Name: אלקטרונים ספין תהודה מיקרו הדמיה המינים Live עבור מיפוי חמצן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: למד מיקרוסקופיית תהודה ספין אלקטרונים לדימוי תלת-ממדי של ריכוזי חמצן סביב תאים חיים. השיטה מדגימה יצירת מפות חמצן ברזולוציית מיקרון בציאנובקטריה תחת תנאי אור וחושך.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה חלקית על ידי מענק לא. 213/09 של קרן המדע הישראלי, אין להעניק. 2005258 מקרן BSF, מענק לא. 201,665 מן המועצה האירופית למחקר (ERC), ועל ידי מכון ראסל ברי לננוטכנולוגיה בטכניון. אנו מכירים את עזרתו של פרופ &#39;נועם אדיר פארס סלאמה מהפקולטה Schulich לכימיה בטכניון לגבי אספקת וטיפול של כחוליות. העזרה והתמיכה של סבטלנה Yoffis מן היחידה Micro-Nano ייצור הטכניון הוא מאוד מוערך.

1. סקירה של שקיעת דם מיקרו הדמיה ראשית, אנו מספקים הסבר קצר על שקיעת דם, שקיעת דם מיקרוסקופית, ואת המרכיבים השונים של המערכת שלנו, ולאחר מכן נתאר את הניסויים הדמיה בפועל. תהודה אלקטרונים ספין היא טכניקה ספקטרוסקופיות שבהן קרינה אלקטרומגנטית בתדר מסוים נספג על ידי מולקולות עם ספינים של אלקטרונים מזווג, תחת שדה מגנטי סטטי חיצוני (איור 1). שקיעת דם מועסק באזורים רחבים של המדע, כגון כימיה, ביולוגיה, פיזיקה, מדע החומרים, לאיתור וזיהוי של רדיקלים חופשיים ומרכזי פאראמגנטיים. זוהי שיטה רבת עוצמה לחקר הסביבה של מולקולות פאראמגנטיים במינים חיים ומספק מידע על חומציות (pH), צמיגות, חמצן, תגובתי מינים חמצן בריכוז 3. לקבלת דוגמיות הטרוגנית, שקיעת דם מידע ספקטרלי ניתן לקבל באופן מוחלט מרחבית (כלומר, על ידי קבלת תמונה), באמצעות מעברים הדרגתיים השדה המגנטי 4. זה דומה מאוד לשיטה נפוצה יותר של הדמיה באמצעות תהודה מגנטית (MRI) כי בעיקר מציין ספינים פרוטון. עד כה, כגון שקיעת דם טכניקות הדמיה יושמו עבור דגימות לחיות עם גודל גדול יחסית של כמה סנטימטרים וגם ברזולוציה מ"מ בקנה מידה. (לדוגמה ראה איור 2, שנלקחו הפניה 5.) ההתפתחות האחרונה יחסית שקיעת דם הדמיה היא הרחבה של יכולותיו מהתבוננות חיות קטנות ברזולוציה של מילימטר בהיקף של מדידות של דגימות מילימטר ותת בגודל מילימטר עם בקנה מידה מיקרון החלטה. תחום זה נקרא מיקרוסקופיה שקיעת דם, אשר היום יכול לספק תמונות שקיעת דם 3D עם רזולוציה מתקרב 1 מיקרון 2 (ראה דוגמאות נציג איור 3). מיקרוסקופ ESR הוא דומה במהותו ספקטרומטר שקיעת דם רגילה. יש לו מגנט ליצירת שדה סטטי, מערכת מיקרוגל עבור עירור ספין זיהוי אות, בדיקה לקיום המדגם, מסוף ממוחשב לשלוט בתהליך הרכישה וטיפול נתונים. רכיבים אחרים הדמיה ייחודית שקיעת דם בכלל קיים גם שקיעת דם microcopy הם מגנטיים שיפוע בתחום מקורות, שהם חלק ממערכת אלקטרונית, סלילי צבע הנמצאים לחקור את ההדמיה. פרטים נוספים על מערכת ספציפית שלנו מוצגים בסרט הפרוטוקול המתואר התייחסות 2. 