Name: אינדוקציה והערכה של רקומבינציה החלף מחלקה ב מטוהרים תאים B Murine (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: למד אינדוקציה והערכה של רקומבינציית החלפת מחלקה בתאי B מריניים מטוהרים. פרוטוקול זה מאפשר חקר פונקציית תאי B ומנגנוני החסון ההומורלי בבידוד תאי טחול באמצעות הפרדה מגנטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים במעבדה מרטין לדיונים מועילים. פרסום זה נתמך על ידי מענק מטעם המכון הקנדי לבריאות מחקר (MOP-89783). AM הוא נתמך על ידי פרס קנדה מחקר הקתדרה המשני.

שלב I: בידוד של תאים B הטחול באמצעות העשרה מגנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברי הניסוי צריך להיות בגיל 8-12 שבועות כדי להבטיח הבשלה מלאה של המערכת החיסונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם ומשרים אתנול 70%. ניתוח להסרת הטחול על ידי ביצוע חתך דרך העור והשריר של hypochondrium השמאלי של הבטן וחתכו אותה לשלושה חלקים גדולים פוספט בופר סליין (PBS). ודאו כי כל כלי ריאגנטים הם עקרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בסוף גומי של 1 מ"ל במזרק הבוכנה, ומועכים בעדינות את הטחול דרך מסננת לתוך תא 70 מיקרומטר PBS. הקפד להשתמש תנועה דוחפים ולא בתנועה כמו שחיקה שחיקה עלול להוביל לקרע של (כלומר ריבוי) תאים גדולים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה התאים בבית גרם לא יותר מ 350 במשך 5 דקות ו resuspend גלולה ב PBS. ספירת התאים resuspended באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השעיה של 1x10 8 תאים / מ"ל PBS עם נסיוב 5% חולדה נורמלית צינור פוליסטירן סטרילי 5 מ"ל עם מכסה (בנפח מרבי של 2 מ"ל לכל צינור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL של עכבר EasySep שלילי לבחירה קוקטייל B העשרה תא עבור כל מ"ל של תאים. פיפטה את התערובת, מכסה את הצינורות, ומניחים במקרר למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 קוקטייל μL EasySep ביוטין לבחירה עבור כל מ"ל של תאים. פיפטה את התערובת, מכסה את הצינורות, ומניחים במקרר למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של חלקיקים מגנטיים EasySep (להבטיח חלקיקים מעורבבים היטב הפתרון הוא הומוגני) עבור כל מ"ל של תאים. פיפטה את התערובת, מכסה את הצינורות, ומניחים במקרר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון למעלה כדי 2.5mL עם PBS ומניחים מגנט EasySep במשך 5 דקות. היפוך המגנט ואת הצינורית ויוצקים במהירות לתוך צינור פוליסטירן חדש. אין לטלטל את הצינור כפי התאים שנבחרו באופן שלילי יהיה מחויב מגנטית על הקירות צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגביר עוד יותר את הטוהר של השעיה התא, הצינור יכול להיות לרחם לאבן שואבת עבור 5 דקות נוספות ושפך לתוך צינור חדש. זה עשוי להפחית את התאוששות התא הכולל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא טוהר B ניתן להעריך על ידי ניתוח תזרים cytometric סמנים של משטח B התא. בעקבות העשרה, אנחנו בעקביות לראות טוהר&gt; 95% תאים חיוביים B220. </li></ol> שלב II: תא מכתים CFSE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend בתאים מבודדים PBS חם בתוספת בסרום שור 0.1% אלבומין בריכוז הסופי של 1 x 10 6 תאים לכל מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות 5mm של CFSE (בדילול מלא sulfoxide דימתיל סטרילי) ולהוסיף 2μL עבור מ"ל כל התאים בצינור. הריכוז הסופי של 10μM הוא אופטימלי עבור מכתים של תאים B העיקרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בחושך (הערה: CFSE אור רגישים צריכים להיות כל הזמן בחושך כאשר הדבר אפשרי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות את הכתם על ידי הוספת נפח שווה של נסיוב עגל שור לתאים שלך דוגרים על הקרח במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים על ידי ציפוי את צינורות עם המדיום תרבות (ראה שלב III למתכון) ו centrifuging ב 350 גרם שים לב, לפחות 5 פעמים המקבילה נפח התקשורת יש להוסיף כדי לנטרל את הצמיגות של נסיוב עגל שור ועל התאים לייצר גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עוד פעמיים במדיום תרבות. התאים מוכנים כעת לגירוי. </li></ol> שלב III: גירוי נייד עם LPS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שלך בינוני במבחנה B תרבית תאים על ידי משלים RPMI 1640 עם 10% נסיוב עגל עוברית 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol /. