Name: בלחץ אטמוספרי מולקולרית והדמיה של רקמות ביולוגיות באמצעות Biofilms LAESI המוניים ספקטרומטריית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: למד הדמיה מולקולרית של רקמות ביולוגיות וסרטניות באמצעות LAESI בספקטרומטריית מס. שיטה זו מאפשרת ניתוח ישיר ללא טיפול מקדים בתנאי לחץ אטמוספרי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים על התמיכה הכספית של עבודה זו על ידי המוסד האמריקני למדע תחת גרנט מס &#39;0719232, על ידי משרד האנרגיה של ארה&quot;ב (DEFG02-01ER15129), ועל ידי פרוטאה Biosciences, Inc (Morgantown, WV). המחברים רוצה גם להודות ג&#39;סיקה א Stolee על עזרתה במהלך במצלמת וידיאו את הפרוטוקול.

הפרוטוקול שלהלן מתארת ​​את השלבים העיקריים של יינון אבלציה electrospray לייזר (LAESI) ניסוי ומספק דוגמאות מייצגות עבור דימות (3D) בצירי תלת ממדי עבור בעלי חיים דגימות רקמות הצמח. פרטים ניסיוניים טכני נוסף ניתן לקבל במקום אחר. 1-6 1. רקמות הכנה הרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם חתך נדרש, השתמש cryomicrotome סעיף הרקמה לתוך 1-10 פרוסות עבות מיקרומטר ב -10 עד -20 ° C אלא אם מומלץ אחרת לסוג רקמה מסוימת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר חלקים על גבי משטח שטוח (למשל, ניקוי כימי קדם שקופיות זכוכית) ישירות ללא מכפילי כימיים. עבור רקמות מחולק, להפשיר-Mount בסעיפים ומאובטח בעל מדגם לשלב Peltier קירור מיד עם ההפשרה הרכבה כדי לשמור על הרקמה הקפואה בכל עת במהלך ניתוח. צעד זה נחוץ כדי למזער / למנוע הגירה מולקולרית בסעיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת הצורך, להשתמש מפזר החום מצויד מאוורר צריכת חשמל נמוכה כדי להקל על הסרת חום מהשלב-Peltier כדי לשמור על הרקמה הקפואה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבה לחה על פני תקופה ממושכת של זמן (1-2 שעות), לבדוק את התעבות של מים או קרח על פני השטח רקמות. עיבוי מים על הרקמה לרעה משפיע על הביצועים הדמיה בניסויים LAESI 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת הצורך, להשתמש במסיר לחות בחדר או במקום מקורר מדגם בתא סביבתי מלא גז אינרטי (גז למשל, חנקן יבש) כדי למנוע התעבות. 1 </li></ol> 2. אופטימיזציה של מקור יון LAESI מקור יון LAESI מורכב לייזר אמצע אינפרא אדום, סדרה של אלמנטים אופטיים עבור היגוי אור ומיקוד כמו גם מחזיקי מדגם נוסף, רכיבי קירור, בשלבי תרגום, מערכת המסירה ממס. איור 1 מדגים את הסדר אופייני של רכיבים אלה ביחס לכניסה של מקור הלחץ האטמוספרי, יון של ספקטרומטר מסה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפי שמודגם באיור 1, העמדה מ"מ מדגם 15-20 להלן פתח של קונוס ספקטרומטר מסה דגימה (ד OR-FP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Operate לייזר אמצע IR באורך גל 2.94 מיקרומטר ו 10 הרץ שיעור החזרה. להחליש את פלט לייזר אנרגיה ~ μJ / דופק 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשילוב של מראות זהב עדשה תוך התמקדות שקוף על אורך גל לייזר (למשל, Plano-קמור קפה 2 או ZnSe העדשה) לזוג הדופק לייזר אנרגיה לתוך המדגם על שכיחות נורמלי (ראה זווית שכיחות נכון לגבי השטח מדגם באיור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את אמצע אינפרא אדום ציר הקורה 5-8 מ"מ מול פתח של קונוס ספקטרומטר מסה הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את מיקום העדשה למקד את האנרגיה ואת הדופק של קרן הלייזר כדי להשיג את הסרת רקמת במקום מוקד. מידות נפח ablated לקבוע את פיקסל (או voxel הדמיה תלת ממדי) בגודל של היישום הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקום פולט nanospray בקו אחד עם ציר כניסה של ספקטרומטר מסה במרחק פתח אל פולט קצה ~ 10 מ"מ (ראה איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור electrospray, להכין פתרון מתנול 50% עם חומצה אצטית 0.1% או 0.1% אמוניום אצטט תוסף עבור מצב יון חיובי או שלילי, בהתאמה. בהתאם המדגם, ממסים אורגניים אחרים, כגון אצטוניטריל, isopropanol וכו ', ניתן להחליף מתנול בריכוזים המתאימים למשימה אנליטית. יציבות electrospray הוא קריטי עבור הדמיה מוצלחת. בהתאם לבחירת ממס, את קצב הזרימה ואת מתח הריסוס צריך להיות מותאם על מנת להשיג תרסיס יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תגובתי LAESI 6 יישומי הדמיה, הפתרון electrosprayed עשוי להכיל המגיבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש משאבת מזרק כדי לספק את הפתרון electrospray דרך פולט electrospray בקצב הזרימה של ~ 300 NL / min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם פתח ספקטרומטר מסה הוא שמר על מתח נמוך (&lt;500 V נמדד כנגד הקרקע), ליצור electrospray על ידי יישום מתח גבוה ישירות פולט electrospray (למשל, 3000 V) או באמצעות איגוד מתכת. אחרת, הקרקע ישירות את emitter electrospray או באמצעות איגוד מתכת להקים electrospray. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מקור electrospray ב סילון קונוס ריסוס במצב לדור יון היעילה ביותר על ידי LAESI. ההשפעה של משתנים הפועלים על מצבי ריסוס והשפעתם על ספקטרום המוני, ראה דיונים אחרים. 5,7,8 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להתאים את המרחקים היחסית של ההתקנה LAESI לבצע אופטימיזציה עבור תשואה יון LAESI תוך שמירה על קרן לייזר, את emitter ואת צירי פתח באותו המטוס. בבקשה למצוא הוראות מפורטות במקום אחר. 5 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מיקרוסקופ אופטי, לקבוע את ממדי רוחבית של המכתש אבלציה על המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך שלושה ממדי ניסויים LAESI הדמיה, לבצע אבלציה עם פולסים הפרט לקבוע את עומק voxel באמצעות, לדוגמה, את מצב Z-המחסנית מיקרוסקופיה אופטית. 