2. שקיעת דם מיקרו הדמיה לדוגמא הכנה בשלב זה מתאר את שיטת הכנת המדגם לניסוי שקיעת דם מיקרו הדמיה. בסוף שלב זה התאים ממוקמים בתחתית מיוחד שהוכן שקיעת דם מיכל זכוכית מיקרוסקופ מדגם יחד עם פתרון trityl 6 הרדיקלי למאגר. פרוטוקול זה מתאר את המדידה של תאים כחוליות ולכן, עבור סוגים אחרים של תאים, התאמות הנכון עשוי להיות נחוץ בשלב הכנת המדגם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, כמה ריבועים של נייר סופג עם גודל של 400 ~ 400 מיקרומטר נלקחים ונוסף צינור Eppendorf אשר מלא לאחר מכן עם 1.2 מ"ל של ההשעיה כחוליות (בריכוז של 40 מ"ג / מ"ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההשעיה היא centrifuged 2 דקות ב 6000 סל"ד ב microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות זאת, למאגר supernatant נמחק לחלוטין למעט μL 50 ~ אשר עזבו כדי למנוע התייבשות כחוליות. כתוצאה מתהליך זה, הנייר סופג רווי עכשיו על ידי התאים כחוליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פינצטה בסדר, סיבים כמה המחולצים הנייר והניח בתחתית כוס דמוי בעל שהוכנו במיוחד זכוכית מדגם 7. לאחר מכן 3 מ"מ של trityl בפתרון-11 BG 8, 9 (ראה Scheme 1) הוא הוסיף לבעל המדגם על ידי סיוע של מזרק בסדר. בעל הוא חתום מכן באמצעות דבק לריפוי UV, משאיר משקע קטן אוויר פתוח. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> במלאי 4 </td><td> במלאי 3 </td><td> במלאי 2 </td><td> במלאי 1 </td></tr><tr><td> H 3 BO 3 2.86g/liter </td><td> K 2 HPO 4: 3H 2 O 4.0g/liter </td><td> MgSO 4: 7H 2 O 7.5g/liter </td><td> Na 2 מ"ג EDTA 0.1g/liter </td></tr><tr><td> MnCl 2: 4H 2 O 1.81g/liter </td><td></td><td></td><td> אמוניום ציטרט Ferric 0.6g/liter </td></tr><tr><td> ZnSO 4: 7H 2 O 0.222g/liter </td><td></td><td></td><td> חומצה ציטרית: 1H2O 0.6g/liter </td></tr><tr><td> CuSO 4: 5H 2 O 0.079g/liter </td><td></td><td></td><td> CaCl 2: 2H 2 O 3.6g/liter </td></tr><tr><td> COCl 2 : 6 שעות 2 O 0.050g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaMoO 4: 2H 2 O 0.391g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Scheme 1. הכנת בינוני 11 BG. </li></ol> 3. שקיעת דם מיקרו הדמיה ניסויים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל את הניסוי הדמיה, להפעיל את המערכת שקיעת דם מיקרו הדמיה להכניס את הדגימה לתוך מהוד שהולך בתוך החללית הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כעת, באמצעות תוכנת שליטה במחשב, להגדיר את המערכת על מצב "כוון" ולמצוא את המיקרוגל תהודה בתדירות של החללית, אשר ישמשו למדידת שקיעת דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, הגדר את שדה מגנטי סטטי על ערך התואם את תדר המיקרוגל מיושם, להגדיר את הפרמטרים תזמון רצף הדופק ולבחון את האות שקיעת דם על מנת לוודא כי המערכת פונקציות היטב המדגם הוא מוכן היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז, להגדיר את הפרמטרים הדמיה, כגון מספר של פיקסלים, כוחו של מילויים, ואת אורכו של פולסים שיפוע לערכים הנדרשים שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההתקנה, לאסוף שלוש תמונות 3D שקיעת דם על ידי רצף הד האן הדופק הדמיה (איור 4) עם הפרדה interpulse, ערכי  500, 600, ו 700 ns. