אלקטרונים ספין תהודה מיקרו הדמיה המינים Live עבור מיפוי חמצן
26 באוגוסט 2010
פרוטוקול זה מתאר שיטה הדמיה תלת ממדי מיקרון בקנה מידה של ריכוז החמצן בסביבה המיידית של תאים חיים במיקרוסקופ על ידי ספין האלקטרון תהודה.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להשיג תמונות תלת-ממדיות בקנה מידה מיקרוני של ריכוז החמצן בסביבה המיידית של תאים חיים באמצעות תהודה של ספין אלקטרוני או מיקרוסקופיית ESR. הפרוטוקול יודגם על צייאנובקטריות, שהם תאים פוטוסינתטיים נפוצים. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת דגימה של תאי צייאנובקטריות בתוך מחזיק הדגימות של מיקרוסקופיית ה-ESR.
מוטמע בתוך תמיסת רדיקלים אורגניים יציבה. מחזיק הדגימה ממוקם בתוך גשושית הדימות, שנכנסת לאלקטרומגנט הסטטי של מערכת מיקרוסקופ ה-ESR. כעת, מיקרוסקופ ה-ESR מקבל מספר תמונות ESR מיקרוסקופיות תלת-ממדיות של תמיסת הרדיקלים האורגניים.
פעולה זו מבוצעת עבור מספר וריאנטים של רצפי פולסים ולעיתים קרובות תחת תנאים חיצוניים שונים, כגון תנאי אור וחושך. לאחר מכן, תמונות הנתונים הגולמיים מעובדות על ידי המחשב כדי להפיק את זמני הרילקסציה של הרדיקל ברזולוציה מרחבית תלת-ממדית. זמני רילקסציה אלה מספקים מדד ישיר לריכוז החמצן באמצעות כיול קודם, מה שמוביל למפות חמצן תלת-ממדיות מלאות של הדגימות שנמדדו תחת תנאים חיצוניים שונים.
התוצאות המתקבלות מראות בבירור את היעדר ייצור החמצן על ידי הציאנובקטריה כאשר לא מופעל אור. יתרה מכך, הוכח כי תחת הקרנת אור, נוצרים גרדיאנט חמצן משמעותי והטרוגניות של חמצן בקרבת תאי הציאנובקטריה. שלום, אני al מהמעבדה של BLA בפקולטה לכימיה בטכניון, המכון התכנולוגי של ישראל בחיפה.
היום נדגים לכם פרוצדורה למיפוי ריכוזי חמצן בסביבת תאים חיים באופן תלת-ממדי וברזולוציה מרחבית גבוהה, באמצעות מיקרוסקופיית זרוע חזקה. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדתנו כדי לחקור את קצב צריכת החמצן ואת הפעילות המטבולית של תאים. אז בואו נתחיל.
תהודה ספין אלקטרונית, או ESR, היא טכניקה ספקטרוסקופית שבה קרינה אלקטרומגנטית בתדר ספציפי נספגת על ידי מינים פאראמגנטיים בעלי ספין אלקטרוני לא מזווג המונחים תחת שדה מגנטי סטטי חיצוני. זוהי שיטה עוצמתית לחקר הסביבה של מולקולות פאראמגנטיות באורגניזמים חיים, כולל ריכוזים של חמצן ומיני חמצן ריאקטיביים. כאן מוצגת תמונת ריכוז חמצן טיפוסית של עכבר עם גידול עבור דגימות הטרוגניות.
ניתן להשיג מידע ספקטרלי של ESR באופן בעל רזולוציה מרחבית באמצעות שימוש במדרגי שדה מגנטי. רדיקל אורגני חופשי ויציב הוזרק לעכבר, ומאפייני ה-ESR שלו מספקים את ריכוז החמצן בסביבתו. התוצאות המבוססות על ESR מוטלות על גבי תמונת MRI אנטומית.
עד כה, טכניקות דימות ESR אלו של דגימות חיות בוצעו רק עם דגימות גדולות יחסית בסדר גודל של מילימטרים. מיקרוסקופיית ESR ברזולוציה גבוהה כוללת מדידות של דגימות בגודל מילימטרי ותת-מילימטרי, ומספקת תמונות ESR תלת-ממדיות עם רזולוציה המתקרבת למיקרון אחד.