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני הגירוי שלך על ידי הוספת LPS בריכוז הסופי של 50μg/mL. 125 Aliquot μL של המדיום גירוי לבאר כל תחתית שטוחה 96-היטב בתרבות צלחת רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תאים CFSE מוכתם שלך B במדיום תרבות ללא LPS בריכוז סופי של 3.2 x 10 6 תאים / מ"ל. הוספת 125 μL של ההשעיה התא המכיל את הבארות בינוני הגירוי שלך ומערבבים ידי pipetting בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גם עכשיו כל מכיל 4 x 10 5 תאים ריכוז LPS הסופי של 25 מיקרוגרם / מ"ל. זה מספק רמות אופטימליות של התפשטות תאים ומיתוג מעמד, למרות שינויים בערכים אלה עשויים להיות הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב 37 ° C ו 5% CO 2 עבור 72-96 שעות. לאחר 48 שעות, אשכולות גדולים של תאים B מתרבים יהיה לעין תחת מיקרוסקופ. </li></ol> שלב IV: ניתוח תזרים cytometric של מיתוג בכיתה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אתה מוכן להסתכל מעבר בכיתה, להסיר את התאים מן התנאים תרבותם לשטוף אותם פעמיים מ"ל 1 של חיץ מכתים (PBS עם 2% שור עגל נסיוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע אי - נוגדן ספציפי מכתים של תאים שלך, גלולה התאים על ידי ספינינג אותם ב 350 גרם ו incubate אותם 100μL של מכתים חיץ עם נסיוב 5% עכבר רגיל 1μg של FcBlock per106 התאים במשך 15 דקות על הקרח. חסימת Cell צריכה להתבצע על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללא כביסה התאים, להוסיף 1μg לכל 10 6 תאים של נוגדן מתויג fluorescently אנטי עכבר IgG3 ולאפשר לתאים כתם במשך 30 דקות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעמיים על ידי צנטריפוגה ו resuspend ב μL 200-300 של חיץ מכתים. התאים מוכנים כעת להערכה על ידי cytometry הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CFSE הוא מתרגש בצורה אופטימלית ב 492 ננומטר (על ידי ארגון יון לייזר) ופולט ב 517 ננומטר. ספקטרום עירור ופליטה של ​​הנוגדן IgG3 תלויה צבע פלואורסצנטי המצומד שלה. </li></ol> נציג תוצאות בעקבות העשרה מגנטי, על השעיית התא אמור להיראות אוכלוסייה הומוגנית של נבדל תאים עגולים קטנים (איור 1 א). לאחר 48-72 שעות של גירוי, אשכולות של תאים בודדים מתרבים מוגדל יהיה נראה בבירור (איור 1B). חלק גדול של תאים שאינם מתרבים יופיעו קטנים פרטנית כפי שהם עוברים אפופטוזיס. אחריות חברתית בדרך כלל, ניתן להבחין ברמות הגבוהות ביותר בין 72 ו - 96 שעות לאחר גירוי לפני רוב התאים מתחילים למות 7. בשלב זה, התאים צריכים עבר מספר חלוקות תא עם תאים החליף המופיעים האוכלוסייה בתו לאחר מכן התא. תזרים נציג העלילה cytometric של דילול CFSE וביטוי פני השטח של IgG3 לאחר 96 שעות של גירוי LPS ניתן לראות באיור 2. טבלה 1. אלוטיפ מיתוג קוקטיילים. הערה: ריכוז הערכים ממריצות הן המלצות בלבד. Titrations עשוי להיות נחוץ. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רצוי אלוטיפ </td><td> גירוי קוקטייל </td></tr><tr><td> IgG1and IgE </td><td> LPS (25μg/mL) ו-IL-4 (10 ng / mL) </td></tr><tr><td> IgG1and IgE </td><td> Anti-CD40 (10μg/mL) ו-IL-4 (10 ng / mL) </td></tr><tr><td> IgG2a </td><td> LPS (25μg/mL) ו - IFN-γ (10 ng / mL) </td></tr><tr><td> IgG2b ו IgG3 </td><td> LPS (25μg/mL) </td></tr><tr><td> IgA </td><td> LPS (25μg/mL), TGF-β (2 ng / mL) ו-IL-5 (1.5 ng / mL) </td></tr></tbody></table><img src="/files/ftp_upload/2130/2130fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. בידוד גירוי LPS בתאי B הטחול. (א) מועשר מגנטית תאים B הטחול לפני גירוי LPS. (ב) 48 שעות לאחר גירוי עם 25 מיקרוגרם / מ"ל ​​של LPS. התאים מתרבים נתפסים אשכולות ברקע של תאים אפופטוטיים פיצוץ ו. <img src="/files/ftp_upload/2130/2130fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. הפצת נשק ולעבור רקומבינציה הכיתה לאחר 96 שעות. (א) דילול CFSE עבור LPS מגורה בתאים לאחר 96 שעות בתרבות. כל שיא עצמאית מהווה דילול של הקרינה CFSE המתאים חלוקת תאים עצמאיים. (ב) הביטוי IgG3 המציג את צמיחתה של האוכלוסייה IgG3 חיובית בעקבות כמה סיבובים של חלוקת התא.