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אור מוקרן על המדגם הוא מופעל או כבוי בהתאם לתנאי הניסוי הנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הרכישה, הנתונים נשמרים באופן אוטומטי. ותיזות קבצי נתונים גולמיים מעובדים אז דרך סקריפט תוכנות Matlab לספק תמונות של ריכוז קיצוני trityl וזמן רגיעה T 2 המפה, אשר תורגמו תמונה חמצן בריכוז באמצעות כיול קיימים. </li></ol> 4. נציג תוצאות התוצאות של הניסוי הם מספר תלת מימדי שקיעת דם מיקרו תמונות נרשם ערכים שונים τ. תמונות אופייניות נתונים גולמיים ניתנים באיור 5. העליון שלוש תמונות, נמדד בתנאים כהה, דומים מאוד, למעט הפחתה בעוצמת האות. מצד שני, דפוס תמונה השינויים תחת קרינה אור בשל פעמים הרפיה שונים בחלקים שונים של המדגם. מידע זה יכול להיות מעובד 1 להשיג תמונה משרעת, כפי שמוצג באיור 6 וגם תמונות של זמן הרפיה, T 2 (איור 7). T 2 תמונות מתורגמים ריכוז חמצן ערכים באמצעות עקומת קיימים כיול המקשר את ריכוז החמצן בזמן הרפיה באמצעות המשוואה: <img src="/files/ftp_upload/2122/2122eq.jpg" alt="משוואה 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="משוואה 1"> הנה, T 2 0 הוא הזמן ספין ספין הרפיה של החללית בתנאים anoxic (תלוי בריכוז של בדיקה, C, מקדם הדיפוזיה שלה, D), ו-k הוא קבוע המידתיות. ברוב המקרים, מקדם הדיפוזיה אינו משתנה הרבה דוגמאות לחיות (אם כי, במידת הצורך, הוא יכול עקרונית להיות מוערך באופן ישיר גם על ידי 6 שקיעת דם, 10), ריכוז ספין מתקבל במהלך תהליך ההדמיה. לכן, יחס זה יכול לשמש כדי למדוד ישירות ריכוז החמצן. נחזור איור 6, ברור מהתמונה משרעת כי תאי כחוליות היו ממוקמים בעיקר בצד ימין של בעל המדגם. יתר על כן, מבוסס על איור 7, ברור כי לאור יוזם את הייצור של O 2 ו - גורם לעלייה משמעותית בריכוז O 2 של פתרון, בעיקר voxels ליד כחוליות. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1: רמות אנרגיה בתהודה ספין האלקטרון. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2: חמצן בריכוז תמונה אופיינית של עכבר נושאת גידול. התמונה משמאל מראה את המידע האנטומי, המבוסס על תמונה MRI. יציבה חינם אורגני רדיקלי היה מוזרק אל העכבר ומאפיינים שקיעת דם שלה לספק את ריכוז החמצן בכל סביבתו (מימין). שקיעת דם מבוסס התוצאות על גבי תמונת ה-MRI האנטומית. שדה הראייה הוא 32 מ"מ. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3: שתי דוגמאות של ES גבוה מיקרו בקנה מידה ברזולוציהR תמונות של מדגם photolithographically שנוצר עם אבקת N C 60 @ (משמאל) גבישים פאראמגנטיים LiPc (מימין) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4: אופיינית האן הדמיה רצף הדופק מראה את מיקרוגל (MW) ואת שיפוע, G x, y G ו-G z פולסים. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5: אופיינית גלם נתונים שקיעת דם מיקרו תמונות: a, b, ו-c הם נתונים גולמיים של המדגם cyanobacterium עם תאורה לא קלה נמדד τ = 500600700 ns, בהתאמה. פריטים D, E, ו - זהים a, b, ו-c, אבל עם תאורה אור. עוצמה היא להתוות סולם שרירותי (אך עולה בקנה אחד בתוך כל קבוצה של שלוש תמונות הגלם נתונים כהה או בהיר) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig6.jpg" alt="איור 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 6"> איור 6: תמונה Amplitude המתאים ריכוז קיצוני הפתרון (בקנה מידה שרירותי). <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig7.jpg" alt="איור 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 7"> איור 7: T 2 תמונות המקביל [O 2] ערכי תחת (מימין) בתנאי חושך (משמאל) אור.

