הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה
12 בספטמבר 2010
כאן אנו מתארים את הליך להפקת כהה מותאם פרוסות של הרשתית העכבר על הקלטות אלקטרו.
החוויה החזותית שלנו מתחילה כאשר הפיגמנט החזותי בקולטני האור ברשתית שלנו סופג פוטונים של אנרגיית אור, מה שמוביל בסופו של דבר לסגירת תעלות מגודרות נוקלאוטידים מחזוריות בקרום התא. זה מדכא את שחרור המוליך העצבי גלוטמט הן ממוטות והן מדוכים. הגלוטמט המשוחרר מורגש על ידי תאי רשתית במורד הזרם כדי לחקור את האותות במורד הזרם.
העיניים מוסרות מעכבר שהורדם. ה-S מבודדים, משובצים בגוש אגר ופורסים באמצעות מיקרוטום רוטט. לאחר מכן, פרוסות הרשתית מונחות מתחת למיקרוסקופ ומגורות בתאורת LED.
בעוד שהקלטות מהדק תיקון נלקחות כדי למדוד את הזרמים הסינפטיים או הפוטנציאלים שנוצרו. בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל המורכבות הנוספת של עבודה בחושך. אז היכולת לדמיין את התהליך כולו תספק תחושה שאחרת קשה לתאר.
התחל הליך זה על ידי ציפוי אלקטרודות חוט ההקלטה והייחוס שישמשו בשכבת כלוריד כסף. טובלים את האלקטרודות בנתרן כלורי מולארי אחד. לאחר מכן באמצעות מקור מתח של 15 וולט עם גל סינוס הרץ אחד מניע 15 וולט ביניהם למשך כ -20 שניות.
בעזרת מושך מיקרו פיפטה, הכינו פיפטות תיקון מזכוכית סיליקה BO מלוטשת באש, ובחרו התנגדות לקצה פיפטה על סמך גודל תאי המטרה לגופי תאים בקוטר של כ-20 מיקרון. השתמש ב-PET צינור עם התנגדות קצה של חמישה עד 10 מגה אוהם לגופי תאים. לאחר קוטר של כחמישה מיקרון, השתמש בהתנגדות קצה של 12 עד 15 מגה אוהם.
כדי להכין את אלקטרודות הייחוס הקרקעיות, השתמש במזרק למילוי צינורות פוליאתילן בתמיסת אגר 3.5% שהוכנה בנתרן כלורי מילי-מולרי אחד. לאחר מכן, הכינו את הפתרונות הבאים על פי ההוראות בפרוטוקול הכתוב הנלווה. תמיסת חיתוך תמיסת אמבטיה חיצונית, תמיסה פנימית של פיפטת אשלגן אספרטט ומעצור האגר
.אחסן את כל הפתרונות בארבע מעלות צלזיוס עד שהם נחוצים. ביום הניסוי, תור כ-1.5 מיליליטר של תמיסה פנימית של אשלגן אספרטט. לאחר מכן מוסיפים פלואור מדולל.
יוצקים כ-50 מיליליטר של מדיה מכוונת המכילה נתרן ביקרבונט לתוך מיכל האחסון האטום לאור. חבר את צינורות הפלסטיק למיכל גז המכיל 5% פחמן דו חמצני ו-95% חמצן כדי לאזן את אמצעי המטרות עם הגז, ולאחר מכן הנח את המיכל לאמבט מים של 30 עד 32 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מלאו בקבוק ב -110 מיליליטר מטרות, בינוניות המכילות אפונה והניחו אותו על קרח.
השווה את המדיום על ידי בעבוע התמיסה עם 100% גז חמצן. הנח את המדיום הנותר המכיל נתרן ביקרבונט למאגר מחומם על גבי כלוב פאראדיי. עטפו פרפורם סביב הצינור וראש הבקבוק כדי ללכוד גז בחלל שמעל התמיסה ושיווי משקל עם 5% פחמן דו חמצני, 95% גז חמצן.