<ol><li>Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+differentiation+and+isotype+switching+is+related+to+division+cycle+number%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number.</a> J Exp Med. 184, 277-281 (1996).</li>
<li>McCall, M. N., Hodgkin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switch+recombination+and+germ-line+transcription+are+division-regulated+events+in+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes.</a> Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).</li>
<li>Manis, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+links+DNA+damage-response+pathways+to+immunoglobulin+heavy+chain+class-switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination.</a> Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).</li>
<li>de Yebenes, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-181b+negatively+regulates+activation-induced+cytidine+deaminase+in+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells.</a> J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).</li>
<li>McBride, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+class+switch+recombination+and+somatic+mutation+by+AID+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation.</a> J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).</li>
<li>Ramachandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNF8%2FRNF168+ubiquitin+ligase+cascade+facilitates+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).</li>
<li>Zaheen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AID+constrains+germinal+center+size+by+rendering+B+cells+susceptible+to+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">AID constrains germinal center size by rendering B cells susceptible to apoptosis.</a> Blood. 114, 547-554 (2009).</li>
<li>Chaudhuri, J., Alt, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class-switch+recombination%3A+interplay+of+transcription%2C+DNA+deamination+and+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair.</a> Nat Rev Immunol. 4, 541-552 (2004).</li>
<li>Kaminski, D. A., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimuli+that+enhance+IgA+class+switching+increase+histone+3+acetylation+at+S+alpha%2C+but+poorly+stimulate+sequential+switching+from+IgG2b%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stimuli that enhance IgA class switching increase histone 3 acetylation at S alpha, but poorly stimulate sequential switching from IgG2b.</a> Eur J Immunol. 37, 240-251 (2007).</li>
<li>Kaminski, D. A., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+class+switching+differs+among+SJL%2C+C57BL%2F6+and+129+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice.</a> Int Immunol. 19, 545-556 (2007).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול שתוארו לעיל מספק assay תקן לנתח ביטוי סיוע לתפקד במהלך מיתוג המעמד העיקרי של תאים B Murine. פרוטוקול זה משתמש LPS בקטריאלי כדי לגרום מעבר מ IgM כדי IgG3, למרות שינויים בתקשורת הגירוי יכול להתבצע לגרום מעבר isotypes אחרים (מסוכמים בטבלה 1 8, 9). יש לנו לציין כי, מסיבות שעדיין לא ידוע, נסיוב עגל העובר יכול להשפיע על רמת הכיתה מיתוג נצפתה במבחנה. זה חיוני כי מספר רב אותו לשמש עבור כל הניסויים CSR...

