Name: הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-12T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: למדו הכנת פרוסות רשתית מותאמות חושך בעכברים לרישום אלקטרופיזיולוגי. שיטה זו מאפשרת חקר מסלולי העברת אותות בתאי הרשתית בתגובה לגירוי אור.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי NIH גרנט EY17606 (APS).

1. הכנת אלקטרודות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את האלקטרודות הקלטה הפניה על ידי טבילה שניהם NaCl 1M ונהיגה 15V ביניהם באמצעות גל סינוס 1 הרץ עבור ~ 20 שניות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את האלקטרודות הקלטה באמצעות חולץ micropipette (סאטר מכשירי P-97). עבור תיקון-pipettes להשתמש בורוסיליקט זכוכית בקוטר חיצוני של 1.2 מ"מ ו בקוטר הפנימי של 0.69 מ"מ (סאטר מכשירים, חתול # B120-69-10). מדוד את התנגדות סדרה דרך קצה האלקטרודה. בהתבסס על גודל התאים היעד לבחור קוטר קצה פיפטה, עבור גופי התא ~ 20 מיקרומטר להשתמש בקוטר 5 ~ MΩ עבור גופי התא ~ 5 מיקרומטר להשתמש בקוטר ~ 12 MΩ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת הקרקע / אלקטרודות התייחסות. באמצעות מזרק למלא קטע קטן צינורות פוליאתילן (Intramedic, PE205) עם 1 mM NaCl הכוללת אגר 3.5% (Sigma, חתול # A7002) ב NaCl 1M. המקום הזה אגר גשר מעל אלקטרודת Ag / AgCl ההתייחסות. </li></ol> 2. הכנת פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמבטיה פתרון חיצוני, "מדיה המכילה ביקרבונט (1 ליטר): 1 בקבוק איימס איימס בינוני (Sigma, חתול # A1420), 1.9 גרם של NaHCO 3, 7 מ"ל של סטרפטומיצין, פניצילין (Sigma, חתול # P0781) כדי למנוע חיידקים צמיחה. התאם osmolarity כדי mOsm 280 ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיתוך פתרון, "מדיה המכילה את מאגר ה-pH HEPES (1 ליטר): 1 בקבוק איימס איימס בינוני, 0.887 גרם של NaCl, 2.38 גרם של HEPES, 7 מ"ל של סטרפטומיצין, פניצילין. התאם את ה-pH ל ~ 7.4 באמצעות 1M NaOH ו / או 1M HCl. התאם osmolarity כדי mOsm 280 ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשלגן-Aspartate (K-ASP) פתרון פיפטה פנימי (מ"מ): 125-K-Aspartate, KCl 10, 10 HEPES, 5 NMG-HEDTA, 0.5 CaCl 2, 1-ATP מ"ג, 0.2 מ"ג GTP; pH מותאם ~ 7.3 עם NMG-OH, ו osmolarity מותאם mOsm 280 ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבלימת הכדור אגר לייצוב טמפרטורה נמוכה gelling agarose המכיל את הרשתית (5% לפי משקל), 7.5 גרם של אגר (Sigma, חתול # A7002) נמס 150 מ"ל של DH 2 O. </li></ol> 3. יום של הניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי ~ 1.5 מ"ל של פתרון פנימי K-ASP ו fluorophore על פי בחירתך מהמקפיא. לדלל את fluorophore לריכוז המתאים, אשר יש לקבוע באופן אמפירי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים התקשורת "איימס המכיל NaHCO 3 (~ 200 מ"ל) לתוך מיכל אור חזק האחסון ולאחר מכן למקם לאמבטיה מים (30-32 ° C) לאזן עם 5% CO 2 / 95% O 2 גז </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו בקבוק עם 110 מ"ל ~ של התקשורת "איימס המכיל HEPES, במקום על קרח לאזן עם 100% O 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שאר כלי התקשורת "איימס המכיל NaHCO 3 במאגר מחומם על גבי כלוב פאראדיי, והוא לאזן עם 5% CO 2 / 95% O 2 גז. Parafilm ניתן להשתמש כדי ללכוד את הגז בחלל מעל הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הטמפרטורה הנמוכה gelling agarose (3%) על ידי הוספת 0.75 גרם (Sigma, חתול # A0701) ל 25 מ"ל של התקשורת "איימס עם HEPES והפתרון חום ~ 115 ° C כדי להמיס את agarose. מערבבים עד הפתרון ברור ללא בועות, ולאחסן באמבט מים (~ 42 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו פיפטה הקלטה עם פתרון K-Asp הפנימי לבדוק את קצה ההתנגדות. </li></ol> 4. בגין הניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר במהירות להסיר את העיניים בעזרת מספריים מעוקל. משקפי אינפרא אדום אמור לשמש עבור כל ההליכים כדי למנוע הלבנת של פיגמנט הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את עיניו על פיסת נייר סינון כדי למנוע מהם להתגלגל, באמצעות להב דק דו צדדי, לבצע חתך בקרנית בעוד מחזיק את העין עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע את גלגל העין הוא ניקב, העברת הם העין לתוך צלחת מלא עם התקשורת "איימס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות חתך בקרנית כנקודת כניסה, מספריים קטנים המשמשים לחתוך את החלקים הנותרים של הקרנית, לאחר