להלן שתי דוגמאות של דימות ESR ברזולוציה גבוהה ובקנה מידה של מיקרון, של דגימה שהוכנה עם אבקת NNC 60 וגבישים פאראמגנטיים של lithium fellow cyanide. מיקרוסקופ ESR דומה לספקטרומטר ESR קונבנציונלי, והוא כולל מגנט ליצירת השדה הסטטי, מערכת מיקרוגלים לעירור ספין ולגילוי אותות, גשש להחזקת הדגימה וקונסולה ממוחשבת לשליטה בתהליך הרכישה ובטיפול בנתונים. רכיבים נוספים של המערכת כוללים מאיצי גרדיאנט של השדה המגנטי, המהווים חלק מהמערכת האלקטרונית, וסלילי גרדיאנט הממוקמים בגשש הדימות.
לסלילי הגרדיאנט יש גם מפתח המאפשר הקרנת אור על הדגימה. אוויר לח בטמפרטורה מבוקרת מופעל על הדגימה כדי להבטיח התייבשות מינימלית במהלך הניסוי. המאפיינים הייחודיים העיקריים של מיקרוסקופיית ESR הם הגודל הקטן של הגשש ושל סלילי הגרדיאנט, רגישות הספין הגבוהה יותר של המערכת ועוצמתם הגבוהה של מניעי גרדיאנט השדה המגנטי. לפני תחילת הליך זה, הכין תרחיף ציאנובקטריה בריכוז של 40 mg/mL.
כדי להתחיל את הכנת הדגימה לדימות מיקרוסקופי ב-ESR, קחו מספר ריבועי נייר סופג בגודל של כ-400 על 400 מיקרון בעזרת פינצטה עדינה. לאחר מכן, הכניסו אותם לשפופרת אינור (einor tube). לאחר מכן, מלאו את השפופרת ב-1.2 milliliters של תרחיף ציאנובקטריות.
לאחר מכן, סבב את התרחף במשך שתי דקות ב-6,000 RPM במיקרו-צנטריפוגה. לאחר הסבב, הסר לחלוטין את העליון למעט כ-50 µL, שנותרים כדי למנוע התייבשות של הציאנובקטריה. תהליך זה מוביל לרוויה של נייר הספיגה בתאי הציאנובקטריה. בשלב הבא, הכן מחזיק דגימות מזכוכית בצורת כוס המיועדת לכך, השבב מספר סיבים מהנייר באמצעות פינצטה עדינה, והנח אותם בתחתית מחזיק הדגימות.
לאחר מכן, הוסיפו שלושה millimolar של תמיסת tridel ו-BG 11, שהוכנה כמתואר בפרוטוקול הכתוב, באמצעות מזרק של שמינית. לאחר מכן, אטמו את מחזיק הדגימה באמצעות דבק המתקשה ב-UV על ידי מריחת הדבק בין קצוות מחזיק הדגימה מזכוכית לבין זכוכית הכיסוי התואמת לו, תוך השארת פתח אוויר קטן פתוח. לבסוף, הקשו את הדבק באמצעות אור UV למשך שתי שניות.
כדי להתחיל את ניסוי הדימוי, הפעילו את מערכת הדימוי ב-ESR והכניסו את הדגימה לתוך הרזונטור הנמצא בתוך גשש הדימוי. כעת, באמצעות תוכנת הבקרה במחשב, העבירו את המערכת למצב כוונון (tune mode) ומצאו את תדר המיקרוגל של התהודה עבור הגשש, אשר ישמש למדידות ה-ESR. לאחר מכן, הגדירו את השדה המגנטי הסטטי לערך התואם לתדר המיקרוגל המופעל.
הגדירו את פרמטרי העיתוי עבור רצף הפולסים וצפו באות ה-ESR כדי לוודא שהמערכת פועלת כראוי ושהדגימה הוכנה היטב. לאחר מכן, הגדירו את פרמטרי ההדמיה, כגון מספר הפיקסלים, עוצמת הגראדיינטים ואורך פולסי הגראדיינט, לערכים הנדרשים. לאחר ההגדרה, אספו שלוש תמונות ESR בתלת-ממד באמצעות רצף פולסים של Han Echo Imaging עם ערכי הפרדה בין-פולסית (tau) של 500, 600 ו-700 ננו-שניות.