<table><tbody><tr><td>סליין עם בופר פוספט (Phosphate Buffered Saline)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>ערכה להעשרה של תאי B מעכבר (EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>19754</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות פוליסטירן</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין משרת בקר (Bovine Serum Albumin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>ערכה לבדיקת proliferציה של תאים (CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit)</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל בקר</td><td>Hyclone</td><td>SH30072.03</td><td></td></tr><tr><td>מצע תרבית RPMI 1640</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>ליפופוליסכרידים מ- &lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6529</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-מרקפט&amp;#8211;אתנול</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>סרום עוברי של בקר (Fetal Bovine Serum)</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>סרום עכבר נורמלי</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>011-000</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן חולדה מופק Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן חולדה Anti-Mouse IgG3</td><td>BD Biosciences</td><td>553401</td><td></td></tr></tbody></table>

אינדוקציה והערכה של רקומבינציה החלף מחלקה ב מטוהרים תאים b murine

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

חסינות הלחות היא ענף של המערכת החיסונית ומתוחזק על ידי תאים B ו מתווכת באמצעות הפרשה של נוגדנים. עם הפעלת תא B, מוקד אימונוגלובולינים עוברת סדרה של שינויים גנטיים כדי לשנות את קיבולת מחייב מפעיל פונקציה של נוגדנים מופרשים. תהליך זה מודגש על ידי אירוע רקומבינציה גנטי המכונה רקומבינציה בכיתה מתג (CSR) שבו IgM מחדל אלוטיפ נוגדן הוא החליף את אחד IgG, IgA או IgE. אלוטיפ כל בעל פונקציות שונות ובכך מפעיל אחריות חברתית חיונית לשמירה על חסינות. גיוון של מוקד אימונוגלובולינים מתווכת על ידי דאמינז הפעלה-Induced cytidine אנזים (AID). וידאו סכמטי המתאר את התהליך בפירוט זמינה באופן מקוון (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). פעילות של סיוע מסלול CSR נלמדים בדרך כלל הערכה של תפקוד התא B ו חסינות הלחות בעכברים. פרוטוקול המתוארים בדוח זה מציג שיטה של ​​בידוד תא B מ spleens Murine וגירוי לאחר מכן עם lipopolysaccharide חיידקי (LPS) כדי לגרום מעמד מעבר IgG3 (עבור isotypes נוגדנים אחרים ראו טבלה 1). בנוסף, מכתים פלורסנט התא לצבוע Carboxyfluorescein succinimidyl אסתר (CFSE) משמש כדי לפקח על חלוקת התא של תאים מגורה, תהליך חיוני אלוטיפ מיתוג 1, 2. הסדרת הסיוע את המנגנון שבאמצעותו CSR מתרחשת עדיין אינם ברורים ולכן בבורר מבחני חוץ גופית בכיתה לספק שיטה אמינה לבדיקת תהליכים אלה במודלים של עכברים שונים. מבחני אלו שימשו בעבר בהקשר של חוסר גנטי באמצעות עכברים knockout 3. יתר על כן, במבחנה מיתוג של תאים B יכול להיות קדמו התמרה ויראלית לווסת ביטוי גנים על ידי מציאה RNA או ביטוי transgene 4-6. נתונים אלו סוגים של ניסויים השפיעו ההבנה שלנו של פעילות AID, ברזולוציה של התגובה CSR, ואת הנוגדנים בתיווך חסינות העכבר.

בעקבות חשיפה לאנטיגן, מופעל subpopulations של תאים B עוברים תהליך הידוע בשם רקומבינציה לעבור מחלקה (CSR) כדי לייצר נוגדנים isotypes עם מפעיל פונקציות שונות. פרוטוקול המתוארים בדוח זה מסביר כיצד CSR יכול להיגרם ונותחו<em&gt; במבחנה</em&gt; לצורכי לימוד פונקציה B התא.