<ol><li>Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-imaging+of+Oxygen+Concentration+near+Live+Photosynthetic+Cells+by+Electron+Spin+Resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance.</a> Biophysical Journal. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESR+imaging+in+solid+phase+down+to+sub-micron+resolution%3A+methodology+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications.</a> J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).</li>
<li>Gallez, B., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+EPR%3A+when%2C+how+and+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">In vivo EPR: when, how and why?</a> NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).</li>
<li>Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEaton%2C+GR+%22EPR+imaging+and+in+vivo+EPR%22">EPR imaging and in vivo EPR</a>. , CRC Press. Boca Raton. (1991).</li>
<li>Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+imaging+of+tumor+oxygenation+and+microvascular+permeability+using+Overhauser+enhanced+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).</li>
<li>Talmon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Diffusion+in+Porous+Media+by+PGSE%5BTitle%5D)+AND+%22ESR.+J+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular Diffusion in Porous Media by PGSE.</a> ESR. J Phys Chem. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Halevy, R., Talmon, Y., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolithographic+production+of+glass+sample+holders+for+improved+sensitivity+and+resolution+in+ESR+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">Photolithographic production of glass sample holders for improved sensitivity and resolution in ESR microscopy.</a> Applied Magnetic Resonance. 31, 591-598 (2007).</li>
<li>Allen, M. M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+Division+of+Some+Unicellular+Blue-Green+Algae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growth and Division of Some Unicellular Blue-Green Algae.</a> J Gen Microbiol. 51, 199-199 (1968).</li>
<li>Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generic+Assignments%2C+Strain+Histories+and+Properties+of+Pure+Cultures+of+Cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria.</a> J Gen Microbiol. 111, 1-61 (1979).</li>
<li>Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+diffusion+in+liquid+phase+by+electron+spin+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance.</a> Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול זה מראה כיצד שקיעת דם מיקרו הדמיה יכול להיות מיושם על המפה ריכוז החמצן ליד דגימות קטנות לחיות. ברזולוציה מרחבית של ~ 30 x 30 x 100 מיקרומטר הוא הוכיח, עם רגישות הקרוב מיקרו ריכוז החמצן ותת רגישות femtomole חמצן מוחלט לכל voxel. השימוש שקיעת דם מיקרו הדמיה למיפוי החמצן ליד התאים משלים את הטכניקות הקיימות כיום מבוססות על מיקרו אלקטרודות או פלואורסצנטי / זרחני. יתר על כן, עם החללית פאראמגנטיים נכונה, זה יהיה ישים בקלות עבור תאיים חמצן מיקרו הדמיה, יכולת אשר שיטות אחרות למצוא קשה מאוד להשיג. בעתיד הקרוב אנו מתכננים להמשיך ולשפר את המתודולוגיה לספק תמונות מדגם לחיות עם רזולוציה של מיקרונים אחדים, מתן פרמטרים כגון ניגודיות ריכוז תחמוצת סופר, חומציות (pH), מקדם בדיקה דיפוזיה, כמובן, ריכוז החמצן. יכולות אלה משלימים האופטי מבוסס מתודולוגיות הנוכחי הן מבחינת סוג בניגוד וגם דוגמאות של מאפיינים (למשל, לא שקוף דגימות עבה, במקרים מסוימים, מדידות תאיים לעומת תאיים).