3 </li></ol> 3. הדמיה מולקולרית ניתוח נתונים בניסוי הדמיה, דגימה הרקמה מועברת במישור המוקד של הלייזר בכיוונים X ו-Y עם גודל צעד גדול או שווה ל מימדי במקום אבלציה. ההחלטה מרחבית מוגבלת על ידי מיקוד של קרן לייזר האירוע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את שטח של עניין על פני השטח מדגם להשיג את (X, Y) הקואורדינטות של גבולות המקביל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחרו אלגוריתם gridding (למשל, רשת אדפטיבית, הדמיה האזור הנבחר, ברשת מלבנית, תבנית ספירלה, Z סריקה וכו ') שבה אל פני השטח מדגם סריקה עם נבחרת זמן להתעכב על כל פיקסל על השטח להיות צילמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש שלב שלוש ציר תרגום תוכנה המסוגלת rastering המדגם לפי לרשת מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את הזמן הכולל הנדרש עבור הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השבת את רכישת נתונים מגבלה של זמן ספקטרומטר מסה. אם הדבר אינו אפשרי, להגדיר את רכישת נתונים בזמן גבול ערך מחושב זמן הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מקור אמצע לייזר אינפרא אדום בשיעור החזרה נכונה כדי לייצר מספיק יחס אות לרעש בספקטרום המונית תוך זמן להתעכב ליד כל פיקסל לבצע ניסוי LAESI הדמיה לרוחב. עבור הדמיה מולקולרית 3D, השתמש לרכישת ספקטרום שיעור גבוה יותר מאשר שיעור החזרה למקור הלייזר בהצלחה המוני לנתח את היונים שנוצר בתוך הדופק לייזר יחיד. חכו האות להתחיל ליזום את רצף אבלציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מקור electrospray. ודא כי קיים פתרון מספיק בפעם מלא נדרש הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל START רכישת ספקטרום המונית, אבלציה אמצע IR לייזר, סריקה משטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר לרוץ הדמיה סיימה, להפסיק את סריקת השטח, lasing אמצע IR, ורכישת נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השבת את מקור הלייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את מתח גבוה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את משאבת מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את ספקטרומטר מסה למצב המתנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את Peltier קירור האלקטרוניקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור זרימת גז אינרטי אם נעשה שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנה כדי לתאם את הקואורדינטות המוחלט של פיקסלים לרוחב או הדמיה voxels בניתוח 3D עם ספקטרום המקביל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש את עוצמת האות יון ערך m / z שנבחר נגד מתאמת המוחלט של ניתוח כדי להשיג תמונות מולקולרית לרוחב ו 3D. </li></ol> 4. נציג תוצאות איור 2 נותן תוצאות נציג כמה סוגי רקמות הגדולות שיטות הדמיה. לוח מתאר מקרה של מקטע רקמה חיה כי הוקפאה במהלך הניסוי על מנת למנוע התייבשות. 1 בנוסף, המדגם נמצא בסביבה יבשה גז חנקן כדי למנוע אדי מים מן הסביבה עיבוי על פני השטח מדגם. סעיף 100 מיקרומטר בעובי העטרה במוח חולדה (Rattus norvegicus) היה הדמיה רוחבית עם LAESI. האזורים האנטומיים של המוח (ראה תמונה אופטי בלוח) מראים קורלציה טובה עם התמונה מולקולרית השיג עבור ה-PC plasmalogens (O-33: 3) ו / או PE (O-36: 3) עם m / z 728.559. לוח ב 'מראה את 3D הדמיה LAESI מפעל זברה (Aphelandra squarrosa) רקמת העלה. בגלל העלים בעלי מנגנון הגנה טבעי מפני התייבשות, המדגם יכול להיות נחקר בסביבה הסביבה. 3 התמונות שהתקבלו מולקולרית 3D חשף מגוון של דפוסי התפוצה של מטבוליטים ראשוניים ומשניים. בין היתר, acacetin עם m / z 285.076 זוהה על ספירת יון גבוה יותר במגזרים צהוב של שכבות השני והשלישי מלמעלה עם חלוקה הומוגנית של האחרים. התפלגות זו הסכים עם דפוס של ססגון לראות תמונה אופטי. <img src="/files/ftp_upload/2097/2097fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. סכמטי של מערכת LAESI (ES, טיפ electrospray פולט, או, פתח חרוט ספקטרומטר מסה הדגימה, פלורידה, תוך התמקדות העדשה; FP, נקודת מוקד, P, בשלב Peltier הקירור; HS, מפזר החום). חלק מן החומר חלקיקי גורשו במהלך אבלציה אמצע IR (נקודות אדומות), מתמזגת עם electrospray להניב טיפות טעונה seeded עם מולקולות ויונים של המדגם (נקודות ירוקות). יוני שוחרר מבית טיפות אלה נותחו נרשמו על ידי ספקטרומטר מסה. <img src="/files/ftp_upload/2097/2097fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. תוצאות עבור נציג Imagi לרוחב ו 3D. ng עם LAESI ספקטרומטריית מסה (A) הפאנל העליון מתאר את התמונה האופטי במוח חולדה (Rattus norvegicus) סעיף העטרה ואת התמונה מולקולרית השיג עבור ה-PC plasmalogens (O-33: 3) ו / או PE (O-36 : 3) עם m / z 728.559. סרגל סולם לבן מתאים מ"מ 1. עיבוד באישור (Reference 1). כל הזכויות שמורות 2010 האגודה האמריקנית לכימיה. (ב) פאנל התחתונה מציגה הדמיה 3D של עלה מתוך מגוון זברה צמח (Aphelandra squarrosa). Acacetin עם m / z 285.076 זוהה על ספירת יון גבוה יותר במגזרים צהוב של שכבות השני והשלישי מלמעלה עם חלוקה הומוגנית של האחרים. התפרסם באישור (Reference 3). כל הזכויות שמורות 2009 האגודה האמריקנית לכימיה.

