהנס במודל עכבר

אנו מספקים שיטה פשוטה ויעילה להשתלה 2 '-deoxyguanosine שטופלו E 29.7 בלוטת התימוס לתוך כמוסת הכליה של עכבר ערום. שיטה זו צריכה להיות מחקר של תפקוד שני תאים אפיתל הרתי והתבגרות תאים T.

הכליות Subcapsular ההשתלה של 2 '-Deoxyguanosine-התייחסו מורין מורנה בתימוס בעכברים ערומים

בפרוטוקול זה, שיטה של מורטין איון בידוד והשתלת לתוך רקמת השומן הלבן התת עורית מתוארת. האיים המבודדים של מורנה ממורג מושתלים לתוך המטופל מורין באמצעות קרום מרתף הידרוג'ל. רמת הגלוקוז בדם של המטופלים מנוטרים, ו ניתוח היסטולוגיה של שתלי איון מבוצע.

השתלת מודל שומן לבן תת-עורית (ISWAT) מדגם ההשתלה של איויין מורנה

אנו מספקים פרוטוקול זעיר-פולשני להשתלה תוך-שרירית של איי תאי גזע לבלב שמקורם בתאי גזע אנושיים לעכברים חסרי חיסון, לצורך השתלה ב-in vivo וניתוח בהמשך הזרם.

השתלה תוך-שרירית של תאי גזע פלוריפוטנטיים במקור תאי גזע בלבלב בעכברים

למדו שיטה לבידוד איילטים מלבלב עכברים והשתלתם לתת-קפסולת הכליה. טכניקה זו מאפשרת חקר טיפולים פוטנציאליים בסוכרת מסוג 1 ובהערכת תפקוד השתל בחיות מודל.

שיטה בידוד איילט Murine והשתלות כליה Subcapsular

גלה סרטונים נוספים