<table><tbody><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Kendro</td><td>Heraus, 75003235</td><td></td></tr><tr><td>רדיקל טריארילמתיל (טריטיל) פר-דאוטרי</td><td>Novosibirsk</td><td></td><td>סונטז ב-Novosibirsk באמצעות השיטה המתוארת במקור &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>בופר BG-11</td><td></td><td></td><td>להוראות ההכנה, ראו את תרשים 1 ואת מקורות 8, 9.</td></tr><tr><td>מזרק</td><td>Hamilton Co</td><td>Microliter 7000.5</td><td></td></tr><tr><td>הקשיה באור על-סגול</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>NOA63, או NOA61.</td><td></td></tr></tbody></table>

אלקטרונים ספין תהודה מיקרו הדמיה המינים live עבור מיפוי חמצן

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

פרוטוקול זה מתאר ספין האלקטרון תהודה (שקיעת דם) מיקרו הדמיה שיטת מיפוי תלת ממדי של רמות החמצן בסביבה המיידית של תאים חיים עם מיקרון בקנה מידה ברזולוציה 1. החמצן הוא אחד מולקולות החשובות ביותר במחזור החיים. היא משמשת acceptor מסוף אלקטרונים של זרחון חמצוני במיטוכונדריה והוא משמש בייצור של מינים חמצן תגובתי. מדידות של חמצן חשובה לחקר פונקציות המיטוכונדריה ואת חילוף החומרים, מסלולי איתות, ההשפעות של גירויים שונים, חדירות הממברנה, והבחנה המחלה. צריכת חמצן ולכן הוא סמן אינפורמטיבי של חילוף החומרים הסלולר, אשר החלים רחב במערכות ביולוגיות שונות המיטוכונדריה לתאים לאורגניזמים כולו. בשל חשיבותו, שיטות רבות פותחו עבור מדידות של חמצן במערכות חיים. ניסיונות נוכחי לספק ברזולוציה גבוהה הדמיה חמצן מתבססים בעיקר על הקרינה אופטיים ושיטות זרחני כי אינם מצליחים לספק תוצאות משביעות רצון כפי שהם מעסיקים בדיקות רעילות עם תמונה גבוהה ורגישות חמצן נמוכה. שקיעת דם, אשר מודד את האות בדיקות פאראמגנטיים אקסוגניים במדגם, ידוע לספק מדידות מדויקות מאוד של ריכוז החמצן. במקרה טיפוסי, מדידות שקיעת דם המפה הרחבת lineshape של בדיקה ו / או רגיעה בזמן קיצור כי הם קשורים ישירות לריכוז חמצן המקומית. (החמצן הוא פאראמגנטיים, לכן כאשר מתנגשות עם החללית פאראמגנטיים אקסוגניים, זה קוצר פעמים הרפיה שלה.) באופן מסורתי, אלו סוגים של ניסויים מתבצעות עם רזולוציה נמוכה, מילימטר בקנה מידה שקיעת דם הדמיה חיות קטנות. כאן אנו מראים כיצד שקיעת דם הדמיה יכולה גם להתבצע בהיקף מיקרון עבור הבדיקה של דגימות חי קטן. שקיעת דם מיקרו הדמיה היא מתודולוגיה חדשה יחסית המאפשרת רכישה של אותות שקיעת דם מרחבית נפתרה עם רזולוציה מתקרב 1 מיקרון בטמפרטורת החדר 2. המטרה העיקרית של נייר פרוטוקול זה היא להראות כיצד השיטה החדשה, יחד עם חמצן רגיש בדיקות החדש שפותח, יכול להיות מיושם על מיפוי של רמות חמצן בדגימות לחיות קטנות. ברזולוציה מרחבית של ~ 30 x 30 x 100 מיקרומטר הוא הוכיח, עם רגישות הקרוב מיקרו ריכוז החמצן ותת רגישות femtomole חמצן מוחלט לכל voxel. השימוש שקיעת דם מיקרו הדמיה למיפוי החמצן ליד התאים משלים את הטכניקות הקיימות כיום מבוססות על מיקרו אלקטרודות או פלואורסצנטי / זרחני. יתר על כן, עם החללית פאראמגנטיים נכונה, זה יהיה גם ישים בקלות עבור תאיים חמצן מיקרו הדמיה, יכולת אשר שיטות אחרות למצוא קשה מאוד להשיג.