<ol><li>Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Imaging+of+Small+Metabolites+and+Lipids+in+Rat+Brain+Tissues+at+Atmospheric-Pressure+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Imaging of Small Metabolites and Lipids in Rat Brain Tissues at Atmospheric-Pressure by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 82, 982-988 (2010).</li>
<li>Nemes, P., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation+electrospray+ionization+for+atmospheric-pressure%2C+in+vivo%2C+and+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure, in vivo, and imaging mass spectrometry.</a> Anal Chem. 79, 8098-8106 (2007).</li>
<li>Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+metabolites+in+tissues+under+ambient+conditions+by+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of metabolites in tissues under ambient conditions by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 81, 6668-6675 (2009).</li>
<li>Nemes, P., Barton, A. A., Li, Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient+molecular+imaging+and+depth+profiling+of+live+tissue+by+infrared+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ambient molecular imaging and depth profiling of live tissue by infrared laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 80, 4575-4582 (2008).</li>
<li>Nemes, P., Vertes, A. Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure molecular imaging mass spectrometry. Mass Spectrometry Imaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNemes%2C+P+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Nemes, S. S., Rubakhin, J. V. , Springer. Volume 656 (2010).</li>
<li>Shrestha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+analysis+of+lipids+and+small+metabolites+in+mouse+brain+tissue+by+AP+IR-MALDI+and+reactive+LAESI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Direct analysis of lipids and small metabolites in mouse brain tissue by AP IR-MALDI and reactive LAESI mass spectrometry.</a> Analyst. 135, 751-758 (2010).</li>
<li>Nemes, P., Marginean, I., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spraying+mode+effect+on+droplet+formation+and+ion+chemistry+in+electrosprays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Spraying mode effect on droplet formation and ion chemistry in electrosprays.</a> Anal Chem. 79, 3105-3116 (2007).</li>
<li>Nemes, P., Goyal, S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+and+noncovalent+complexation+changes+in+proteins+during+electrospray+ionization%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Conformational and noncovalent complexation changes in proteins during electrospray ionization.</a> Anal Chem. 80, 387-395 (2008).</li>
<li>Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+by+Mid-IR+laser+ablation+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+A-Mater+Sci+Process%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging by Mid-IR laser ablation mass spectrometry.</a> Appl Phys A-Mater Sci Process. 93, 885-891 (2008).</li>
<li>Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+metabolic+profiling+of+single+cells+by+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">In situ metabolic profiling of single cells by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 81, 8265-8271 (2009).</li>
<li>Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ambient mass spectrometry.</a> Science. 311, 1566-1570 (2006).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