מכן את העדשה זגוגי ניתן להסירו. היזהר כי הרשתית נשאר מחובר עיינית, ולאחסן את עיינית בחושך ב 32 ° C בתקשורת equilibrated עם 5% CO 2 / 95% O 2 "איימס. </li></ol> 5. פלוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hemisect אחד eyecups ו לנתק את הרשתית של אפיתל הפיגמנט ברשתית. הסר את הקצוות של הרשתית, כדי לאפשר לרקמות לשכב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכוס קטנה פיפטה פסטר עם נורת לטקס למלא צלחת פטרי 35 מ"מ עם אגר מומס, וגרור את פני באמצעות מלקחיים אגר כדי לבדוק עקביות שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אתה יכול להתחיל לראות אגר לחזק: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הרשתית לחלק העליון של אגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש חתיכת מעוות של Kimwipe לספוג את הפתרון עודף סביב הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 2-3 טיפות של אגר ישירות על גבי הרשתית במהירות למקום גליל פלסטיק על הרשתית להקים גדר מסביב. ואז לטפטף אגר נמס נוסף לצדי גליל הפלסטיק תוך מרכוז הרשתית בתוך אגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את צלחת פטרי to מי קרח אמבטיה להתקרר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ~ 45 שניות להסיר את הרקמה מן הרחצה במי קרח ולהשתמש הבוכנה כדי extrude אגר לחסום מתוך גליל הפלסטיק, דוחפים מהצד הרחוק ביותר מן הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בלהב חד צדדי גילוח לחתוך את גוש קטן של אגר המכיל את הרשתית ואת הדבק את הבלוק למקום נגד גדר המגרש אגר בדיסק הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת את הדיסק הדגימה למגש microtome רוטט ויוצקים קרים HEPES איימס למגש המאפשר לחסום עם הרשתית להיות טבלו מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשתית פרוסות בעובי של ~ 200 מיקרומטר ניתן לחתוך בשיעור המרבי להב רוטט ומהירות להב קדימה סט כזה, כי זה לוקח 4-5 שניות כדי לחתוך דרך הרשתית על כל פרוסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש להב 11 מס 'אזמל כדי להסיר כל פרוסה אחת שמיש בכל פעם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוסות טוב המכיל ברשתית ממוקמים לתאי הקלטה משוקללים למטה עם עוגנים פרוסה עם חוטי ניילון מעבר להם. חוטי ניילון החזק את אגר המקיפים את הרשתית, משאירים את הרשתית בלא הפרעה עבור הקלטות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה לתא הקלטה לשלב של המיקרוסקופ זקוף, לסגור את הווילון להפעיל את מקור האור האינפרא אדום כדי להציג את הפרוסה על מצלמת אינפרא אדום רגיש. </li></ol> 6. הקלטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פרוסת רשתית טוב (עם photoreceptors שלם זווית חיתוך מתאים) מזוהה להתחיל המרוססת הרשתית בשיעור של יותר מ -5 mL / min עם התקשורת איימס "כי מחומם מחוממת 35 37 ° C ו equilibrated עם 5% CO 2 / 95% O 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמה נזק משטח עשוי להיות ניכר, בשל תהליך חיתוך. שכבה זו של תאים דקה בדרך כלל ניתן להסיר בעזרת פיפטה עם קצה שבור, בעדינות למצוץ ממנו את גופי התא מת. זה יהיה בדרך כלל חושפים תאים חיים מתחת. זהה את גוף התא בריא שמעמדם נמצא בשכבות של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מילוי micropipette עם פתרון הפנימי KAsp ולהפעיל לחץ חיובי (החוצה) דרך קצה פיפטה, ולהפחית את קצה פיפטה החדרה הקלטה עד לרמת התא באמצעות micromanipulator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את קצה פיפטה כזאת שזה הגומות של קרום התא, ולהחיל עדין לחץ שלילי (פנימה) כדי להפוך את חותם עמידות גבוהה. שלמות התא במצב יכולה להיות מושגת על ידי הפעלת לחץ שלילי על האלקטרודה לפרוץ לתוך התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרה את רקמת הרשתית באמצעות נוריות אז יכול לעורר תגובות לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צילום התא שממנו ההקלטה נעשתה על ידי לעורר הקרינה מן fluorophore בפתרון טפטפת פנימית. </li></ol> 7. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2107/2107fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. כאן, אור עורר הפוטנציאלים של אפל המותאמות נוירון הרשתית אל הבזקי אור של כוח הגדלת מוצגים. <img src="/files/ftp_upload/2107/2107fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. תמונה הקרינה מן פרוסת ברשתית שבו התאים היו מלאים fluorophore, לוציפר צהוב. הקרינה עורר מראה את המורפולוגיה של תאים שמהם הקלטות תיקון נעשו.