פרוטוקול זה מתאר שיטה הדמיה תלת ממדי מיקרון בקנה מידה של ריכוז החמצן בסביבה המיידית של תאים חיים במיקרוסקופ על ידי ספין האלקטרון תהודה.

אלקטרונים ספין תהודה מיקרו הדמיה המינים Live עבור מיפוי חמצן

פרוטוקול זה מתאר שיטת מיקרו-דימוי של תהודה ספין-אלקטרון (ESR) למיפוי תלת-ממדי של רמות חמצן בסביבה המיידית...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להשיג תמונות תלת-ממדיות בקנה מידה מיקרוני של ריכוז החמצן בסביבה המיידית של תאים חיים באמצעות תהודה של ספין אלקטרוני או מיקרוסקופיית ESR. הפרוטוקול יודגם על צייאנובקטריות, שהם תאים פוטוסינתטיים נפוצים. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת דגימה של תאי צייאנובקטריות בתוך מחזיק הדגימות של מיקרוסקופיית ה-ESR.מוטמע בתוך תמיסת רדיקלים אורגניים יציבה. מחזיק הדגימה ממוקם בתוך גשושית הדימות, שנכנסת לאלקטרומגנט הסטטי של מערכת מיקרוסקופ ה-ESR. כעת, מיקרוסקופ ה-ESR מקבל מספר תמונות ESR מיקרוסקופיות תלת-ממדיות של תמיסת הרדיקלים האורגניים.פעולה זו מבוצעת עבור מספר וריאנטים של רצפי פולסים ולעיתים קרובות תחת תנאים חיצוניים שונים, כגון תנאי אור וחושך. לאחר מכן, תמונות הנתונים הגולמיים מעובדות על ידי המחשב כדי להפיק את זמני הרילקסציה של הרדיקל ברזולוציה מרחבית תלת-ממדית. זמני רילקסציה אלה מספקים מדד ישיר לריכוז החמצן באמצעות כיול קודם, מה שמוביל למפות חמצן תלת-ממדיות מלאות של הדגימות שנמדדו תחת תנאים חיצוניים שונים.התוצאות המתקבלות מראות בבירור את היעדר ייצור החמצן על ידי הציאנובקטריה כאשר לא מופעל אור. יתרה מכך, הוכח כי תחת הקרנת אור, נוצרים גרדיאנט חמצן משמעותי והטרוגניות של חמצן בקרבת תאי הציאנובקטריה. שלום, אני al מהמעבדה של BLA בפקולטה לכימיה בטכניון, המכון התכנולוגי של ישראל בחיפה.היום נדגים לכם פרוצדורה למיפוי ריכוזי חמצן בסביבת תאים חיים באופן תלת-ממדי וברזולוציה מרחבית גבוהה, באמצעות מיקרוסקופיית זרוע חזקה. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדתנו כדי לחקור את קצב צריכת החמצן ואת הפעילות המטבולית של תאים. אז בואו נתחיל.תהודה ספין אלקטרונית, או ESR, היא טכניקה ספקטרוסקופית שבה קרינה אלקטרומגנטית בתדר ספציפי נספגת על ידי מינים פאראמגנטיים בעלי ספין אלקטרוני לא מזווג המונחים תחת שדה מגנטי סטטי חיצוני. זוהי שיטה עוצמתית לחקר הסביבה של מולקולות פאראמגנטיות באורגניזמים חיים, כולל ריכוזים של חמצן ומיני חמצן ריאקטיביים. כאן מוצגת תמונת ריכוז חמצן טיפוסית של עכבר עם גידול עבור דגימות הטרוגניות.ניתן להשיג מידע ספקטרלי של ESR באופן בעל רזולוציה מרחבית באמצעות שימוש במדרגי שדה מגנטי. רדיקל אורגני חופשי ויציב הוזרק לעכבר, ומאפייני ה-ESR שלו מספקים את ריכוז החמצן בסביבתו. התוצאות המבוססות על ESR מוטלות על גבי תמונת MRI אנטומית.עד כה, טכניקות דימות ESR אלו של דגימות חיות בוצעו רק עם דגימות גדולות יחסית בסדר גודל של מילימטרים. מיקרוסקופיית ESR ברזולוציה גבוהה כוללת מדידות של דגימות בגודל מילימטרי ותת-מילימטרי, ומספקת תמונות ESR תלת-ממדיות עם רזולוציה המתקרבת למיקרון אחד.להלן שתי דוגמאות של דימות ESR ברזולוציה גבוהה ובקנה מידה של מיקרון, של דגימה שהוכנה עם אבקת NNC 60 וגבישים פאראמגנטיים של lithium fellow cyanide. מיקרוסקופ ESR דומה לספקטרומטר ESR קונבנציונלי, והוא כולל מגנט ליצירת השדה הסטטי, מערכת מיקרוגלים לעירור ספין ולגילוי אותות, גשש להחזקת הדגימה וקונסולה ממוחשבת לשליטה בתהליך הרכישה ובטיפול בנתונים. רכיבים נוספים של המערכת כוללים מאיצי גרדיאנט של השדה המגנטי, המהווים חלק מהמערכת האלקטרונית, וסלילי גרדיאנט הממוקמים בגשש הדימות.לסלילי הגרדיאנט יש גם מפתח המאפשר הקרנת אור על הדגימה. אוויר לח בטמפרטורה מבוקרת מופעל על הדגימה כדי להבטיח התייבשות מינימלית במהלך הניסוי. המאפיינים הייחודיים העיקריים של מיקרוסקופיית ESR הם הגודל הקטן של הגשש ושל סלילי הגרדיאנט, רגישות הספין הגבוהה יותר של המערכת ועוצמתם הגבוהה של מניעי גרדיאנט השדה המגנטי. לפני תחילת הליך זה, הכין תרחיף ציאנובקטריה בריכוז של 40 mg/mL.