סוגי רקמות שונות התערוכה תוכן משתנה מים חוזק מתיחה, אשר, בתורם, יכולים להשפיע על מאפייני אבלציה של הדגימות. 9 כדי לצמצם את ההשפעות הללו, הוא הרצוי כי הפרוטוקולים השטף לייזר, טיפול מדגם, וניתוח להיות מתוקן כאשר משתנה בין רקמה סוגים עיקריים. עבור תא יחיד או חקירות רזולוציה גבוהה יותר, האור אמצע אינפרא אדום ניתן בשילוב לתוך סיב אופטי מחודד במקום העדשה מתמקדת. 10 מאת מיקום קצה סיב בתוך בסמיכות של התאים הנבחרים ברקמות, ניתוח LAESI יכול להתבצע על רמת מתחיל מתא בודד. כמקור-תווית חינם יון עבור ספקטרומטריית יינון הסביבה המונית, 11 LAESI הראו פוטנציאל גדול חקירה של תהליכים ביוכימיים ברקמות. עם היתרונות של ניתוח ישיר הוסיף, ההדמיה לרוחב ו 3D, LAESI הוא כלי bioanalytical המתעוררים פרופיל, כמו גם יישומי הדמיה.

<table><tbody><tr><td>ספקטרומטר מסות</td><td>Waters</td><td>Q-TOF Premier</td><td></td></tr><tr><td>לייזר Mid-IR</td><td>Opotek Inc. (Carlsbad, CA)</td><td>Vibrant IR</td><td></td></tr></tbody></table>

בלחץ אטמוספרי מולקולרית והדמיה של רקמות ביולוגיות באמצעות biofilms laesi המוניים ספקטרומטריית

