ברחם electroporation ואחריו תרבות עצבית ראשונית ללימוד פונקציה ג'ין בתת קבוצה של נוירונים קליפתיים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון השפעות התפתחותיות של נוקדאון או ביטוי יתר של גנים בתת-קבוצות ספציפיות של תאי אב עצביים בניאו-קורטקס. זה מושג על ידי אלקטרופורציה in vivo של DNA לעוברי חולדות כדי להעביר תאי אב ניאו-קורטיקליים. כשלב שני, האזור האלקטרופוטרי מנותח על מנת להעשיר לתאים שעברו טרנספטציה.

לאחר מכן, תאים אלה מנותקים ומצופים בשקופיות תא ומתורבתים. על מנת לבחון את ההשפעות של שינוי גנטי פנימי ויישום של גורמים אקסוגניים, התקבלו תוצאות המראות השפעות על צמיחת נויריטים והסתעפויות על סמך מדידות כמותיות באמצעות תוכנת avision. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני אחרות, כגון טרנספקציה מבוססת שומנים של תרבויות עצביות ראשוניות, הוא שאנו יכולים למקד לתת-קבוצות ספציפיות של תאי אב עצביים.

לדוגמה, רק נוירונים גלוטמטרגיים יועברו בשיטה זו. בנוסף, אנו יכולים להתפלל בשלבים עובריים מוקדמים יותר ולהתמקד בתאי עצב בשכבה עמוקה יותר שנולדו מוקדם, או שאנו יכולים לבצע אלקטרוליט בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות ולהתמקד בתאי עצב שנולדו מאוחר יותר ומיועדים לשכבות שטחיות יותר של קליפת המוח. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההתפתחות הנוירולוגית.

לדוגמה, כיצד גורמים פנימיים וחיצוניים מתקשרים כדי להשפיע על צמיחה עצבית והסתעפות? למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי צמיחת תהליכים עצביים, ניתן ליישם אותה גם על תהליכים נוירו-התפתחותיים אחרים כגון סינפטוגנזה, התפשטות תאים וקביעת סולפט. הכן מחט הזרקה כמתואר בטקסט הנלווה.

הימנעות מבועות ממלאות מחדש את המחט ב-DNA המבטא GFP והגן המעניין כוללים ירוק מהיר כדי לדמיין את הזריקות, טען את החלל שנותר במחט בשמן תירס. חבר שפריצר פיקו למחט הטעונה כדי לשלוט בזריקות. חשוף את קרני הרחם של חולדה בהריון מורדמת כפי שתואר קודם לכן.

ובטקסט המלווה את הסרטון הזה, הזרקת עוברי E 15 מוצגת כאן. זהה את אתר ההזרקה על ידי הארת העוברים במנורת צוואר אווז. תפעל בעדינות עובר אחד כדי למצוא היכן נמצא הראש ולאתר את תפר קו האמצע.

השתמש בזה כנקודת ציון למציאת החדר הצדדי. הזרקת DNA דרך דופן הרחם ולחדר הרוחבי. הזרקו פולסים מרובים לחדר עד שהוא יתמלא ב-DNA.

הווקטור שנקבע על ידי מיקום האלקטרודות הוא קריטי לקביעת איזה אזור של הניאו-קורטקס הוא אלקטרופורציה. כאן האלקטרודה החיובית ממוקמת ליד המיקומים המדיאליים הגביים על פני המוח הגדול כדי למקד לאזור זה של המוח הקדמי. מיקום חלופי של האלקטרודות יתמקד באזורים אחרים בקליפת המוח, כולל הזרם הרוחבי של קליפת המוח.

להזריק ולבצע אלקטרופציה של כל עובר. בתורו, החזירו את קרני הרחם לחלל הגוף וסגרו את החתך. עקוב אחר בעלי החיים בזמן שהם מתאוששים מההרדמה.

כאן נקצרים בעלי חיים לתרבית 24 שעות לאחר האלקטרופורציה, כך שניתן לזהות GFP. הסר עוברים מהרחם של החולדה שהורדמה והניח אותם בצלחת פטרי מלאה ב-HBSS קר כקרח עם קטיון דו-ערכי במכסה המנוע של זרימת למינה. ותחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי מנתח, השתמש במלקחיים של דומונט מספר חמש.