בעזרת צינור פיזור אוויר מזכוכית, הכינו טמפרטורת ג'ל נמוכה של 3% על ידי הוספת 0.75 גרם ל -25 מיליליטר של מטרות בינוניות עם חום ערימות. התמיסה היא כ -115 מעלות צלזיוס תוך כדי ערבוב. כאשר התמיסה מתבהרת ללא בועות, הכניסו את תמיסת האגר המומסת לאמבט מים של 42 מעלות צלזיוס.
הגדר את תא ההקלטה במיקרוסקופ ההפוך. החלק גשר אגר של חמישה סנטימטרים מעל אלקטרודת הייחוס של כסף וכסף כלוריד ומקם אותו בתא ההקלטה. ניתן למדוד את התנגדות קצה הפיפטה על ידי מילוי פיפטה בתמיסה פנימית, הנחתה על מחזיק הפיפטה, הכנסת מחזיק הפיפטה לשלב ראש המגבר והורדת הפיפטה לתמיסה לשימור הפיגמנט החזותי להקלטות פיזיולוגיות, יש לבצע את כל ההליכים באור אינפרא אדום באמצעות משקפי אינפרא אדום, אך כל ההליכים יוצגו כאן באור החדר.
לאחר המתת החסד של העכבר, השתמש במספריים מעוקלים כדי להסיר במהירות את העיניים. הנח את העיניים על פיסת נייר סינון כדי למנוע מהן להתגלגל. לאחר מכן החזק עין במקום עם מלקחיים והשתמש בלהב דו צדדי דק כדי ליצור חריץ בקרנית.
ברגע שגלגל העין מנוקב. מעבירים את העין לצלחת פטרי בגודל 60 מילימטר מלאה במדיום מטרות. השתמש בחריץ בקרנית כנקודת כניסה, השתמש במספריים קטנים כדי לחתוך את החלקים הנותרים של הקרנית.
לאחר מכן הסר את העדשה ואת הזגוגית, וודא שהרשתית תישאר מחוברת לכוס העין. הניחו אותו בכלי אטום ומלא במטרות. בינוני מאוזן עם 5% פחמן דו חמצני ב-95% חמצן ב-32 מעלות צלזיוס.
הבא hemis sec. אחת מכוסות העיניים באמצעות להב אזמל מספר 10. הפרד את הרשתית מאפיתל פיגמנט הרשתית.
הסר את שולי הרשתית כדי לאפשר לרקמה לחיות שטוחה. השתמש בפיפטות פסטה זכוכית קטנות עם נורת לטקס כדי למלא צלחת פטרי בגודל 35 מילימטר באגר טמפרטורת ג'ל נמוכה מומסת ולגרור את המלקחיים דרך האגר כדי לבדוק את עקביותו. ברגע שהאגר מתחיל להתמצק, העבירו את הרשתית לראש האגר.
לאחר מכן, מבלי לגעת ברשתית, השתמשו בחתיכה מעוותת של מגבון קים כדי לספוג את התמיסה העודפת סביבה. מניחים שתיים עד שלוש טיפות נוספות של אגר ישירות על הרשתית ומניחים במהירות גליל פלסטיק ליצירת קיר סביבו תוך שמירה על הרשתית ליד מרכז הגליל טפטוף אגר מומס נוסף, מעבירים את צלחת הפטרי לאמבט מי קרח להתקרר. לאחר 30 שניות, הסר את הרקמה והשתמש בבוכנה כדי להוציא את גוש האגר, לדחוף מהצד הרחוק ביותר מהרשתית.
השתמש בסכין גילוח חד צדדי כדי לחתוך גוש קטן של אגר המכיל את הרשתית והדביק את הבלוק למקומו כנגד מעצור האגר בדיסק הדגימה. העבירו את דיסק הדגימה לעץ המיקרוטום הרוטט ושפכו ערימות מכוונות קרות כקרח לתוך העץ, מה שמאפשר לבלוק עם הרשתית להיות שקוע במלואו. חותכים פרוסות רשתית בעובי של כ-200 מיקרון באמצעות קצב הרטט המרבי של הלהב עם מהירות להב קדמית מוגדרת כך שלוקח ארבע עד חמש שניות לחתוך את הרשתית. פעם.
