Name: ויזואליזציה של עצבים המגזרי הזחל ב 3 Rd Instar תסיסנית הכנות הזחל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: למדו לבצע הכנות זחלי Drosophila melanogaster מהדור השלישי לוויזואליזציה של עצבים מגזריים ותובנות לתחבורה אקסונלית במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SG נתמכת על ידי קרנות מאוניברסיטת המדינה של ניו יורק ב באפלו ומ ג&#39;ון ר Oishei קרן.

1. הכנה של ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1x הצפת Dissection באמצעות 128 mM NaCl, 4mm CaCl 2, 4 מ"מ MgCl 2, 2 mM KCl, HEPES 5mm ו סוכרוז 36mM. הפתרון PH ל 7.2 ולסנן לעקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מקבע באמצעות דילול של פורמלדהיד 01:01 16% ו הצפת Dissection 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1x 1x PBT באמצעות בופר פוספט (PBS) ב-pH של 7.2 ו טריטון X-100 ביחס 1:100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 5% שור סרום אלבומין (BSA) עם 0.01% Na אזיד ב 1x PBS. </li></ol> 2. הכנה Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנות Sylgard משמשים לניתוח. הכינו את הכלים על ידי שפיכת Sylgard 184 אלסטומר בסיס סיליקון וריפוי תערובת סוכן לתוך צלחת פטרי. אפשר התערובת לחלוטין לחזק יבשה לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני לנתיחה, לאסוף זוג נקי של # 5 מלקחיים, זוג נקי של מספריים להב ישר vannas, וסיכות. </li></ol> 3. Dissection של הזחלים Instar 3 rd <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף נדודים 3 rd הזחלים instar של גנוטיפ מסוים על גבי צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הזחלים במים deionized להיפטר המזון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים על צלחת הזחל sylgard, עם למעלה בצד הגבי. פין הזחל בקצוות הקדמי ואת האחורי שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ירידה של הצפת Dissection 1x על הזחל ניצח. שימוש בסדר צביטה המספריים זחל על קו האמצע הגב לקראת סוף האחורי. בעזרת מספריים, לחתוך את הקוטיקולה הזחל מהקצה האחורי עד הסוף הקדמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ירידה של מאגר חדש Dissection 1x על הזחל גזור. באמצעות סיכה, לבחור אחד לקצה הלטרלי של לציפורן קרוב לאמצע הזחל ואת הסיכה לציפורן. באמצעות סיכה אחר, להצמיד את קצה לרוחב השני של לציפורן כפי שמוצג בתרשים. שני פינים משמשים בכל צד לרוחב. ראה תרשים להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את המעיים, גופים שומן, קנה הנשימה, ומשאיר רק את המוח עם שתי האונות אופטיים הגרעינים הגחון עם העצבים סגמנטלי המצורפת. היתרה של ההליך מתבצע על צלחת sylgard. </li></ol> 4. קיבוע של הזחל גזור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הזחל גזור ב לתקן במשך 30 דקות, על ידי החלפת לתקן כל 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קיבוע, לשטוף את הזחל ב 1x PBT במשך 30 דקות על ידי החלפת חיץ כל 10 דקות. חשוב לציין כי הזחל תמיד צריך להיות חיץ. </li></ol> 5. נוגדן מכתים של הזחל גזור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הנוגדן הראשוני על ידי דילול זה לריכוז המתאים BSA 5% עם Na אזיד ב 1x PBT. ריכוז אופטימלי יהיה שונה עבור נוגדנים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף האחרון 1x PBT שטיפה בתמיסת נוגדן שהוכן הראשוני, דגירה בתא לח על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. החדר לח נבנית על ידי רירית צלחת פלסטיק עם קים, מגבונים ספוגה במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשטוף את הזחל גזור ב 1x PBT במשך 30 דקות על ידי החלפת חיץ כל 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הנוגדן משני על ידי דילול זה לריכוז המתאים BSA 5% עם Na אזיד ב 1x PBT, ו דגירה הזחל עם פתרון נוגדנים משני של 25 מעלות צלזיוס במשך שעה. עטפו את חדר לח בנייר כסף כדי למנוע את האור, כמו נוגדנים משני הם רגישים לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לשטוף את הזחל ב 1x PBT במשך 30 דקות על ידי החלפת חיץ כל 10 דקות. </li></ol> 6. הרכבה ו ויזואליזציה של הזחל גזור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הרכבה הזחל בשקופית, להכין את השקופית על ידי הפצת שני הקווים האנכיים של לק באמצע, עם רווח מספיק להחליק כיסוי לשבת על (ראה תרשים). בואו הציפורן לק להתייבש לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ירידה של חיץ גובר במרחב בין השורות מסמר אנכי פולנית בשקופית (ראה תרשים). השקופית מוכן כעת גובר. <img src="/files/ftp_upload/2128/2128.6.2.1.jpg" alt="איור 1 שלב 6.2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1 שלב 6.2"> <img src="/files/ftp_upload/2128/2128.6.2.2.jpg" alt="איור 2 שלב 6.2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2 שלב 6.2"></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שאחרון 1x PBT לשטוף בעדינות להסיר את הסיכות לרוחב. היזהר שלא לקרוע את לציפורן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את שתי סיכות הנותרים להרים את הזחל עם מלקחיים והמקום הזחל אופקית בשקופית מוכן. ודא הזחל לא התהפך והוא הצד הגחוני בכיוון מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות במקום להחליק לכסות על גבי החותם את הקצוות עם לק (ראה תרשים). הזחל הוא מוכן כעת להדמיה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. <img src="/files/ftp_upload/2128/2128.6.5.jpg" alt="איור 1 שלב 6.5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1 שלב 6.5"></li></ol> 7. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2128/2128fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1: תמונת נציג של עצבים סגמנטלי הזחל מן סוג larv ברבאמצעות נוגדנים כנגד חלבונים סינפטיים חלבון שלפוחית ​​ציסטאין מחרוזת (CSP, Zinsmaier et al. 1994). שים לב עצבים סגמנטלי הם מוכתמים בצורה חלקה. בר = 20μm <img src="/files/ftp_upload/2128/2128fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2: תמונה מייצגת של עצבים סגמנטלי הזחל מן הזחל חלבון מנוע מוטנטים באמצעות נוגדנים כנגד חלבונים סינפטיים חלבון שלפוחית ​​מחרוזת ציסטאין (CSP). שים לב עצבים סגמנטלי להראות הצטברות מסיבית כי כתם בהיר עבור CSP (חיצים).