אינדוקציה והערכה של רקומבינציה החלף מחלקה ב מטוהרים תאים B Murine

חסינות הומורלית היא הענף של מערכת החיסון המתוחזק על ידי תאי B והמתווך באמצעות הפרשת נוגדנים. עם הפעלת תאי ה-B, ה...

במהלך התגובה החיסונית ההומורלית, תאי B שהופעלו על ידי אנטיגן שוכפלים ומפרישים נוגדנים ככל שהתגובה מתקדמת. כדי להעריך את השכפול ואת החלפת הסוג (class switching), סוג הנוגדן (isotype) הבסיסי IgM מוחלף בסוגי IgG, IgA או IgE המגוונים יותר. תאי B מהטחול מבודדים במעבדה (in vitro) מעכבר ניסויים באמצעות הפרדת תאים מגנטית.התאים נצבעים בצבע הפלואורסצנטי CFSE כדי לעקוב אחר השכפול, המגורה על ידי טיפול ב-L-P-S חיידקי. גרייה באמצעות L-P-S גורמת גם למיתוג סוג (class switching) לאיזוטייפ IgG3, אשר יחד עם השכפול, ניתן למעקב באמצעות ציטומטריית זרימה. היום אראה לכם טכניקה לבידוד והפעלה של תאי B טהורים מהטחול. ניתן להשתמש בטכניקה זו לבדיקת רקומבינציית מיתוג סוג ושכפול in vitro, וניתן להשתמש בה גם כדי לענות על שאלות מפתח בתחום החסינות של תאי B, כולל התפקוד והבקרה של activation induced cytidine deaminase.התחילו בהשריה של עכבר לאחר המתנסה ב-70% ethanol. על העכבר להיות בן שמונה עד 12 שבועות כדי להבטיח בשלות מלאה של מערכת החיסון. השתמשו במספריים סטריליים כדי לבצע חתך דרך העור והשריר של ההיפוכונדריום השמאלי בבטן. השתמשו במספריים או בפינצטה כדי להוציא את הטחול מהרקמות הסמוכות.בשלב הבא, חתכו אותו לשלושה חלקים גדולים ב-PBS. לאחר מכן, באמצעות הקצה הגומי של בוכנה ממזרק של 1 מיליליטר, מעכו בעדינות את הטחול דרך מס

induction-assessment-class-switch-recombination-purified-murine-b

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מערכת יעילה של מבנה וניתוח פונקציה של גן...

רקומביננטי הפקה זיהום retroviral של תאים B

אנו מתארים כיצד לבצע זיהומים retroviral או lentiviral של overexpression או shRNA המכילים בונה את קו האדם ראמוס תא B וכיצד למדוד hypermutation סומטיים בתאים אלה.

הערכת Hypermutation תאים סומטיים ב ראמוס B לאחר Overexpression או מציאה של גנים ספציפיים

ניתוח במבחנה של רקומבינציה של מתג מחלקה בעכברים הוא מאתגר עקב מולקולות IgE ציטופיליות הקשורות לקולטני Fc על פני תאי B.  אנו מתארים שיטה לזיהוי IgE באמצעות מחשוף בתיווך טריפסין של IgE קשור לפני השטח לפני קיבוע וחדירות לצביעה פלואורסצנטית ציטופלזמית.

איתור של True IgE להביע תאי Lineage העכבר B

העברת לימפוציטים bm12 למושתל C57BL/6 היא מודל מבוסס של זאבת אדמנתית מערכתית. כאן אנו מתארים כיצד ליזום מחלה באמצעות מודל זה וכיצד לאפיין תאי עזר זקיקי T, תאי B במרכז הנבט ותאי פלזמה על ידי ציטומטריית זרימה.

דגם bm12 העין מתנהל של זאבת אדמנתית המערכתית (לופוס) בC57BL עכברים / 6

לימפוציטים הם השחקנים העיקריים בתגובות חיסוניות נרכשות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול טיהור לימפוציטים כדי לקבוע את הפונקציות הפיזיולוגיות של המולקולות הרצויות בהפעלת לימפוציטים במבחנה וב-vivo. הליכי הניסוי המתוארים מתאימים להשוואת יכולות תפקודיות בין לימפוציטים בקרה ללימפוציטים מהונדסים גנטית.