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

שיטות יינון אמביינט ב ספקטרומטריית מסה לאפשר חקירות אנליטית להתבצע ישירות על רקמות או biofilm תחת הילידים כמו תנאי הניסוי. Electrospray לייזר אבלציה יינון (LAESI) הוא אחד התפתחות כזו היא בעיקר מתאים היטב החקירה של מים המכילים דגימות. LAESI מנצל קרן אמצע לייזר אינפרא אדום (אורך גל 2.94 מיקרומטר) כדי להלהיב את מולקולות המים של המדגם. כאשר סף השטף אבלציה חריגה, החומר המדגם הוא גורש בצורה של חומר חלקיקי וקלעים אלה לנסוע עשרות מילימטרים מעל פני השטח מדגם. ב LAESI, פלומה זו אבלציה הוא יורט על ידי טיפות טעון ללכוד שבריר של החומר מדגם נפלט להמיר מרכיבים כימיים שלה לגז שלב יונים. ספקטרומטר מסה מצויד בממשק בלחץ אטמוספרי מקור יון מועסק לנתח ולתעד את ההרכב של יוני שוחרר שמקורם באזור נחקר (פיקסל) של המדגם. חקירה שיטתית על מערך של פיקסלים פותחת דרך הדמיה מולקולרית במצב ניתוח microprobe. היבט ייחודי של הדמיה המוני LAESI spectrometric הוא פרופיל עומק, בשילוב עם הדמיה לרוחב, מאפשר תלת ממדי (3D) הדמיה מולקולרית. עם החלטות לרוחב ועומק הנוכחי של ~ ~ 100 מיקרומטר ו 40 מיקרומטר, בהתאמה, הדמיה LAESI מסה spectrometric מסייעת לחקור את המבנה המולקולרי של רקמות ביולוגיות. במסמך זה, נסקור את האלמנטים העיקריים של מערכת LAESI ולספק הנחיות ניסוי הדמיה מוצלחת.

Electrospray לייזר אבלציה יינון (LAESI) הוא מקור של לחץ אטמוספרי יון עבור ספקטרומטריית מסה. במצב הדמיה, אמצע אינפרא אדום בדיקות הלייזר הפצות של מולקולות על פני קטע רקמה או biofilm. טכניקה זו מציגה גישה חדשה ללימודי bioanalytical מגוונים שבוצעו תחת תנאים ניסויים הילידים.

בלחץ אטמוספרי מולקולרית והדמיה של רקמות ביולוגיות באמצעות Biofilms LAESI המוניים ספקטרומטריית

שיטות יינון סביבתי (Ambient ionization) בספקטרומטריית מסות מאפשרות ביצוע של בדיקות אנליטיות ישירות על רקמה או על ביופילם בתנאים דמויי טבע...