השתמש בלהב אזמל מספר 11 כדי לחתוך כל פרוסה שמישה מהבלוק אחת בכל פעם. הנח את הפרוסות המכילות את הרשתית בתאי הקלטה והחזק אותן. בעזרת עוגן פרוסה חוטי הניילון החוצים את עוגן הפרוסה.
החזק את האגר המקיף את הרשתית, והשאיר את הרשתית ללא הפרעה. להקלטות. העבר את תא ההקלטה לבמה של המיקרוסקופ הזקוף.
סגור את הווילון והפעל את מקור האור האינפרא אדום כדי view הפרוסה במצלמה רגישה לאינפרא אדום. תחת המיקרוסקופ, זהה פרוסת רשתית עם קולטני אור שלמים בזווית החיתוך המתאימה. נזק מסוים למשטח עשוי להיות ניכר עקב תהליך החיתוך.
בעזרת פיפטה עם קצה שבור לשאוב בעדינות את גופי התאים המתים כדי להסיר את שכבת התאים הדקה הזו, לאחר שהתגלתה שכבה בריאה של תאים חיים, זהה גוף תא שמיקומו ממוקם בשכבות המעניינות. הזז את קצה הפיפטה כך שיפגע בקרום התא והפעל לחץ עדין, שלילי או פנימה כדי ליצור אטימה עמידה במיוחד. ניתן להשיג מצב תא שלם על ידי הפעלת לחץ שלילי על האלקטרודה כדי לפרוץ לתא.
לאחר מכן, עוררו את רקמת הרשתית באור באמצעות נוריות LED כדי לעורר תגובות. בסיום ההקלטה, צלם תמונה באמצעות אור העירור המתאים לפלואור שדיאליזה לתא מהתמיסה הפנימית של הפיפטה. כאן מוצגים פוטנציאלים מעוררי אור של נוירון רשתית מותאם כהה להבזקי אור בעוצמה הולכת וגוברת.
איור זה הוא תמונת פלואורסצנטיות שנלקחה מפרוסת רשתית שבה התאים מולאו בפלואורסצנציה מעוררת צהוב של פלואור לוציפר מראה את המורפולוגיה של התאים שמהם נעשו רישומי טלאים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין טוב יותר כמה מהמורכבויות של ביצוע הקלטות מהדק תיקון מפרוסות רשתית מותאמות כהות. מטרת הליך זה היא למדוד תגובות מעוררות אור בתאורה מבוקרת.
על מנת לעשות זאת, עלינו לבודד תחילה את הרשתית, להטמיע אותה במקדחה ואז להכין פרוסות רשתית מהן נוכל לבצע הקלטות של תאים בודדים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוצדורה להפקת פרוסות רשתית של עכבר המותאמות לחושך, שהן חיוניות להקלטות אלקטרופיזיולוגיות. שיטה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד את נתיבי השליחון בתאי הרשתית בעקבות גירוי של אור.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- ביולוגיה של הרשתית
רקע
- התהליך החזותי מתחיל בספיגת אור על ידי פוטורצפטורים ברשתית.
- פוטוטרנסדוקציה מובילה לשינויים בשחרור מוליכים עצביים.
- הבנת מנגנונים אלו חיונית להשגת תובנות לגבי עיבוד חזותי.
- מודלים של עכברים נמצאים בשימוש נפוץ במחקרי רשתית.
מטרת המחקר
- מתן פרוטוקול מפורט להכנת פרוסות רשתית של עכבר.
- סיוע בביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות בתנאי חשיכה.
- שיפור ההבנה של מסלולי העברה סיגנלית ברשתית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד עיניים מעכברים שהורדמו.
- הטמעה של דגימות רשתית בבלוקים של אגר.
- חיתוך באמצעות מיקרוטום רוטט.
- גירוי של הפרוסות באמצעות תאורת LED תחת מיקרוסקופ.
תוצאות עיקריות
- הפקה מוצלחת של פרוסות רשתית המותאמות לחושך.
- יכולת להקליט תגובות אלקטרופיזיולוגיות מתאי רשתית.