לנתח את קליפת המוח. השתמש במלקחיים בגודל דומונט מספר שלוש כדי להסיר את קרומי המוח, הפעל את הקרינה באמצעות מספריים val. גזרו את האזורים החיוביים של ה- GFP ברקמה.

העבירו את החלקים הללו לצינור חרוטי של 50 מיליליטר מלא ב-HBSS קר כקרח ללא קטיון דו-ערכי. אסוף את כל החלקים החיוביים של GFP בצינור. הסר את ה-HBSS מהצינור והחלף אותו במיליליטר אחד של 0.25% תמיסת EDTA טריפסין מעורבבת בעדינות על ידי אינקובטור היפוך 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

הסר את תמיסת הטריפסין. החלף אותו בין מיליליטר לחמישה מיליליטר של מדיום ציפוי בהתאם לכמות הרקמה החיובית של GFP. באמצעות פיפטה פסים של שני מיליליטר אכלה חמש עד שבע פעמים כדי לנתק את התאים.

ספור את התאים באמצעות ציטומטר המו מדולל עם מדיום ציפוי לריכוז של שניים עד 3.5 פעמים 10 לחמשת התאים לכל 1.5 מיליליטר של צלחת בינונית 1.5 מיליליטר בכל תא של תא CC שני מצופים. שקופית. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות כדי לאפשר לתאים להיצמד לשקופיות. בשאיבת מדיום הציפוי היו 1.5 מיליליטר של מדיום עצבי לתרבית תא.

התאים ב-37 מעלות צלזיוס לשלב הרצוי לפני שממשיכים בצביעה חיסונית. למדידות של תהליכים עצביים. תרבות תזמון הצמיחה משתנה בין 24 שעות לשבעה ימים.

במכסה אדים, שאפו את המדיום מכל תא תרבית. תקן את התאים עם 4% פורמלדהיד למשך 15 דקות. שטפו פעמיים במהירות עם PBS פעם אחת לפני חסימה ואימונוס נראה בתרבויות כמפורט בטקסט הנלווה הרכיב את התרביות עם מדיום הרכבה פלואורסצנטי והחלקת כיסוי.

דמיינו את התרביות בזווית של 20x תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הקלט תמונות של נוירונים חיוביים של GFP לניתוח. מצאנו כי בטכניקה זו, כ-75% מהמוחות האלקטרופוטיים מכוונים לאזור הרצוי בקליפת המוח, בין אם זה קליפת המוח האמצעית הגבית או קליפת המוח הצדדית הגחונית.

מצאנו אלקטרופורציה מוקדמת ב-E 13 עד 14 מכוונת לתאי עצב בשכבה עמוקה כגון TBR שכבה חיובית אחת, שישה נוירונים, בעוד שאלקטרופופורציה מאוחרת מכוונת ל-CT IP, שני TBR חיובי, שכבה שלילית אחת, חמישה תאים, ובהמשך מטרת האלקטרופורציה BRN, שתיים שכבה חיובית, שנייה, חתך, שלושה תאים. כאן אנו מראים קטעי עטרה של מוחות שעברו אלקטרופוטציה ביום העוברי 15.5 או 17.5 ונקטפו ביום החמישי שלאחר הלידה. בתרבית, אחוז התאים ש-GFP חיובי יכול לנוע מאוד בהתאם למידת השמרנות שלך בעת ניתוח האזור החיובי של GFP.

עם זאת, גם כאשר אנו שמרנים מאוד ומנתחים רק את החלק החיובי של תאים GFP, האחוז הגבוה ביותר שאנו רואים הוא 5 עד 10%יעילות טרנספקציה נמוכה זו עוזרת לזהות אילו תהליכים שייכים לתא האלקטרופוטרי שאתה מנתח. ציפוי תאים בצפיפות גבוהה יותר תורם לקיום תרביות בריאות יותר. עם זאת, קשה להבחין איזה תהליך שייך לאיזה גוף תא בתאים השליליים של GFP.

לאחר הליך זה, ניתן לבצע צביעה חיסונית למספר סמנים שונים על מנת לענות על שאלות הנוגעות להתפשטות, סינפטוגנזה וקביעת סולפט. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בריאגנטים וכלים סטריליים למניעת זיהום וזיהום לאחר שליטה. כל היבט של טכניקה זו יכול להתבצע תוך שעתיים-שלוש אם הוא מבוצע כראוי.

אז זהו. תודה שצפית. בהצלחה בניסויים שלך.