<ol><li>Gunawardena, S., Goldstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Axonal+Transport+and+Neuronal+Viability+by+Amyoid+Precursor+Protein+Mutations+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of Axonal Transport and Neuronal Viability by Amyoid Precursor Protein Mutations in Drosophila.</a> Neuron. 32 (2), 389-401 (2001).</li>
<li>Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40 (1), 1-2 (2003).</li>
<li>Hurd, D. D., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+mutations+cause+motor+neuron+disease+phenotypes+by+disrupting+fast+axonal+transport+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila.</a> Genetics. 144 (3), 1075-1085 (1996).</li>
<li>Zinsmaier, K. E., Eberle, K. K., Buchner, E., Walter, N., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paralysis+and+early+death+in+cysteine+string+protein+mutants+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Paralysis and early death in cysteine string protein mutants of Drosophila.</a> Science. 263, 977-980 (1994).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הזחל עצבים תסיסנית סגמנטלי מהווים מערכת רבת עוצמה כדי לחקור מנגנונים בתחבורה axonal. אם 3 rd לנתיחה instar הזחל מבוצעת כראוי, כל הרכיבים של CNS, PNS, ורקמות הקשורים, כגון השרירים NMJs, ניתן לבדוק בתוך זחל אחד. אנחנו צריכים להתאים את הפרוטוקול מאחד שפרסם Hurd ו סקסטון (1996). פרוטוקול זה גם יכול להיות מותאם כדי לבדוק נוגדנים נוירונים אחרים, אבל אופטימיזציה של נוגדנים צריך להיעשות. הדגירה פעמים יסודי ותיכון נוגדן ניתן לשנות או צעד חסימת ניתן להוסיף. השתמשנו בהצלח...