על מנת לבצע ניסוי של דימוי מסת-ספקטרומטריה (mass spectrometry imaging) בשיטת lazy על רקמה ביולוגית או בביופילם, מכינים את מערך ה-lazy לפעולה יציבה. השלב הבא הוא קיבוע הדגימה על במה לדגימות וזיהוי התנאים הניסויים הנדרשים עבור הדגימה הנבדקת. לאחר מכן, מתחילים את ניסוי הדימוי המולקולרי הלטרלי בשיטת lazy, והנתונים המתקבלים משמשים לקבלת התפלגויות מולקולריות מרחביות.התוצאות מראות את הארכיטקטורה המולקולרית של רקמות ביולוגיות וביופילמים. אני ד"ר פיטר נמס (Peter Nemes) ממעבדת המחקר Vertus באוניברסיטת ג'ורג' וושינגטון. היתרון המרכזי של טכניקת ה-LAESI על פני שיטות אחרות, כולל שיטות דימוי קונפוקאליות, אופטיות ומספקטרומטריית מסות כגון MALDI ו-SIMS, הוא שניתן לבצע את ניתוח הדגימה ישירות על הרקמה בתנאי לחץ אטמוספרי, ללא צורך בטיפול מקדים של הדגימה.העבירו את נתחי הרקמה הרלוונטיים ישירות למשטח שטוח, כגון זכוכית המיועדת למקריים (glass slide) שעברה ניקוי כימי מוקדם וללא משני כימיים. קבעו את הדגימה לבמה קירור מסוג Pelt מיד לאחר ההעברה במידת הצורך; השתמשו במפזר חום המצויד במאוורר בעל הספק נמוך כדי להקל על פינוי החום מבמת ה-Pelt. לאחר מכן, אם העבודה מתבצעת בסביבה לחה למשך תקופה ממושכת של כשעה עד שעתיים, בדקו אם נוצרה התעבות של מים או קרח על פני השטח של הרקמה.עיבוי של מים על הרקמה פוגע בביצועי הדימות בניסויי לייזר. במידת הצורך, השתמש במייבש אוויר בחדר או הנח את הדגימה המדוברת בתא סביבתי מלא בגז אינרטי, כגון גז חנקן יבש, כדי למנוע עיבוי. לאחר אופטימיזציה של התנאים לשמירה על הדגימה, פעל לאופטימיזציה של מקור היונים המשמש לאבלאציה בלייזר, יינון בריסוס אלקטרוסטטי, או מקור יוני לייזר המורכב מלייזר อินפרא-אדום בינוני (mid-infrared), המקוצר כ-mid ir, ומסדרת אלמנטים אופטיים להכווןה ומיקוד של האור.המערך כולל גם מחזיקי דגימות נוספים, רכיבי קירור, במי translation stages ומערכת electro spray. חלק מהחומר החלקיקי הנפלט במהלך ablation ב-mid IR מתאחה עם ה-electro spray כדי להניב טיפות טעונות המכילות מולקולות ויונים של הדגימה. היונים המשוחררים מטיפות אלו מנותחים ונרשמים על ידי הספקטרומטר למסות, שפת הפתח שלו מוצגת כאן.הגדרת המערכת (lazy setup) מבוצעת לפני תחילת הניסוי. נדרשות התאמות מדויקות של הפרמטרים הניסויים כדי להתאים את הדגימה הנבחרת ולבצע אופטימיזציה של מקור היונים. התחל במיקום הדגימה בגובה של 15 עד 20 millimeters מתחת לפתח של קונוי הדגימה של ספקטרומטר המסות.הפעילו את לייזר ה-mid IR באורך גל של 2.94 micrometer ובקצב חזרות של 10 hertz. הנמיכו את מוצא הלייזר לאנרגיה של כ-100 micro joules לפולס. השתמשו בשילוב של מראות זהב ועדשת מיקוד השקופה באורך הגל של הלייזר כדי להזריק את אנרגיית אור הלייזר אל הדגימה.בזווית פגיעה ניצבת, מקמו את ציר B של האינפרא-אדום הרחוק, חמישה עד שמונה מילימטרים לפני פתח קונו הדגימה של ספקטרומטר המסות. כווננו את מיקום עדשת המיקוד ואת אנרגיית פולס הלייזר כדי להשיג הסרה של רקמה בנקודת המוקד לעומק הרצוי. ממדי הנפח שהוסר.קבע את גודל הפיקסל עבור יישום הדימות. מקם פולט ננו-ספריי (nanos spray) בקו אחד עם ציר הכניסה של ספקטרומטר המסות, ובמרחק של כ-10 מילימטרים מפתח הפיה. עבור התזת האלקטרו-ספריי (electro spray), הכן תמיסת 50% methanol עם 0.1% acetic acid עבור מצב יונים חיוביים או 0.1% ammonium acetate.עבור מצב יונים שליליים. יציבות התרס (electro spray) היא קריטית להצלחת הדימות. בהתאם לבחירת הממס, יש להתאים את קצב הזרימה ואת מתח התרס כדי להשיג תרס יציב.