בידוד ההפעלה של Murine לימפוציטים

גורמים epigenetic יכול לקיים אינטראקציה עם תוכניות גנטית כדי לווסת את ביטוי גנים ולווסת תא B פונקציה. על ידי שילוב חוץ גופית ב B-cell גירוי, לרביעיית-PCR, ו- microRNA בתפוקה גבוהה-רצף וגישות mRNA-רצף, אנחנו ניתן לנתח את אפנון epigenetic הביטוי miRNA וג'ין בתאי B.

הגנום כולו בתיווך ניתוח של HDAC מעכב אפנון של מיקרו Rna ו mRNAs ב B תאים המושרה Undergo מחלקה-מתג ה-DNA רקומבינציה, התמיינות תאים פלזמה

בנייר זה, אנו מתארים פרוטוקול לאפיין תלויי-T ו- T-עצמאית אימונוגלובולינים (Ig) תגובות isotype בעכברים באמצעות אליסה. בשיטה זו נעשה שימוש לבד או בשילוב עם זרימה cytometry יאפשר לחוקרים לזהות הבדלים בתגובות isotype איג B תאית בעכברים בעקבות חיסון אנטיגן תלויי-T ו- T-עצמאית.

אפיון של אימונוגלובולינים התימוס תלוית ועצמאי התימוס תגובות Isotype בעכברים באמצעות אנזים-מקושרים Immunosorbent Assay

כאן אנו מתארים שיטה של הבעה overexpression והעברה המאמצת של תאים מורנין ב-1a כדי לבחון ב vivo B-1a תא הגירה ולוקליזציה. פרוטוקול זה ניתן להארכה עבור שונים הזרם התפקודי של המטה אומר כולל כימות של לוקליזציה של התורם B-1a או ניתוח של הגורמים הנגזרים לתא התורם הנגזר לאחר העברה המאמצת.

Retroviral ביטוי יתר של CXCR4 על מורנה ב-1a תאים והעברה המאמצת עבור B-1a תא הגירה במח העצם ו IgM הפקה

מוצג כאן הוא מבחנה לכמת היפרמוטציה סומטית בתוך לוקוז גנים שרשרת כבד אימונוגלובולין באמצעות תאי מרכז B נביטה מן המדבקות של העכבר פייר.

ניתוח של היפרמוטציה סומטית באינטרון JH4 של תאי מרכז נגרינל B מן המדבקות של עכבר פייר

אנו מתארים כאן ניתוח פשוט של ההטרוגניות של תא תאי B החיסוניים המוריניים ברקמות הצפק, הטחול ומח העצם על ידי ציטומטריית זרימה. הפרוטוקול יכול להיות מותאם ומורחב לרקמות עכבר אחרות.

אפיון ציטומטרי זרימה של פיתוח תאי מורין B

בפרוטוקול זה מתואר מודל קוליטיס אימוץ של תאי T ספציפיים למיקרוביוטה במעיים. תאי CD4+ T מבודדים מעכברים מהונדסים CBir1 TCR. אלה הם ספציפיים עבור מיקרוביוטה המעי immunodominant אנטיגן CBir1 flagellin, אשר מועבר לתוך המטופל Rag1-/- עכברים, המוביל דלקת מעיים.

אינדוקציה של דלקת מעיים על ידי העברה מאמצת של CBir1 TCR תאי CD4 + TCR מהונדסים לעכברים חיסוניים

למד אינדוקציה והערכה של רקומבינציית החלפת מחלקה בתאי B מריניים מטוהרים. פרוטוקול זה מאפשר חקר פונקציית תאי B ומנגנוני החסון ההומורלי בבידוד תאי טחול באמצעות הפרדה מגנטית.

אינדוקציה והערכה של רקומבינציה החלף מחלקה ב מטוהרים תאים B Murine

גלה סרטונים נוספים