ויזואליזציה של עצבים המגזרי הזחל ב 3 ^Rd Instar תסיסנית הכנות הזחל

ניתן לחקור הובלה אקסונית על ידי ויזואליזציה של העצבים הסגמנטליים של הזחלים. זבוב פירות (drosophila) בשלב גיל 3. ראשית מבצעים דיסקציה לזחל, תוך חשיפת מערכת העצבים המרכזית (CNS) ללא פגיעה באונות האופטיות, הגנגליון הוונטרלי והעצבים הסגמנטליים.

השלב השני של הפרוצדורה הוא קיבוע הלבה בפורמלידה לפני דגירה עם נוגדן ראשוני למשך לילה ועם נוגדן שני למשך שעה בחושך. לאחר מכן הלבה מורכבת על גשמיות זכוכית לבחינת פגמים בהובלה אקסונית. ניתן לבחון את מיקום החלבון ואת התפלגות החלבון באמצעות מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הובלה אקסונלית, ניתן ליישמה גם על מערכות אחרות כגון מורפולוגיה של סינפסות ושרירים. באופן כללי, אנשים שאינם מיומנים בשיטה זו יתקלו בקשיים, כיוון שבתחילה קשה לבצע את הדיסקציה המותרת, ובמיוחד לשמור על שלמות השרירים והעצבים הסגמנטליים של המוח. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו מקבע בופר לדיסקציה בריכוז 1x, PBT בריכוז 1x, ותמיסת 5% BSA.

כפי שפורט בטבלה המוצגת לפני הניתוח, רכשו זוג פינצטות מספר חמישה נקיות, זוג מספריים למעבדה בעלי להב ישר נקיים וסיכות כדי להתחיל בניתוח; השתמשו בכף מיקרו כדי לאסוף זחלי כוכב בשלב השלישי בעלי גנוטיפ ספציפי אל תוך צלחת פטרי. לאחר מכן, שטפו את הזחלים על ידי שטיפתם בצלחת פטרי מלאה במים דה-יוניים כדי להסיר את כל שאריות המזון.

שים כעת את הזחליל על צלחת הגארד (S guard dish) כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה. קרצם את הזחליל בקצותיו הקדמיים והאחוריים. טפטף טיפה אחת של תמיסת הדיסקציה החד-פעמית על הזחליל המקובע באמצעות מספריים עדינים.

צבטו את הלבה בקו האמצע הגביס קרוב לקצה האחורי. בעזרת המספריים, גזרו את הקוטיקולה של הלבה מהקצה האחורי ועד לקצה הקדמי. טפטפו טיפה אחת של dissection buffer בריכוז פי 1 על הלבה שבוצעה בה הניתוח.

באמצעות סיכה, הרים קצה לטראלי אחד של הקוטיקולה ליד מרכז הזחול ונעץ את הקוטיקולה באמצעות סיכה נוספת. את הקצה הלטראלי השני של הקוטיקולה, כך ששתי סיכות משמשות בכל צד לטראלי כפי שמוצג בדיאגרמה. כעת, הסר בזהירות את המעי, גופי השומן והטרכאה, והשאר רק את המוח עם שתי האונות האופטיות והגנגליונים הוונטרליים.

לאחר הצמדת העצבים הסגמנטליים, מבצעים קיבוע וצביעה בנוגדנים כאשר הזחלים מודבקים לכלי השמירה. דגרו את הזחלים המנוסחים ב-50 µL של חומר מקבע למשך 30 דקות. לאחר הקיבוע, החליפו את חומר הקיבוע בכל 15 דקות, ושטפו את הזחלים ב-PBT פעם אחת למשך 30 דקות.

בעת החלפת התמיסה המבחנת (buffer) מדי 10 דקות, חשוב לשים לב כי הזחלים חייבים להיות טבולים בתמיסה בכל עת. הכינו את תמיסת הנוגדן הראשוני על ידי דילולו לריכוז המתאים בתמיסת 5% BSA. הריכוזים האופטימליים משתנים בין נוגדנים שונים.

הכינו תא לחות על ידי ריפוד של צלחת פלסטיק בנייר סופג (Kimwipe) טבול במים. החליפו את הנייר פעם אחת ב-PBT.

שטוף עם תמיסת הנוגדן הראשוני שהוכנה והדגרה בתא לחות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך הלילה עד למחרת. שטוף את הזחלים שנותחו ב-1× PBT למשך 30 דקות, תוך החלפת הבאפר כל 10 דקות. הכן את הנוגדן המשני על ידי דילולו לריכוז המתאים בתמיסת 5% BSA.

עטפו את תא הלחות בנייר אלומיניום, כיוון שחלק מהנוגדנים המשניים רגישים לאור. דגרו את הזחליים עם תמיסת הנוגדן המשני בטמפרטורה של 25 °C למשך שעה. עם סיום הדגירה עם הנוגדן המשני, שטפו את הזחליים ב-1x PBT למשך 30 דקות, תוך החלפת הבאפר בכל 10 דקות, והמשיכו להרכבה ולמיקרוסקופיה של הזחליים המנוסחים לפני הרכבתם על השקף.

הכינו את השקף על ידי מריחת שני קווים אנכיים של לק במרכז, עם מרווח גדול מספיק להנחת זכוכית כיסוי כפי שמוצג בדיאגרמה. המתינו לייבוש מלא של הלק. הניחו טיפה של תמיסות קיבוע (mounting buffer) במרווח שבין קווי הלק האנכיים על השקף כפי שמוצג בתמונה זו.

הסרטה מוכנה כעת להכנה. הוצא את הזחלים לאחר שהזחל האחרון עבר PBT. שטוף והסר בעדינות את הסיכות הצדדיות מהזחל.

הקפידו שלא לקרוע את העטיפה (cuticle) בזהירות. הסירו את שני הסיכות שנותרו, אספו את הלבה באמצעות פינצטה והניחו אותה על השקף שהוכן. ודאו שהלבה אינה הפוכה ושהיא מונחת בצורה בטנית.

הנח בעדינות לוחית כיסוי מעל, כאשר הצד העליון פונה כלפי מעלה, ואטום את הקצוות בעזרת לק לציפורניים כפי שמוצג כאן. הזחלים מוכנים כעת לצפייה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תמונה מייצגת זו היא של זחל מסוג wild type שנצבע בנוגדנים נגד חלבון השקיקים הסינפטיים, cystine string protein.

העצבים הסגמנטליים של lava נצבעים באופן חלק. כאן, מוטנט של חלבון מוטורי lava נצבע באמצעות נוגדנים נגד CSP. העצבים הסגמנטליים מראים הצטברויות מאסיביות שנצבעות בבהירות עבור CSP.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לשמר את העצבים הסגמנטליים המחוברים למוח ולהשאיר את השרירים שלמים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן ביצוע הניתוח. קבעו דגימה שלישית לצביעה אימונוהיסטוכימית והתמידו עצבים סגמנטליים של זחליים כדי לחקור תעתוע אקסונלי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.