עבור יישומים תגובתיים, איטיים (lazy) ודימוי, תמיסת הריסוס החשמלי עשויה להכיל מגיבים. השתמש במשאבת מזרק כדי להזרים את תמיסת הריסוס החשמלי דרך פולט הריסוס החשמלי בקצב זרימה של כ-300 nanoliters per minute. אם פתח הספקטרומטר למסות נשמר במתח נמוך, למשל, מתחת לכ-500 volts שנמדדו ביחס להארקה, צור ריסוס חשמלי על ידי הפעלת מתח גבוה, למשל, 3000 volts ישירות לפולט הריסוס החשמלי או דרך מחבר מתכתי.הפעילו את מקור הריסוס החשמלי (electro spray) במצב ריסוס סילון קוני (cone jet spraying) כדי להשיג את ייצור היונים היעיל ביותר; כווננו בזהירות את המרחקים היחסיים של מערך הלייזר כדי למקסם את תנובת היונים, תוך שמירה על ציר קרן הלייזר, הפולט והפתח באותו מישור באמצעות מיקרוסקופ אופטי. קבעו את הממדים הרוחביים של מכתש האבלאציה על הדגימה לצורך ניסויי דימוי לייזר תלת-ממדיים. בצעו אבלאציה באמצעות פולסים בודדים וקבעו את עומקו של ווקסל (voxel), למשל באמצעות מצב Z stack במיקרוסקופיה אופטית.כעת, לאחר שמיזוג הרקמה ומקור היינוז מסונכרנים בצורה אופטימלית, ניתן להמשיך לדימוי מולקולרי במסגרת ניסוי הדימוי. דגימת הרקמה מונעת במישור המוקד של הלייזר בכיווני x ו-y בצעדי תזוזה הגדולים או השווים לממדי נקודת האבלאציה. הרזולוציה המרחבית מוגבלת על ידי מיקוד קרן הלייזר הפוגעת.בחר אזור עניין על פני השטח של הדגימה והשג את קואורדינטות ה-XY של הגבולות המתאימים. בחר אלגוריתם רשת (gridding algorithm) עבור סריקת רסטר (raster) של פני השטח של הדגימה, עם זמן שהייה (dwell time) נבחר בכל פיקסל מעל האזור המיועד לדימוי. השתמש בבמה לתרגום תלת-צירים (three XS translation stage) ובתוכנה המסוגלת להזיז את הדגימה בהתאם לרשת שנקבעה מראש.לאחר מכן, חשבו את סך הזמן הדרוש לדימוי. הפעילו את מקור לייזר האינפרא-אדום הרחוק (mid-infrared) בקצב חזרות המתאים להפקת יחס אות לרעש מספיק עבור היונים שנבחרו בספקטרום המסה בתוך זמן השהייה (dwell time) בכל פיקסל. כדי לבצע ניסוי דימוי צדי איטי (lazy lateral imaging), הפעילו את מקור האלקטרו-ספריי (electro spray).וודאו כי יש מספיק תמיסה לכל פרק הזמן הנדרש להדמיה. כעת, התחילו בו-זמנית ברכישת ספקטרום מסות, באבליציה בלייזר בטווח ה-mid IR ובסריקת הפני השטח, ואספו את הנתונים. עם סיום הרצת ההדמיה, הפסיקו את סריקת הפני השטח, את הלייזר בטווח ה-mid IR ואת רכישת הנתונים.יש לבטל את מקור הלייזר, לכבות את המתח הגבוה, לכבות את משאבת המזרק ולהעביר את ספקטרומטר המסה למצב המתנה (stand by). כמו כן, יש לכבות את האלקטרוניקה של קירור הלוחית ולסגור את זרימת הגז האינרטי, במידה והשתמשו בהם.לבסוף, שרטטו את אות עוצמת היונים עבור ערך MZ נבחר אל מול הקואורדינטות המוחלטות של הניתוח כדי לקבל תמויות מולקולריות לטראליות או תלת-ממדיות. אלו הן תמויות מייצגות מדימוי lazy לטראלי של חיתוך כלילי בעובי 100 מיקרומטר של מוח חולדה. החיתוך הוקפא במהלך הניסוי ונשמר בסביבה של גז חנקן יבש.האזורים האנטומיים של המוח מראים מתאם טוב עם הדמות המולקולרית שהתקבלה עבור שני plasmodium עם MZ 2 78 0.59. זהו ניסוי בדימות מולקולרי בתלת-ממד באמצעות רקמת עלה של צמח זברה שנבדקה בסביבה טבעית בקרב מטבוליטים ראשוניים ושניוניים אחרים. ASCE עם MZ 2 85 0.076 זוהה בספירות יונים גבוהות יותר במגזרים הצהובים של השכבה השנייה והשלישית מהחלק העליון עם התפלגות הומוגנית.באחרים, התפלגות זו תאמה את דפוס השונות שנראה בתמונה האופטית. H לאחר פיתוחו. הטכניקה העצלה סללה את הדרך עבור חוקרים בתחומי הכימיה האנליטית וה-B ללמוד על ההרכב המולקולרי והארגון המרחבי של רקמות וביופילמים בעלי תכולת מים משמעותית.אל תשכחו שעבודה עם לייזר באינפרא-אדום בינוני ומקור התזה חשמלי עלולה להיות מסוכנת ביותר. הקפידו תמיד לפעול לפי פרוטוקולי בטיחות לייזר סטנדרטיים והשתמשו בבידוד מתאים לכל החיבורים החשמליים במהלך הליך זה.