<ol><li>Weblin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+along+and+between+rods+in+the+tiger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transmission along and between rods in the tiger salamander retina.</a> J Physiol. 280, 449-470 (1978).</li>
<li>Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+connections+among+retina+neurons+in+living+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Synaptic connections among retina neurons in living slices.</a> J Neurosci Methods. 20, 139-149 (1987).</li>
<li>Rieke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+contrast+adaptation+in+salamander+bipolar+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Temporal contrast adaptation in salamander bipolar cell.</a> J Neurosci. 21, 9445-9454 (2001).</li>
<li>Armstrong-Gold, C., &amp, R. ieke, F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bandpass+filtering+at+the+rod+to+second-order+cell+synapse+in+salamander+%28Ambystoma+tigrinum%29+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bandpass filtering at the rod to second-order cell synapse in salamander (Ambystoma tigrinum) retina.</a> J Neurosci. 23, 3796-3806 (2003).</li>
<li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+plan+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The fundamental plan of the retina.</a> Nat Neurosci. 4, 877-886 (2001).</li>
<li>Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+processing+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parallel processing in the mammalian retina.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הקלטה פורסים מן הרשתית חוליות נעשו במשך עשרות שנים 1,2, ואת כבר די מוצלח במתן הבנה עמוקה יותר של האופן שבו המעגלים רשתית מקודד אור התקרית. היתרונות של חיתוך עם microtome רוטט ולא ישירות עם סכין גילוח היא פרוסות רשתית להיגרם נזק פחות על פני השטח. עם טפטפת יניקה קל להסיר נזק לתאים בריאים היעד מתחת לפני השטח, כי לשמור על קישוריות שלהם במעגל הרשתית, שם רוב סוגי תאים זוהו 5,6, וכי התגובות חזקים להציג לאור. כך מהדק תיקון הקלטות כהה מותאם פרוסות רשתית יכולה להרשות ח...