- הדגמה של דיכוי שחרור גלוטמט בתגובה לאור.
- תובנות לגבי סיגנלינג במורד המסלול בנתיבי הרשתית.
מסקנות
- השיטה המתוארת יעילה לחקר פיזיולוגיה של הרשתית.
- רישומים אלקטרופיזיולוגיים יכולים לספק נתונים בעלי ערך על תפקוד הרשתית.
- ניתן ליישם גישה זו במגוון מחקרים במדעי המוח החזותיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
פרוטוקול זה מאפשר מדידה מדויקת של תגובות אלקטרופיזיולוגיות המושרות על ידי אור בנוירונים של הרשתית בתנאי הסתגלות לחושך, ובכך תומך בתיקוף של מטרות במדעי העצבים הויזואליים. באמצעות שימור תפקוד הפוטורצפטורים וצמצום הלבנת הפיגמנטים, הוא משפר את מהימנות הנתונים לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים של היפותזות טיפוליות. גישה זו מספקת מערכת רלוונטית למחלה להערכת השפעות של תרכובות על מסלולי אותות ברשתית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של מנגנוני פוטוטרנסדוקציה (phototransduction) ותיקוף תפקודי של מטרות ברשתית.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות מדידה הדירה של זרמים סינפטיים ושינויים בפוטנציאל הממברנה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: ייצור פרוסות רשתית סטנדרטיות בעלות תגובות חזקות למשפיעי אור לצורך סריקה עקבית של תרכובות.
- ערך תפעולי: מקל על הכנת הבדיקה באמצעות חיתוך במיקרוטום רטט וויזואליזציה באינפרא-אדום למיקוד האלקטרודות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מספק מערכת רלוונטית למחלה להערכת השפעות של תרכובות על שחרור גלוטמט ואיתות רטינלי במורד הזרם.
- ערך תפעולי: מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים להכנת פרוסות ולגירוי.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של גילוי מוקדם על ידי מתן אפשרות לבדיקת השערות לגבי מטרות ברשתית ותמיכה בזיהוי מובילים באמצעות קריאות פונקציונליות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בהבהרה של מסלולים על ידי מדידה של שינויים בפוטנציאל ממבנה הממברנה של פוטורצפטורים המעוררים על ידי אור ופעילות נוירונלית במורד המסלול.
- סריקה: מספקת פלטיים כמותיים כגון אמפליטודות של זרם סינפטי ופוטנציאלים המעוררים על ידי אור לצורך השוואת תגובות לתרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת ניתוח סטטיסטי של הקלטות אלקטרופיזיולוגיות להערכת השפעות תלויות-מינון ו modulate של מסלולים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית באמצעות תנאים סטנדרטיים של הסתגלות לחושך המדמים תפקוד רשתית אנושית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר להערכת מטרות ברשתית על פני מספר פרויקטים ותחומי טיפול.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזיוי על ידי הפחתת עמימות מכניסטית במסלולי התמרות חזותיות.
- ערך תפעולי: משפר את ההדירות באמצעות הטמעה סטנדרטית באגאר, חיתוך במיקרוטום רוטט ופרוצדורות מונחות אינפרא-אדום.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go על ידי אספקת נתונים פונקציונליים מהימנים לגבי מעורבות מטרות רטינליות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של תרכובות על בסיס השפעות על שחרור מוליכים עצביים ואיתות רטינליים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באלקטרופיזיולוגיה, דיסקציה של הרשתית וטכניקות patch clamp.
- תלוי במיקרוטום רוטט, מיקרוסקופיה באינפרא-אדום ומערכות גירוי ב-LED.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של הכנת הפרוסות, שיווי המשקל של התמיסות וטיפול במצב של הסתגלות לחושך.
- כולל שיקולי הסתגלות עבור סוגים שונים של תאי רשתית וריכוזי אגר ספציפיים למין.
- מוגבל על ידי משך חיוניות הרקמה והצורך בשימוש מיידי לאחר החיתוך כדי לשמור על מצב של הסתגלות לחושך.