atmospheric-pressure-molecular-imaging-biological-tissues-biofilms

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ניתוח תא יחיד מבוצע על ידי ספקטרומטריית מסה בתאי צמחים ובעלי חיים בלחץ אטמוספרי באמצעות סיב אופטי מחודד המדגם תאים יינון אבלציה electrospray לייזר (LAESI) ספקטרומטריית מסה.

ניתוח ישיר של תאים בודדים באמצעות ספקטרומטריית מסה בלחץ אטמוספרי

משני יינון electrospray ספקטרומטריית מסה (SESI-MS) מאפשרת זיהוי של תרכובות אורגניות נדיפות (VOCs) ללא צורך המקדים כל המדגם. פרוטוקול זה מספק הוראות לאפיון (בתוך דקות) המהירה של VOCs חיידקי באמצעות SESI-MS.

נדיפים חיידקית משנית אפיון באמצעות Ionization electrospray ספקטרומטריית מסה (SESI-MS)

Desorption electrospray יינון ספקטרומטריית מסה (דסי-MS) היא שיטה שבאמצעותו דגימות סביבה, כולל רקמות ביולוגיות, יכולות להיות צילמו עם הכנת מדגם מינימאלית. על ידי rastering המדגם מתחת לחללית היינון, טכניקה מבוססת ספריי זה מספקת רזולוציה מרחבית מספיק כדי להבחין במאפיינים מולקולריים של עניין בתוך סעיפי רקמות.

הדמיה של רקמות ביולוגיות על ידי Desorption electrospray יינון המוני ספקטרומטריית

ספקטרוסקופיה התמוטטות מושרה לייזר מבוצעת על איבר דק ורקמת גידול זוהתה בהצלחה אלמנטים טבעיים וגדוליניום המוזרק באופן מלאכותי (ה '), שהונפקו מחלקיקים המבוססים על ה'. תמונות של יסודות כימיים הגיעו לרזולוציה של 100 מיקרומטר ורגישות תת מ"מ כמותית. התאימות של ההתקנה עם מיקרוסקופיה אופטית סטנדרטית, מדגישה את הפוטנציאל שלה כדי לספק מספר רב של תמונות מאותה רקמה ביולוגית.

ספקטרוסקופיה התפלגות מושרה לייזר: גישה חדשה למיפוי של Nanoparticle וכימות ברקמות איברים

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לביצוע הדמיית ספקטרומטריית מסה סביבתית (MSI) של רקמות וניתוח MS של תא יחיד (SCMS) באתרו באמצעות בדיקה יחידה, שהיא מכשיר רב תכליתי ממוזער לניתוח טרשת נפוצה.

יישומים של-הבדיקה הבודדה: הדמיה ספקטרומטריית מסה וניתוח תא יחיד בתנאי הסביבה

מקור הדמיית ספקטרומטריית מסה (MSI) המופעל בלחץ אטמוספרי פותח על ידי צימוד ספיגת לייזר אינפרא אדום בינוני ופוסט-יינון אלקטרוספריי. מטריצת קרח אקסוגנית שימשה כמטריצה סופגת אנרגיה כדי להקל על ספיגה תהודה של חומר הקשור לרקמות. כתב יד זה מספק פרוטוקול שלב אחר שלב לביצוע IR-MALDESI MSI של עכבר יילוד בכל הגוף.

הדמיה של כל הגוף ספקטרומטריית מסה על ידי אינפרא אדום מטריקס בסיוע לייזר Desorption electrospray יינון (IR-MALDESI)

פרוטוקול עבור אפיון ההרכב הכימי של והבל הפה בזמן אמת באמצעות nanoelectrospray משני יינון מצמידים ברזולוציה גבוהה ספקטרומטר מסה הוכח.

אנליזת נשימה בזמן אמת באמצעות Nanoelectrospray משני יינון מצמידים ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה

פרוטוקול זה מתאר שיטה לשחזור אמין עבור הכנת פורמלין קבוע רקמות המיועדים ספקטרומטר מסה דימות מבוסס-סובלימציה.

הכנה אופטימלית של פורמלין קבוע דוגמאות עבור פפטיד מבוסס מטריקס בסיוע לייזר Desorption/יינון ספקטרומטר מסה הדמיה זרימות עבודה

שיטה של הכנת הדוגמא פותחה כדי להתאים coculture תאים ורקמות לזהות מולקולה קטנה exchange באמצעות ספקטרומטר מסה הדמיה.

לכידת תקשורת מולקולה קטנה בין רקמות ותאים באמצעות הדמיה ספקטרומטר מסה

מטרת פרוטוקול זה היא לספק הדרכה מפורטת על הכנת המדגם בעת תכנון ניסויים באמצעות MALDI MSI כדי למקסם זיהוי מטבולי ומולקולרי בדגימות ביולוגיות.

הכנה לדוגמה ליצירת פרופיל מטבולי באמצעות הדמיית ספקטרומטריית מסה MALDI

למד הדמיה מולקולרית של רקמות ביולוגיות וסרטניות באמצעות LAESI בספקטרומטריית מס. שיטה זו מאפשרת ניתוח ישיר ללא טיפול מקדים בתנאי לחץ אטמוספרי.

בלחץ אטמוספרי מולקולרית והדמיה של רקמות ביולוגיות באמצעות Biofilms LAESI המוניים ספקטרומטריית

גלה סרטונים נוספים