<table><tbody><tr><td>מכשיר למשיכת מיקרופיפטות</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית בורוסיליקט</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>צינוריות פוליאתילן</td><td>Intramedic</td><td>PE205</td><td></td></tr><tr><td>אגר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7002</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז בטמפרטורת ג'ל נמוכה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0701</td><td></td></tr><tr><td>מצע Ames&amp;rsquo;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומייסין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr></tbody></table>

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת dark המותאמות פרוסה

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

החוויה החזותית שלנו היא יזמה כאשר הפיגמנט חזותית קולטני האור ברשתית שלנו סופג אנרגיה של פוטונים אור יוזם מפל של אירועים תאיים שמובילים סגירת מחזורית-נוקלאוטיד-מגודרת תעלות בקרום התא. השינוי וכתוצאה מכך פוטנציאל קרום מוביל בתורו להפחתה בסכום של שחרור הנוירוטרנסמיטר מן המוט וגם מסופי חרוט הסינפטי. כדי למדוד כיצד לשנות אור עורר בפוטנציאל הממברנה photoreceptor מוביל פעילות הזרם ברשתית, הצליחו המדענים הקלטות אלקטרו מן ההכנות פרוסה רשתית עבור 1,2 עשורים. בעבר פרוסות אלה קוצצו באופן ידני בסכין גילוח על רקמת הרשתית המצורפת נייר מסנן: בשנים האחרונות שיטה אחרת של חיתוך פותחה לפיה רקמת הרשתית מוטבע אגר gelling נמוך הטמפרטורה פרוס פתרון מגניב עם רוטט microtome 3,4. הכנה זו מייצרת פרוסות רשתית עם נזק משטח פחות ותגובות אור עורר מאוד חזקים. כאן אנו מסמך כיצד הליך זה יכול להתבצע תחת אור אינפרא אדום, כדי למנוע הלבנת הפיגמנט חזותית.

כאן אנו מתארים את הליך להפקת כהה מותאם פרוסות של הרשתית העכבר על הקלטות אלקטרו.

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

החוויה החזותית שלנו מתחילה כאשר הפיגמנט החזותי בפוטורצפטורים הרשתית שלנו סופג פוטונים של אנרגיית אור ומפעיל שרשרת של...

