אינדוקציה והערכה של רקומבינציה החלף מחלקה ב מטוהרים תאים B Murine

במהלך התגובה החיסונית ההומורלית, תאי B שהופעלו על ידי אנטיגן שוכפלים ומפרישים נוגדנים ככל שהתגובה מתקדמת. כדי להעריך את השכפול ואת החלפת הסוג (class switching), סוג הנוגדן (isotype) הבסיסי IgM מוחלף בסוגי IgG, IgA או IgE המגוונים יותר. תאי B מהטחול מבודדים במעבדה (in vitro) מעכבר ניסויים באמצעות הפרדת תאים מגנטית.

התאים נצבעים בצבע הפלואורסצנטי CFSE כדי לעקוב אחר השכפול, המגורה על ידי טיפול ב-L-P-S חיידקי. גרייה באמצעות L-P-S גורמת גם למיתוג סוג (class switching) לאיזוטייפ IgG3, אשר יחד עם השכפול, ניתן למעקב באמצעות ציטומטריית זרימה. היום אראה לכם טכניקה לבידוד והפעלה של תאי B טהורים מהטחול. ניתן להשתמש בטכניקה זו לבדיקת רקומבינציית מיתוג סוג ושכפול in vitro, וניתן להשתמש בה גם כדי לענות על שאלות מפתח בתחום החסינות של תאי B, כולל התפקוד והבקרה של activation induced cytidine deaminase.

התחילו בהשריה של עכבר לאחר המתנסה ב-70% ethanol. על העכבר להיות בן שמונה עד 12 שבועות כדי להבטיח בשלות מלאה של מערכת החיסון. השתמשו במספריים סטריליים כדי לבצע חתך דרך העור והשריר של ההיפוכונדריום השמאלי בבטן. השתמשו במספריים או בפינצטה כדי להוציא את הטחול מהרקמות הסמוכות.

בשלב הבא, חתכו אותו לשלושה חלקים גדולים ב-PBS. לאחר מכן, באמצעות הקצה הגומי של בוכנה ממזרק של 1 מיליליטר, מעכו בעדינות את הטחול דרך מסנן תאים של 70 מיקרון לתוך PBS. הקפידו להשתמש בתנועת דחיפה ולא בתנועת טחינה.

מכיוון שגריסה עלולה להוביל לקרע של תאים proliferatng גדולים יותר, סובבו את התאים במהירות של עד 350 G למשך חמש דקות. לאחר מכן, השעיקו מחדש את המשקע ב-PBS.

ספרו את התאים שהושעו באמצעות המוציטומטר (hemo cytometer) בתוך מבחנה פוליסטירן סטרילית בנפח חמישה מיליליטר. הכינו תמיסה של 1x10⁸ תאים למיליליטר ב-PBS עם 5% נסירום של חולדה (normal rat serum). ניתן להוסיף עד שני מיליליטרים לכל מבחנה.

בשלב הבא, הוסיפו 50 microliters של תערובת העשרה לתאי B של עכבר לבחירה שלילית (EP negative selection Mouse B-cell enrichment cocktail) עבור כל מיליליטר של תאים. לאחר מכן, סגרו את המבחנות והניחו אותן במקרר למשך 15 דקות.

הוסיפו 100 µL מתערובת בחירה של ביוטין EP עבור כל מיליליטר של תאים. סגרו את השפופרות והניחו אותן במקרר למשך 15 דקות. לאחר הדגירה עם תערובת בחירה של ביוטין, ערבבו ננו-חלקיקים מגנטיים EP והוסיפו 100 µL עבור כל מיליליטר של תאים. שאיפו את התערובת בעזרת פפטה, סגרו את השפופרות והניחו אותן במקרר למשך חמש דקות.

השלם את התמיסה ב-PBS עד לנפח של 2.5 milliliters והצב אותה במגנט cept למשך חמש דקות. הפוך את המגנט בתוך הפרובית ושפוך במהירות אל תוך פרובית פוליסטירן חדשה. אין לנער את הפרובית, מכיוון שתאים שנבחרו בשלילה יהיו קשורים מגנטית לדפנות הפרובית. כדי להגביר עוד יותר את טהרת תרחיף התאים, הצב את הפרובית החדשה עם התאים במגנט למשך חמש דקות, ולאחר מכן שפוך שוב לפרובית חדשה.

שלב זה עשוי להפחית את התשואה הכוללת של התאים. ניתן להעריך את טוהר תאי ה-B באמצעות ניתוח פלוו-ציטומטרי של סמני שטח של תאי B. לאחר ההעשרה, למעלה מ-95% מהתאים צריכים להיות B two 20 positive.