<table><tbody><tr><td>פינצטה Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>סיכות מינוטיה (Minutien Pins), פלדת אל חלד</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>מספרי Mcpherson-Vannas בעלי להב ישר, 8 ס"מ</td><td>Fisher Scientific</td><td>50822236</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield, תמיסת קיבוע</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>אלסטומר סיליקון Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>4026148</td><td></td></tr><tr><td>פורמלהיד, 16%</td><td>מדעי המיקרוסקופיה האלקטרונית</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>dCSP3</td><td>בנק היברידומה למחקרי התפתחות</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td></td></tr></tbody></table>

ויזואליזציה של עצבים המגזרי הזחל ב 3 rd instar תסיסנית הכנות הזחל

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

תסיסנית melanogaster מתגלה כמערכת מודל עוצמה לחקר התפתחות ותפקוד של מערכת העצבים, במיוחד בגלל הגנטיקה נוח רצף הגנום שלו באופן מלא. בנוסף, מערכת העצבים הזחל היא מערכת מודל אידיאלי לחקור מנגנונים של תחבורה axonal כמו העצבים סגמנטלי הזחל מכילות צרורות של אקסונים עם גופי התא שלהם ממוקם בתוך המוח ומסופי העצב שלהם סיום לאורכו של הגוף. כאן אנו מתארים את הליך להדמיה של חלבונים בתוך שלפוחית ​​סינפטית עצבים סגמנטלי הזחל. אם נעשה בצורה נכונה, כל המרכיבים של מערכת העצבים, יחד עם רקמות הקשורים כגון השרירים NMJs, נותרו על כנן, ללא פגע, ומוכן להיות דמיינו. 3 rd הזחלים instar נושאת מוטציות שונות גזור, קבוע, מודגרות עם נוגדנים שלפוחית ​​סינפטית, דמיינו ולעומת הזחלים סוג בר. הליך זה יכול להיות מותאמים עבור מספר נוגדנים סינפטי או עצבי ושינויים שונים והפצה של מגוון של חלבונים ניתן לצפות בקלות בתוך העצבים סגמנטלי הזחל.

הזחלים תסיסנית melanogaster לספק מערכת מודל אידיאלי לחקור את המנגנונים של תחבורה axonal בתוך העצבים סגמנטלי הזחל. באמצעות הליך זה, 3 rd הזחלים instar נושאת מוטציות שונות ניתן להשוות את הזחלים סוג בר.

ויזואליזציה של עצבים המגזרי הזחל ב 3 Rd Instar תסיסנית הכנות הזחל

*Drosophila melanogaster* הופכת למערכת מודל רבת-עוצמה לחקר הפיתוח והתפקוד של מערכת העצבים, במיוחד בשל...

ניתן לחקור הובלה אקסונלית על ידי ויזואליזציה של העצבים הסגמנטליים של הזחל. זבוב פירות (drosophila) בשלב ג' של השלב הטרסלי. ראשית מבצעים דיסקציה לזחל, תוך חשיפת מערכת העצבים המרכזית (CNS) מבלי לפגוע באונות האופטיות, בגנגליון הוונטרלי ובעצבים הסגמנטליים.השלב השני של הפרוצדורה הוא קיבוע הלבה בפורמלהיד לפני דגירה עם נוגדן ראשוני למשך לילה ועם נוגדן משני למשך שעה בחושך. לאחר מכן הלבה מורכבת על עלית זכוכית לבחינת פגמים בהובלה אקסונלית. ניתן לבחון לוקליזציה של חלבונים והתפלגות חלבונים באמצעות מיקרוסקופיה של אימונופלואורסצנציה.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הובלה אקסונלית, ניתן ליישמה גם על מערכות אחרות כגון מורפולוגיה של סינפסות ושרירים. בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקלו בקשיים, כיוון שבתחילה קשה לבצע את הדיסקציה המותרת, ובמיוחד לשמור על השרירים והעצבים הסגמנטליים של המוח שלמים. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו תמיסת קיבוע של dissection buffer בריכוז one times, תמיסת PBT בריכוז one times, ותמיסת BSA בריכוז 5%.כפי שפורט בטבלה המוצגת לפני הנתיחה, הכינו זוג פינצטות מספר 5 נקיות, זוג מספריים בעלי להב ישר ונקיים וסיכות לתחילת הנתיחה; השתמשו בכף מיקרוסקופית כדי לאסוף זחלי כוכב בשלישי בגינום ספציפי אל תוך צלחת פטרי. לאחר מכן, שטפו את הזחלים על ידי שטיפה בצלחת פטרי מלאה במים דאיוניים כ

visualization-larval-segmental-nerves-3rd-instar-drosophila-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מתארים את הליך להכין...

ויזואליזציה של מערכת העצבים כולה עובריים-Mount תסיסנית עוברים

פרוטוקול זה דן חי דיסקציה...