החוויה החזותית שלנו מתחילה כאשר הפיגמנט החזותי בפוטורצפטורים של הרשתית סופג פוטונים של אנרגיית אור, מה שמוביל בסופו של דבר לסגירה של תעלות המופעלות על ידי נוקלאוטיד ציקלי בממברנת התא. פעולה זו מדכאת את שחרורו של הנוירוטרנסמיטר glutamate הן מהמקלות והן מהקונוסים. ה-glutamate המשוחרר מזוהה על ידי תאי רשתית במורד המסלול כדי לחקור את האותות הבאים לאחר מכן.העיניים מוסרות מעכבר שהורדם. ה-S מבודלים, מוטמעים בבלוק אגר ונחתכים באמצעות מיקרוטום רוטט. לאחר מכן, פרוסות הרשתინა מונחות תחת מיקרוסקופ ועוברות גירוי באמצעות תאורת LED.בזמן זה מתבצעות הקלטות patch clamp למדידת הזרמים או הפוטנציאלים הסינפטיים הנוצרים. בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקשו בביצועה בשל המורכבויות הנוספות הכרוכות בעבודה בחשיכה. לכן, היכולת להמחיש את התהליך כולו תעניק תחושה שקשה לתאר בדרכים אחרות.התחילו את הפרוצדורה על ידי ציפוי אלקטרודות תיל ההקלטה והייחוס שבהן תשתמשו בשכבה של כסוף כלוריד. טבלו את האלקטרודות בנתרן כלוריד בריכוז 1 M. לאחר מכן, באמצעות מקור מתח של 15 volt עם גל סינוס בתדר של 1 hz, העבירו ביניהן מתח של 15 volt למשך כ-20 שניות.באמצעות מכשיר למשיכת מיקרו-פיפטות, הכין פיפטות ל-patch מזכוכית סיליקה BO שעברה ליטוש באש, תוך בחירת התנגדות של קצה הפיפטה בהתאם לגודל תאי המטרה עבור גופי תא בקוטר של כ-20 מיקרון. השתמש בפיפטה בעלת התנגדות קצה של 5 עד 10 mega ohms עבור גופי תא. עבור גופי תא בקוטר של כ-5 מיקרון, השתמש בהתנגדות קצה של 12 עד 15 mega ohms.להכנת אלקטרודות הייחוס של הקרקע, השתמש במזרק כדי למלא צינור פוליאתילן בתמיסת agar בריכוז 3.5% שהוכנה בנתרן כלוריד בריכוז one millimolar. לאחר מכן, הכן את התמיסות הבאות בהתאם להוראות בפרוטוקול הכתוב המצורף: תמיסת אמבט חיצונית, תמיסת חיתוך, תמיסה פנימית לפיפט potassium aspartate, ומחסום ה-agar.יש לאחסן את כל התמיסות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד למועד השימוש. ביום הניסוי, יש להוסיף כ-1.5 milliliters של תמיסה פנימית של potassium aspartate. לאחר מכן, יש להוסיף Fluor מדולל.שפכו כ-50 milliliters של מצע aims המכיל sodium bicarbonate לתוך מכל אחסון אטום לאור. חברו את צינור הפלסטיק למכל גז המכיל 5% carbon dioxide ו-95% oxygen כדי להגיע לשיווי משקל בין מצע ה-aims לגז, ולאחר מכן הניחו את המכל באמבט מים בטמפרטורה של 30 עד 32 degrees Celsius. לאחר מכן, מלאו בקבוק ב-110 milliliters של מצע aims המכיל he peas והניחו אותו על קרח.