בשלב זה, הדליקו את הקרנת האור על הדגימה אם הדבר נדרש עבור התנאים הניסיוניים לאורך הרכישה; הנתונים נשמרים באופן אוטומטי. לאחר תהליך רכישת הנתונים, עיבדו את קובצי הנתונים הגולמיים באמצעות סקריפט של תוכנת MATLAB. השתמשו בתוכנה כדי להפיק תמונות של ריכוז הרדיקל הטריל ושל זמן ההרפיה.
מפת T2 מתורגמת לאחר מכן לתמונה של ריכוז חמצן באמצעות עקומת כיול קיימת, המקשרת בין ריכוז החמצן לבין זמן הרפיה. כאן, T2 zero הוא זמן רפיית הספין-ספין של הגשש בתנאי אנוקסיה, התלוי בריכוז הגשש C ובמקדם הדיפוזיה שלו D. מוצגות תמונות של נתונים גולמיים טיפוסיים ממספר ניסויי דימות ESR תלת-ממדיים שבוצעו על ציאנובקטריה. תמונות אלו נרכשו עם ערכי tau שונים, בתנאי חושך או תנאי תאורה.
בתנאי חושך, התוצאות דומות מאוד למעט ירידה בעוצמה עבור ערכי T גבוהים יותר עקב זמן רגיעת הספין, T2. לעומת זאת, תחת הקרנת אור, תבנית התמונה משתנה עקב זמני רגיעה שונים לאורך הדגימה. נתונים אלו מעובדים לאחר מכן כדי להפיק תמונת אמפליטודה מתמונה זו.
ניכר כי הסיאנובקטריה ממוקמת בעיקר בצדו הימני של מחזיק הדגימה. שתי התמונות מומרות לערכי ריכוז חמצן באמצעות עקומת כיול קיימת המקשרת בין ריכוז החמצן לזמן הרפיה. התוצאות מוצגות עבור סיאנובקטריה בנוכחות ובהיעדר אור.
ברור כי ייצור חמצן מתחיל עם חשיפה לאור וגורם לעלייה משמעותית בריכוז החמצן בתמיסה. דבר זה מוביל לירידה ברדיקל T two, בעיקר בווקסלים הסמוכים לסיבי נייר הספיגה עם הציאנובקטריה. הרגשנו להראות לכם כיצד להכין דגימה המכילה תאים חיים עם רדיקל חופשי יציב למיפוי ריכוז חמצן באמצעות מיקרוסקופיית E ES R. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לשמור אותו קצר ככל האפשר כדי להבטיח את עקביות ה-S ולמנוע דהגרדציה של הדגימה.
זהו זה. תודה שצפיתם בנו, ובהצלחה בניסוי שלכם.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה לדימות תלת-ממדי בקנה מידה של מיקרון של ריכוז חמצן בסביבה המיידית של תאים חיים באמצעות מיקרוסקופיית תהודה ספין אלקטרונית. הטכניקה מודגמת על ציאנובקטריות, שהן תאים פוטוסינתטיים נפוצים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביופיזיקה
- ביולוגיה של התא
רקע
- מיקרוסקופיה של תהודה ספין אלקטרונית (ESR) היא טכניקה עוצמתית לחקר הסביבה של מולקולות פאראמגנטיות.
- היא מאפשרת מדידה של ריכוזי חמצן ושל מיני חמצן רב-פעילים בתאים חיים.
- טכניקות דימות ESR קודמות היו מוגבלות לדגימות גדולות יותר בקנה מידה של מילימטרים.
- מחקר זה מתמקד בהשגת דימות ברזולוציה גבוהה בקנה מידה של מיקרונים.
מטרת המחקר
- לרכישת תמונות תלת-ממדיות של ריכוזי חמצן סביב תאים חיים.
- להדגמת היישום של מיקרוסקופיית ESR עלB cyanobacteria.
- לניתוח השפעות האור על ייצור חמצן ומפל חמצן ב-cyanobacteria.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של תאי ציאנובקטריה המשובצים בתמיסת רדיקלים אורגניים יציבה.
- שימוש במיקרוסקופיית ESR לרכישת תמונות תלת-ממדיות תחת תנאים חיצוניים משתנים.
- עיבוד נתונים גולמיים לחילוץ זמני הרפיה של הרדיקלים ברזולוציה מרחבית.
- כיול להקשרת זמני הרפיה לריכוז חמצן, ליצירת מפות חמצן תלת-ממדיות.
תוצאות עיקריות
- הוכחה של היעדר ייצור חמצן על ידי ציאנובקטריות בהיעדרה של אור.
- נצפו מדרגי חמצן משמעותיים והטרוגניות תחת הקרנת אור.