בשנת vivo ויזואליזציה של שלפוחית ​​Synaptic בתוך האקסונים תסיסנית המגזרי הזחל

פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה הרדמה והדמיה של...

בתחום ההדמיה vivo של הזחלים תסיסנית אינטקט ברזולוציה משנה הסלולר

שיטה immunostain ולדמיין איברים chordotonal ב זחלים וגלמים...

ויזואליזציה של Proprioceptors ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים וגלמים

סרטון זה מתאר את בלוטת טבעת דרוזופילה, מבנה אנדוקריני מורכב החשוב לביוסינתזה ולהפרשת אקדיסטרואידים והורמונים אחרים. הפרוטוקול המוצג מדגים את הדיסקציה, הקיבוע והחיסון.

דיסקציה של בלוטת טבעת הזחל: בידוד איברים אנדוקריניים התפתחותיים מדרוזופילה

מקור: Jeong, S. הדמיה של דפוס ההקרנה האקסונלי של נוירונים מוטוריים עובריים ב-Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את ההדמיה של הקרנות אקסונליות בעוברים Drosophila. תיוג חיסוני של נוירונים מוטוריים, דיסקציה מדויקת לחשיפת מבנים עצביים ומיקרוסקופ ניגודיות של הפרעות דיפרנציאליות חושפים ביחד ארכיטקטורה עצבית מפורטת, תוך שימת דגש על דפוסי ההקרנה האקסונלית.

הדמיה של דפוסי הקרנה אקסונליים של נוירונים מוטוריים עובריים בדרוזופילה

הפרדיגמה פציעה באמצעות כבל עצב גחון תסיסנית הזחל לחקור התחדשות במערכת עצבים מרכזיות ותיקון מתואר. דקירה ואחרי סריקת הליזר מיקרוסקופיה confocal בדגימות זמן לשגות וקבועים, בשילוב עם ניתוח הכמותי עם תוכנה שפותחה בתכליתיות וגנטיקה, משמשת כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של התחדשות ותיקון מערכת עצבים מרכזיים.

פרדיגמה פגיעה לחקור תיקון של מערכת עצבים מרכזי ב<em&gt; דרוזופילה</em

פרוטוקול זה מפרט שיטה יעילה המשמשת לביצוע הדמיה תא חי בהקשר של מוח זחל בשלמותה. גישות הדמיה תא חי הן לא יסולא בפז לחקר חלוקות תא גזע עצביים סימטריות כמו גם תהליכים עצביים והתפתחותיות אחרים, לחשוף באופן עקבי מנגנונים שהתעלמו בעבר.

הדמיה חיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuroblasts

אנו מתארים פרוטוקול לנתיחה, קיבעון, ו immunostaining של איברי steroidogenic אצל נשי זחלים בוגרים דרוזופילה ללמוד ביוסינתזה הורמון סטרואידים ואת מנגנון הרגולציה שלה. בנוסף לאיברים steroidogenic, אנו לדמיין את העצבוב של איברים steroidogenic כמו גם תאי היעד steroidogenic כגון תאי גזע germline.

הפרוטוקולים המאפשר הדמיה איברים Steroidogenic ואורגנים אינטראקטיבית שלהם עם Immunostaining ב זבוב הפירות<em&gt; תסיסנית</em

עבודה זו מפרטת שיטת אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית כדי לדמיין תחזיות נוירונים מוטוריים של שלב מאוחר 16 תסיסנית עוברי melanogaster . הכנת הפילה של עוברי קבוע מוכתמים נוגדן FasII מספק כלי רב עוצמה לאפיין את הגנים הנדרשים עבור pathoninding האקסון המנוע ואת ההכרה היעד במהלך התפתחות עצבית.

ויזואליזציה של דפוס היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים ב<em&gt; תסיסנית</em

כאן, אנו דנים בתהליך עבודה להכנה, ניתוח, הרכבה ותמונה של מוחות צמחים חיים מזחלי Drosophila melanogaster Third instar כדי לצפות בדינמיקה התאית והתת-תאית בתנאים פיזיולוגיים.

הדמיה של תאים חיים של Drosophila melanogaster מוח זחל כוכב שלישי

למדו לבצע הכנות זחלי Drosophila melanogaster מהדור השלישי לוויזואליזציה של עצבים מגזריים ותובנות לתחבורה אקסונלית במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

ויזואליזציה של עצבים המגזרי הזחל ב 3^Rd Instar תסיסנית הכנות הזחל

גלה סרטונים נוספים