יש להשוות את המדיום על ידי הבעבוע של התמיסה עם גז oxygen 100%. העבירו את שארית מדיום aimes המכיל sodium bicarbonate למאגר מחומם שמעל כלוב פאראדיי. עטפו את הצינורית ופיית הבקבוק ב-paraform כדי ללכוד גז בחלל שמעל התמיסה ולהגיע לשיווי משקל עם 5% carbon dioxide ו-95% גז oxygen.באמצעות צינור פיזור אוויר מזכוכית, הכין אגר בטמפרטורת ג'ל נמוכה בריכוז 3% על ידי הוספת 0.75 גרם ל-25 מיליליטר של מצע aims תוך חימום. חמם את התמיסה לערך של 115 מעלות צלזיוס תוך כדי ערבוב. כאשר התמיסה הופכת שקופה וללא בועות, העבר את תמיסת האגר המומסת למקלח מים בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס.הקימו את תא ההקלטה על המיקרוסקופ ההפוך. החליקו גשר אגר באורך חמישה סנטימטרים מעל אלקטרודת הייחוס מסילבר/סילבר כלוריד ומקמו אותו בתא ההקלטה. ניתן למדוד את התנגדות קצה הפיפטה על ידי מילוי פיפטה בתמיסה פנימית, הנחתה על מחזיק הפיפטה, הכנסת מחזיק הפיפטה לשלב הראש של המגבר, והורדת הפיפטה אל תוך התמיסה. כדי לשמר את הפיגמנט הראייתי עבור הקלטות פיזיולוגיות, יש לבצע את כל הפרוצדורות תחת אור אינפרא-אדום תוך שימוש במשקפי אינפרא-אדום, אך כל הפרוצדורות יוצגו כאן באור חדר.לאחר ביצוע ההדשתו של העכבר, השתמש במספריים קמורות כדי להוציא במהירות את העיניים. הנח את העיניים על פיסת נייר סינון כדי למנוע מהן להתגלגל. לאחר מכן, החזק עין אחת במקומה בעזרת פינצטה והשתמש בלהב דק דו-צדדי כדי לבצע חתך בקרנית.ברגע שגלגל העין ננקב, העבירו את העין למנתra פטרי בקוטר 60 מילימטר הממולאה בתווך aims. בעזרת החריץ בקרנית כנקודת כניסה, השתמשו במספריים קטנים כדי לגזור את חלקי הקרנית הנותרים.לאחר מכן הסר את העדשה ואת הגוף הזגוגית, תוך וידוא שהרשתית נשארת מחוברת לגביע העין. הנח אותה במכל אטום לאור המלא במדיום aims, ששיווי משקלו בוצע עם 5%carbon dioxide ב-95%oxygen בטמפרטורה של 32 degrees celsius.בצע חיתוך רוחבי של אחת מגביעי העין באמצעות להב סקלפל מספר 10. הפרד את הרשתית מהאפיתל הפיגמנטי של הרשתית.הסר את קצוות הרשתית כדי לאפשר לרקמה להישאר שטוחה. השתמש בפיפטת פסטורי זכוכית קטנה עם בלונית לטקס כדי למלא צלחת פטרי של 35 מילימטר באגר עם טמפרטורת ג'לטינציה נמוכה מומס, והעבר את הפינצטה דרך האגר כדי לבדוק את הסמיכות שלו. ברגע שהאגר מתחיל להתמצק, העבר את הרשתית לחלקו העליון של האגר.לאחר מכן, ללא מגע עם הרשתית, השתמש בחתיכה מקופלת של נייר ניגוב מסוג Kim wipe כדי לספוג את עודפי התמיסה שסביבה. טפטף שתי עד שלוש טיפות נוספות של אגר ישירות על הרשתית והנח במהירות גליל פלסטיק כדי ליצור דופן סביבה; תוך שמירה על הרשתית קרוב למרכז הגליל, טפטף אגר מומס נוסף, והעבר את צלחת הפטרי לאמבט מי קרח לצורך קירור. לאחר 30 שניות, הוצא את הרקמה והשתמש בבוכנה כדי לדחוף החוצה את בלוק האגר, תוך לחיצה מהצד הרחוק ביותר מהרשתית.