כדי להתחיל את הכנת הדגימה לדימות מיקרוסקופי ב-ESR, קחו מספר ריבועי נייר סופג בגודל של כ-400 על 400 מיקרון בעזרת פינצטה עדינה. לאחר מכן, הכניסו אותם לשפופרת אינור (einor tube). לאחר מכן, מלאו את השפופרת ב-1.2 milliliters של תרחיף ציאנובקטריות.לאחר מכן, סבב את התרחף במשך שתי דקות ב-6,000 RPM במיקרו-צנטריפוגה. לאחר הסבב, הסר לחלוטין את העליון למעט כ-50 µL, שנותרים כדי למנוע התייבשות של הציאנובקטריה. תהליך זה מוביל לרוויה של נייר הספיגה בתאי הציאנובקטריה. בשלב הבא, הכן מחזיק דגימות מזכוכית בצורת כוס המיועדת לכך, השבב מספר סיבים מהנייר באמצעות פינצטה עדינה, והנח אותם בתחתית מחזיק הדגימות.לאחר מכן, הוסיפו שלושה millimolar של תמיסת tridel ו-BG 11, שהוכנה כמתואר בפרוטוקול הכתוב, באמצעות מזרק של שמינית. לאחר מכן, אטמו את מחזיק הדגימה באמצעות דבק המתקשה ב-UV על ידי מריחת הדבק בין קצוות מחזיק הדגימה מזכוכית לבין זכוכית הכיסוי התואמת לו, תוך השארת פתח אוויר קטן פתוח. לבסוף, הקשו את הדבק באמצעות אור UV למשך שתי שניות.כדי להתחיל את ניסוי הדימוי, הפעילו את מערכת הדימוי ב-ESR והכניסו את הדגימה לתוך הרזונטור הנמצא בתוך גשש הדימוי. כעת, באמצעות תוכנת הבקרה במחשב, העבירו את המערכת למצב כוונון (tune mode) ומצאו את תדר המיקרוגל של התהודה עבור הגשש, אשר ישמש למדידות ה-ESR. לאחר מכן, הגדירו את השדה המגנטי הסטטי לערך התואם לתדר המיקרוגל המופעל.הגדירו את פרמטרי העיתוי עבור רצף הפולסים וצפו באות ה-ESR כדי לוודא שהמערכת פועלת כראוי ושהדגימה הוכנה היטב. לאחר מכן, הגדירו את פרמטרי ההדמיה, כגון מספר הפיקסלים, עוצמת הגראדיינטים ואורך פולסי הגראדיינט, לערכים הנדרשים. לאחר ההגדרה, אספו שלוש תמונות ESR בתלת-ממד באמצעות רצף פולסים של Han Echo Imaging עם ערכי הפרדה בין-פולסית (tau) של 500, 600 ו-700 ננו-שניות.בשלב זה, הדליקו את הקרנת האור על הדגימה אם הדבר נדרש עבור התנאים הניסיוניים לאורך הרכישה; הנתונים נשמרים באופן אוטומטי. לאחר תהליך רכישת הנתונים, עיבדו את קובצי הנתונים הגולמיים באמצעות סקריפט של תוכנת MATLAB. השתמשו בתוכנה כדי להפיק תמונות של ריכוז הרדיקל הטריל ושל זמן ההרפיה.מפת T2 מתורגמת לאחר מכן לתמונה של ריכוז חמצן באמצעות עקומת כיול קיימת, המקשרת בין ריכוז החמצן לבין זמן הרפיה. כאן, T2 zero הוא זמן רפיית הספין-ספין של הגשש בתנאי אנוקסיה, התלוי בריכוז הגשש C ובמקדם הדיפוזיה שלו D. מוצגות תמונות של נתונים גולמיים טיפוסיים ממספר ניסויי דימות ESR תלת-ממדיים שבוצעו על ציאנובקטריה. תמונות אלו נרכשו עם ערכי tau שונים, בתנאי חושך או תנאי תאורה.בתנאי חושך, התוצאות דומות מאוד למעט ירידה בעוצמה עבור ערכי T גבוהים יותר עקב זמן רגיעת הספין, T2. לעומת זאת, תחת הקרנת אור, תבנית התמונה משתנה עקב זמני רגיעה שונים לאורך הדגימה. נתונים אלו מעובדים לאחר מכן כדי להפיק תמונת אמפליטודה מתמונה זו.ניכר כי הסיאנובקטריה ממוקמת בעיקר בצדו הימני של מחזיק הדגימה. שתי התמונות מומרות לערכי ריכוז חמצן באמצעות עקומת כיול קיימת המקשרת בין ריכוז החמצן לזמן הרפיה. התוצאות מוצגות עבור סיאנובקטריה בנוכחות ובהיעדר אור.ברור כי ייצור חמצן מתחיל עם חשיפה לאור וגורם לעלייה משמעותית בריכוז החמצן בתמיסה. דבר זה מוביל לירידה ברדיקל T two, בעיקר בווקסלים הסמוכים לסיבי נייר הספיגה עם הציאנובקטריה. הרגשנו להראות לכם כיצד להכין דגימה המכילה תאים חיים עם רדיקל חופשי יציב למיפוי ריכוז חמצן באמצעות מיקרוסקופיית E ES R. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לשמור אותו קצר ככל האפשר כדי להבטיח את עקביות ה-S ולמנוע דהגרדציה של הדגימה.זהו זה. תודה שצפיתם בנו, ובהצלחה בניסוי שלכם.