- השגתן תמונות ESR ברזולוציה גבוהה עם רזולוציה בקנה מידה של מיקרון.
- מיפוי מוצלח של ריכוזי חמצן בסמיכות לתאים חיים.
מסקנות
- מיקרוסקופיית ESR היא שיטה יעילה לחקר דינמיקת החמצן בתאים חיים.
- הטכניקה מספקת תובנות בעלות ערך לגבי פעילות מטבולית ואינטראקציות סביבתיות.
- יישומים נוספים עשויים לשפר את ההבנה של נשימה תאית ופוטוסינתזה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיקרו-דימויי ESR בקנה מידה של מיקרון מאפשרים מיפוי חמצן תלת-ממדי מדויק בסביבות של תאים חיים, המספק מידע ישיר למחקרי תפקוד מטבולי ומטוכונדריאלי. יכולת זו נותנת מענה לפער קריטי בכימות חמצן בעל רזולוציה מרחבית, ובכך תומכת בביטחון חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים ובצמצום סיכונים מכניסטיים עבור מו"פ בביופארמה. הרגישות הגבוהה והרזולוציה המרחבית של השיטה מקלות על תיקוף יעדים חסון ועל רציפות תרגומית לאורך צינורות הגילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של צריכת חמצן תאית ושל פעילות מטבולית ברזולוציה של מיקרון.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי כימות מדרגי חמצן והטרוגניות בקרבת תאים חיים.
- מספק תיקוף פונקציונלי של מטרות מטבוליות באמצעות מיפוי חמצן ברזולוציה מרחבית.
- מגביר את הביטחון החזוי בניתוח מסלולים ובבחירת מטרות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לבדיקות מטבוליות ובדיקות הקשורות להיפוקסיה בשלבים הבאים.
- מספק פלטים כמותיים וניתנים לשחזור של ריכוזי חמצן לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקות.
- מאפשר סריקה ברזולוציה גבוהה של השפעות תרכובות על דינמיקת החמצן התאית.
- תומך ביכולת הרחבה של הפלטפורמה ובשימוש חוזר עבור סוגי תאים ותנאים מגוונים.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- מתאם את מיפוי החמצן עם סמנים מטבוליים רלוונטיים למחלה במודלים פרה-קליניים.
- מבטיח רצף משלב הפרופיל המטבולי של שלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני.
- מפחית סיכונים בקבלת החלטות על קידום המחקר באמצעות אספקת קריאות מטבוליות ברזולוציה מרחבית.
- תומך במחקר תרגומי בנושאי היפוקסיה, תפקוד מיטוכונדריאלי לקוי ומחלות מטבוליות.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
מיקרו-דימות ב-ESR משלב שלבים החל מגילוי מוקדם דרך זיהוי מובילים (lead identification) ועד למחקר פרה-קליני, ומספק פלטפורמה רב-פעמית למחקרים של מטבוליזם וחמצון.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים באמצעות כימות ישיר של חמצן.
- סריקה (Screening): מספקת קריאות חמצן כמותיות הניתנות לשחזור לצורך הערכת תרכובים.
- אנליטיקה: מספקת מדידות של זמן הרפיה וריכוז חמצן ברזולוציה מרחבית להשוואה רהוטה של נתונים.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלבי הגילוי לשלבים פרה-קליניים באמצעות מיפוי חמצן הרלוונטי למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה יכולת ניתנת להרחבה ולהתאמה עבור תוכניות מו"פ מגוונות המתמקדות במטבוליזם ובהיפוקסיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות מטבוליות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של תהליכי עבודה למדידת חמצן עם רמת הדירות ורגישות גבוהה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go ויעילות הון על ידי כך שהוא מאפשר הפחתת סיכונים מטבולית מוקדמת.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום תוכניות הקשורות למטבוליזם ולהיפוקסיה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בספקטרוסקופיית ESR והכנת דגימות של תאים חיים.
- דורש מכשור מיקרוסקופיית ESR ייעודי ותוכנה אנליטית לעיבוד נתונים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי כיול והדמיה.
- ניתן להתאמה לסוגי תאים ומערכות מודל שונות באמצעות בחירה מתאימה של הגשוש (probe).
- יש לצמצם ככל האפשר את משך זמן הכנת הדגימה וההדמיה כדי לשמור על השונות הביולוגית ועל שלמות הדגימה.