השתמשו בלהב תער חד-צדדי כדי לחתוך קובייה קטנה של אגר הכוללת את הרשתית, והדביקו את הקובייה בעזרת דבק מהיר (super glue) אל מעצור האגר בדיסק הדגימות. העבירו את דיסק הדגימות למעמד המיקרוטום הרוטט ושפכו לתוך המעמד תמיסת AIMS קרה מאוד, כך שהקובייה עם הרשתית תהיה טבולה לחלוטין. חתכו פרוסות רשתית בעובי של כ-200 microns תוך שימוש בקצב הרטט המקסימלי של הלהב, כאשר מהירות התקדמות הלהב מוגדרת כך שארכה של חיתוך בודד דרך הרשתית הוא ארבע עד חמש שניות.השתמשו בלהב סכין מנתחים מספר 11 כדי לחתוך מהבלוק כל פרוסה שמיחה אחת לאחר השנייה. הניחו את הפרוסות המכילות את הרשתית בתאי רישום וקבעו אותן. השתמשו בעוגני פרוסות כאשר חוטי הניילון חוצים את עוגן הפרוסה.החזיקו את האגר המקיף את הרשתית, כך שהרשתית תישאר ללא חסמים. לצורך ההקלטות, העבירו את תא ההקלטה אל הבמה של המיקרוסקופ הזקוף.סגרו את הווילון והדליקו את מקור האור באינפרא-אדום כדי לצפות בחתך באמצעות מצלמה הרגישה לאינפרא-אדום. תחת המיקרוסקופ, זהו חתך רשתית עם פוטורצפטורים שלמים בזווית החיתוך המתאימה. ייתכנו נזקים שטחיים מסוימים כתוצאה מתהליך החיתוך.בעזרת פיפט עם קצה שבור, שאבו בעדינות את גופי התאים המתים. כדי להסיר שכבה דקה זו של תאים, לאחר ששכבה בריאה של תאים חיים נחשפה, זהו גוף תא שנמצא בשכבות המעניינות את המחקר. העבירו את קצה הפיפט כך שייצור שקע בממברנת התא, והפעילו לחץ שלילי עדין (כלפי פנים) כדי ליצור אטימה בעלת התנגדות גבוהה. ניתן להגיע למצב תא שלם (Whole cell mode) על ידי הפעלת לחץ שלילי על האלקטרודה כדי לפרוץ אל תוך התא.לאחר מכן, גרה את רקמת הרשת באמצעות אור באמצעות נוריות LED כדי לעורר תגובות. בסיום ההקלטה, צלם תמונה באמצעות אור העירור המתאים עבור ה-Fluor שדיפוזיונל (dialyzed) אל התא מהתמיסה הפנימית של הפיפטה. כאן מוצגים פוטנציאלים מעוררי אור של נוירון רשת שעבר הסתגלות לחושך, בתגובה להבזקי אור בעוצמה עולה.איור זה הוא תמונת פלואורסצנציה שצולמה מפרוסה רשתית שבה התאים מולאו ב-Fluor Lucifer yellow; הפלואורסצנציה שהתעוררה מראה את המורפולוגיה של התאים מהם בוצעו הקלטות patch. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה יותר של חלק מהמורכבויות הכרוכות בביצוע הקלטות patch clamp מפרוסות רשתית שהותאמו לחושך. מטרת הליך זה היא למדוד תגובות המעוררות על ידי אור תחת תאורה מבוקרת.על מנת לעשות זאת, עלינו תחילה לבודד את הרשתית, להטמיע אותה באגר (agar), ולאחר מכן להכין פרוסות רשתית מהן נוכל לבצע הקלטות של תאים בודדים.