electron-spin-resonance-micro-imaging-live-species-for-oxygen

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

טכניקה זו מאפשרת את השימוש זווית ברזולוציה גבוהה קסם ספינינג פרוטון MR ספקטרוסקופיה (HRMAS 1H-MRS) לאפיון מולקולרי של...

ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית של חיים תסיסנית melanogaster באמצעות ספינינג זווית הקסם

פאראמגנטיים אלקטרונים תהודה (EPR) ספקטרוסקופיה הועסק לזהות תחמוצת החנקן מתאי אנדותל העורקים שור ו אניון קיצוני superoxide של נויטרופילים האדם באמצעות ברזל (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe...

זיהוי של תחמוצת החנקן אניון קיצוני superoxide ידי ספקטרוסקופיה פאראמגנטיים אלקטרונים תהודה בין תאים באמצעות מלכודות ספין

מיקרוסקופיה זמן לשגות של סמני autophagy כותרתו fluorescently מאפשרת ניטור של תגובת autophagy הדינמית עם רזולוציה גבוהה זמנית. שימוש autophagy ספציפית וסמני אברון בשילוב של 3 צבעים שונים, אנו יכולים לעקוב אחר תרומתו של חלבון להיווצרות autophagosome בהקשר מרחב ובזמן חזק.

לחיות תא הדמיה של אירועי autophagy מוקדמים: Omegasomes ומעבר

תהודה מגנטית אלקטרונית חדשה (EPR) שיטה, מהירה סריקה EPR (RS-EPR), מודגם הדמיה מרחבית רפאים 2D אשר עדיפה על גל מתמשך המסורתית (CW) טכניקה ופותח מקומות חדשים בתחום ההדמיה vivo. תוצאות הם הפגינו ב 250 MHz, אבל הטכניקה ישימה בתדירות כלשהי.

ראפיד סריקת אלקטרונים פאראמגנטיים תהודה פותחת אפיקים חדשים עבור פרמטרים חשובים מבחינת פיזיולוגית ההדמיה<em&gt; In vivo</em

אנו מתארים את השימוש של רומן, תדר-תחום מצלמה לאורך החיים עבור מיפוי 2D O2 הפצות עם משטח חיישן אופטי. מערכת המצלמה וניתוח התמונה הליכים מתוארים יחד עם ההכנה, כיול ויישום של כנפונים חיישן עבור המחשה O2 מיקרו הסביבה בריזוספירה של צמחים ימיים.

לומינסנציה הדמיה של החיים של O2 עם תדר-מערכת מבוססי התחום מצלמה

הפרוטוקול מתאר יצירת כדוריות בתפוקה גבוהה להדפסה ביולוגית באמצעות ניתוח רב-פרמטרי של החמצון שלהם ומוות התאים שלהם במיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי. ניתן ליישם גישה זו כדי לשלוט בכדאיות הספרואידים ולבצע סטנדרטיזציה, החשובה במידול רקמה תלת-ממדית, מיקרו-סביבה של הגידול וביו-פבריקציה מוצלחת (מיקרו)של רקמות.

מיקרופריקציה ביולוגית בסיוע מיקרוסקופיית חמצן במחיר סביר של ספרואידים רב-תאיים

מאמר זה מתאר את השימוש במצלמה אופטית חדשה ומהירה עבור הדמיה מקרוסקופית פוטולומינסנציה לכל החיים של דגימות פולטות דעיכה ארוכה. מתוארים תהליכי האינטגרציה, רכישת התמונה והניתוח, לצד הכנה ואפיון של חומרי החיישן להדמיה ויישום ההדמיה בחקר דגימות ביולוגיות.

Fluorescence Lifetime Macro Imager עבור יישומים ביו-רפואיים

אנו מציגים פרוטוקול להדמיה ישירה של פעילויות מטבוליות בתאים המווסתים על ידי חומצות אמינו באמצעות מיקרוסקופ פיזור ראמאן מגורה (DO-SRS) המשולב במיקרוסקופ פלואורסצנטי עירור של שני פוטונים (2PEF).

הדמיה כימית ביו-אורתוגונלית של מטבוליזם בתאים המווסתת על ידי חומצות אמינו ארומטיות

מפות חמצן תלת-ממדיות כמותיות של גידולי עכברים צולמו באופן לא פולשני באמצעות תהודה פרמגנטית של אלקטרון דופק. אולטרסאונד B-mode ו-Power Doppler שימשו לאנטומיה ולמבנה כלי הדם. תמונות משתי השיטות הונחו על גבי ניתוח גידול רב-פרמטרי.

הערכת היפוקסיה של גידול: הדמיית חמצן תלת מימדית in vivo באמצעות תהודה פרמגנטית אלקטרונית 

תוך שימוש בפלטפורמה רב-מודאלית המשלבת שיטות הדמיה אופטיות ללא תוויות, פיתחנו פרוטוקול להדמיה וכימות של דינמיקה תאית וחילוף חומרים. באמצעות הדמיה באמצעות פלואורסצנציה רב-פוטונית, דור הרמוני שני ומיקרוסקופ פיזור רמאן מגורה, אנו יכולים ליצור סקירה הוליסטית של הסביבה התאית והמולקולרית.

פלטפורמת הדמיה אופטית מולטי-מודאלית לחקר חילוף החומרים התאי

הצגנו טכניקת הדמיה חדשנית בשם Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT), המאפשרת הדמיה ללא הטיה של כל התאים בדגימות מוח בקנה מידה מדום וניתן לשלבה בצורה חלקה בזרימת הדמיה של מיקרוסקופ אלקטרונים סרטורי מבוסס סרט על אותה דגימה.

שיטת הדמיה אופטית התואמת למיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת למיפוי מוח תאי מזוסקופי

למד מיקרוסקופיית תהודה ספין אלקטרונים לדימוי תלת-ממדי של ריכוזי חמצן סביב תאים חיים. השיטה מדגימה יצירת מפות חמצן ברזולוציית מיקרון בציאנובקטריה תחת תנאי אור וחושך.

אלקטרונים ספין תהודה מיקרו הדמיה המינים Live עבור מיפוי חמצן

גלה סרטונים נוספים