השHה את התאים המבודדים ב-PBS חמים בתוספת 0.1% BSA בריכוז סופי של מיליון תאים למילליטר, מתוך תמיסת מלאי של צבע CFSE בריכוז חמישה מילימולר המדולל ב-dimethyl sulf oxide סטרילי. הוסף שני מיקרוליטרים לכל מילליטר של תאים במבחנה. CFSE משמש למעקב אחר חלוקת תאים של תאים שעברו סטימולציה.

תהליך חיוני למעבר איזוטיפ (isotype switching). ריכוז סופי של 10 micromolar הוא האופטימלי לצביעה של תאי B ראשוניים. יש להדגיר בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 10 דקות בחושך.

שים לב ש-CFSE רגיש לאור ויש לשמור אותו בחושך ככל האפשר. לאחר הדגירה, בטל את פעילות הצבע על ידי הוספת נפח שווה של סרום עגל בקר (bovine calf serum) לתאים והדגירה על קרח. כדי לשטוף את התאים למשך חמש דקות, מלא את המבחנות במצע גידול; יש להוסיף נפח של מצע הגדול פי חמישה לפחות מהנפח המקורי כדי להתגבר על הצמיגות של סרום עגל הבקר ולאפשר לתאים להיווצר כמשקע, ולאחר מכן סבב במערך צנטריפוגה במהירות של 350 G. שטוף את התאים פעמיים נוספות במצע גידול; התאים מוכנים כעת לגירוי.

הכינו מצע תרבית לתאי B in vitro על ידי תוספת של 10% fetal bovine serum ו-50 micromolar Beto me capita ethanol ל-RPMI 1640. לאחר מכן, הכינו מצע סטימולציה על ידי הוספת LPS בריכוז סופי של 50 micrograms per milliliter. העבירו מנאי של 125 microliters ממצע הסטימולציה לכל באר בלוח תרבית רקמות בעל 96 באערים עם תחתית שטוחה.

הכינו תאי B שצבעו CFS E במצע תרבית ללא LPS בריכוז סופי של 3.2 times 10 to the six תאים למיליליטר. הוסיפו 125 microliters של תגלהי התאים לבארים המכילות את מצע הגירוי וערבבו על ידי פיפוט עדין. כל באר מכילה כעת 400,000 תאים בריכוז LPS סופי של 25 micrograms למיליליטר.

מצב זה מספק רמות אופטימליות של שגשוג תאים והחלפת מחלקה (class switching). למרות שניתן לשנות ערכים אלו לפי הצורך, יש להדגיר את התאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide למשך 72 עד 96 שעות. לאחר 48 שעות, צבירי תאי B גדולים השגשגים יהיו גלויים בבירור תחת מיקרוסקופ לבחינת החלפת המחלקה.

הוציאו את התאים מהאינקובטור ושטפו אותם פעמיים ב-1 ml של תמיסת צביעה כדי למנוע צביעה לא ספציפית של נוגדנים. שקיעו את התאים על ידי ספינטר ב-350 G. לאחר מכן, השעיקו מחדש את התאים ב-100 µl של תמיסת צביעה עם 5% normal mouse serum ו-1 µg של FC block למיליון תאים, והדגירו למשך 15 דקות על קרח ללא שטיפה. הוסיפו נוגדן anti-US IgG three המסומן פלואורסצנטית בריכוז של 1 µg למיליון תאים, הדגירו למשך 30 דקות על קרח, שטפו את התאים פעמיים והשעיקו אותם מחדש ב-200 עד 300 µl של תמיסת צביעה.

התאים מוכנים כעת להערכה באמצעות ציטומטריית זרימה. CFSE מעורר בצורה אופטימלית באורך גל של 492 ננומטר על ידי לייזר יון ארגון ופולט באורך גל של 517 ננומטר. ספקטרום העירור והפליטה של הנוגדן IgG three תלוי בצבע הפלואורסצנטי המצומד אליו.

בעקבות העשרה מגנטית, תרחיף התאים צריך להיראות כאוכלוסייה הומוגנית של תאים עגולים קטנים שאינם ניתנים להבחנה. לאחר 48 עד 72 שעות של גרייה, ייראו בבירור מקבצים מבודדים של תאים מתרבים ומוגדלים. חלק גדול מהתאים שאינם מתרבים ייראו קטנים וגרנולריים בעודם עוברים אפופטוזיס.

ניתן בדרך כלל לזהות CSR ברמות הגבוהות ביותר בין 72 ל-96 שעות לאחר הגירוי, לפני שרוב התאים מתחילים למות. בשלב זה, התאים אמורים היו לעבור מספר חלוקות תאים, כאשר תאים שעברו החלפה מופיעים באוכלוסיית תאי הבת המאוחרת יותר. בעקבות פרוטוקולים אלו, ניתן להשתמש בטכניקות אחרות, כגון knockdown של גנים באמצעות RNAi, כדי לחקור את ההשפעה של גן כלשהו על תפקודו של ID ועל תהליך ה-class switch recombination.