patch-clamp-recordings-from-mouse-retinal-neurons-dark-adapted-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

וידאו זה מציג את התהליך של כל תא מהדק הקלטות מתח הפרוסה הרשתית של נמר מימיים סלמנדרה. אנו מדגימים את הכנת הפרוסה וכן כיצד לבצע הקלטות מהדק תיקון במהלך גירוי ויזואלי של הרשתית.

שלמות התא הקלטות של אור עורר זרמים Synaptic מעוררים פורסים את רשתית

מאמר זה מספק תיאור של איך לנתח ולתעד מן ההכנה רשתית מבודד העכבר. בפרט, אנו מתארים כיצד לרשום בתגובות אור אוכלוסייה שכותרתו fluorescently תא הגנגליון ובהמשך לזהות ולנתח את המורפולוגיה שלה.

הכנה רשתית מבודד להקליט תגובה האור תווית גנטית לתאי הגנגליון ברשתית

כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת אגר, מוטבע פרוסות רשתית המתאימים electrophysiology ו Ca2 + הדמיה. שיטה זו מאפשרת ללמוד סרט מסוג הסינפסות microcircuits הרשתית באמצעות תיקון ישיר, מהדק הקלטות של אחד מסופי העצב presynaptic.

Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca 2 + הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית

אנו מתארים שיטה פשוטה יחסית של transretinal electroretinogram (ERG) הקלטות להשגת photoresponses מוט חרוט מן הרשתית העכבר ללא פגע. גישה זו מנצלת את הבלוק של הולכה סינפטית מ photoreceptors לבודד תגובות אור שלהם ולהקליט אותם באמצעות אלקטרודות המונחות על פני שטח הרשתית שטוח רכוב מבודד.

Transretinal ERG הקלטות של רשתית עכבר: רוד Photoresponses חרוט

סרטון זה מדגים טכניקת מהדק טלאי של תא שלם להקלטה אלקטרופיזיולוגית מרשתית עכבר שטוחה. פיפטת זכוכית דקה עם אלקטרודה משמשת להתקרבות לתאים אמקריניים מתפוצצים בכוכבים (SACs) בתוך הרשתית. לאחר יצירת חותם, היניקה מוחלת כדי לקרוע את הממברנה וליצור את תצורת מהדק טלאי התא כולו. לבסוף, זרימת היונים דרך קולטני SAC סינפטיים נמדדת באמצעות התצורה.

הקמת מהדק טלאי לכל התא להקלטה אלקטרופיזיולוגית מרשתית עכבר שטוחה

סרטון זה מדגים הקלטה של תגובות פוסט-סינפטיות מעוררות אור בהכנת פרוסת רקמת רשתית עכבר מותאמת כהה. פרוסת הרשתית ממוקמת בתא הקלטה, ופיפטת הקלטה משמשת ליצירת רצף חשמלי עם תא גנגליון רשתית. פולסי אור מוחלים כדי ליצור פוטנציאלים פוסט-סינפטיים מעוררים בתאי הגנגליון, אשר נרשמים על ידי פיפטה.

תגובות פוסט-סינפטיות מעוררות אור בתאי עצב של פרוסות רשתית עכבר

אנו מתארים את ההכנה של פרוסות רשתית דקות ממימיות נמר סלמנדרות...

כל תא הקלטות בו זמנית מקולטני אור ועל נוירונים מסדר שני בהכנה פורסים רשתית אמפיבי

מאמר זה וידאו מדגים את ההגדרה, את ההליכים לתיקון גופי תא וכיצד ליישם את הקלטות מהדק דינמיות מתאי הגנגליון בכל הר עכבר רשתיות. טכניקה זו מאפשרת החקירה של התרומה המדויקת של תשומות סינפטיים מעוררות ומעכבות, ואת העצמה היחסית והעיתוי שלהם לspiking העצבי.

יישום קלאמפ דינמי עם Conductances Synaptic ומלאכותי בתאי עכבר גנגליון רשתית

נדגים כיצד להכין פרוסות רשתית מעין העכבר ולתעד תגובות אור בתאי עצב ברשתית. ההליך כולו מתנהל בתנאים מותאמים לחושך.

הקלטת אור עורר תגובות Postsynaptic בנוירונים מותאמים-Dark, תכשירי עכבר רשתית Slice באמצעות טכניקות הצמד התיקון

פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע הקלטת תיקון מהדק כל תא על נוירונים ברשתית מן הכנת שטוח הר.

צמד תיקון הקלטה של ​​תאי הקרנות amacrine בתוך הכנת שטוח הר Deafferentated רשתית העכבר

פתחנו תכשיר חתך אופקי של הרשתית היונקת הבוגרת עם המטוס של חתך במקביל לפני שטח הרשתית. שדות דנדריטים של נוירונים ברשתית אוריינטציה nonradially לא היו מקוצץ, המאפשר חקר עיבוד אותות עם טכניקות תיקון- clamp והדמיה.

הכנת פרוסות אופקיות של רשתית למבוגרים עכבר עבור אלקטרו מחקרים

למדו הכנת פרוסות רשתית מותאמות חושך בעכברים לרישום אלקטרופיזיולוגי. שיטה זו מאפשרת חקר מסלולי העברת אותות בתאי הרשתית בתגובה לגירוי אור.

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

גלה סרטונים נוספים