Name: Gramicidin מבוססי Assay פלואורסצנטי; לקביעת מולקולות קטנות פוטנציאל שינוי מאפייני bilayer ליפידים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-13T10:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: חקור שיטת מדידת שינויים בתכונות שכבת הליפידים באמצעות ערוצי גרמיצידין ומדידת קצב דעיכת פלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה של השפעת תרופות על דינמיקת הממברנה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים מייקל ג&#39;יי ברונו, Radda Rusinova וג&#39;ון ט שק לדיונים מגרה רבים. תמיכה כספית מ-NIH, R01GM021342 ואת ערה תוספת R01GM021342-35S1, ואת מייסי ג&#39;וניור יאשיהו קרן אל OSA, Tri-אני תוכנית קרינת הרקע הקוסמית עבור HII; ו ל איריס לוורט ס וודוורת רפואי המדען אחוות ו-NIH MSTP מענק GM07739 עבור ר.ק..

1. צור נמלים מלא ליפוזומים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 1, להסיר ממס אורגני מן שומנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת שומנים מהמקפיא ולתת לו לאזן לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.6 מ"ל של 25 מ"ג / מ"ל ​​(1,2-dierucoyl-SN-glycero-3-phosphocholine) שומנים בתמיסה כלורופורם כדי בקבוקון 25 מ"ל תחתית עגולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרף לסובב את הבקבוק תוך ייבוש תחת חנקן, עד שכל כלורופורם התאדו וסרט לבן דק של מעילים השומנים שכל החלק התחתון של הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש dessicator תחת ואקום לילה. </li></ol><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 2, להכין את המדגם עם fluorophore כי ישולבו שלפוחית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננותם מ"מ 100 NANO 3, 25 נמלים מ"מ (Na מלח), 10 HEPES מ"מ. השתמש HNO 3 או NaOH להתאים את ה-pH 7.0. כל מולקולה נמלים יש 2 + Na, עבור סכום כולל של 150 מ"מ [Na +]. הוספת 1.671 מ"ל של אלקטרוליט לקבל השעיה 10 השומנים מ"מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Parafilm ו מערבולת ההשעיה ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגן מדגם מן האור עם רדיד ולתת לו גיל בטמפרטורת החדר למשך הלילה. </li></ol><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3, להפוך את שלפוחית ​​unilamellar גדול להסיר את כל fluorophore מבחוץ שלפוחית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate דקות 1 ב sonicator צריכת חשמל נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא להפשיר מדגם 5-6 פעמים, בכל פעם עם 5 דקות על קרח יבש 5 דקות חם (~ 50 ° C) ומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Extrude את ההשעיה השומנים באמצעות אוואנטי מיני extruder. הגדרת מיני extruder עם 0.1 מיקרומטר פוליקרבונט לסנן ולסנן תומך (עיין במדריך extruder לפרטים נוספים). Extrude את ההשעיה קדימה ואחורה 21 פעמים כזה ההשעיה בסופו של דבר על מזרק הפוך. כאשר קבוצות מרובות נמתחים, זכור תמיד לטעון דגימות עם מזרק אחד. במהלך שחול ההשעיה מעונן השומנים הראשוני צריך להיות כמעט שקוף (הוא עדיין יהיה צהוב בשל fluorophore הנמלים). אם שחול פתאום הופך להיות יותר קל הלחץ פחות צורך לעבור דרך המסנן, המסנן יכול להיות מקרע ויהיה צריך להיות מוחלף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר נמלים חיצוני על ידי הפעלת ההשעיה הנמתח על פני טור PD-10 desalting באמצעות פרוטוקול הכבידה. לאזן טור עם 20-30 מ"ל של Na-חיץ (140 mM NANO 3, 10 HEPES מ"מ, pH 7.0, לזכור להשתמש HNO 3 או NaOH להתאים את ה-pH). הוסף 1.5 מ"ל של ההשעיה השומנים extruded לעמודה ולתת לו לחלחל פנימה להביא את סך היקף המדגם כדי mL 2.5 ידי הוספת 1 מ"ל Na-חיץ. לאחר חיץ משולב במלואו לתוך הטור ושום דבר לא דולף החוצה, elute ליפוזומים עם 3 מ"ל של Na-חיץ ולאסוף את המדגם שהתקבל. הנמלים וכתוצאה מכך מלא LUV פתרון המניות צריכה להכיל על שומני mM 4-5 מופיעים שקוף לבן חלבי. הגנה על מדגם מן האור עם רדיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הפתרון המניה אינו משמש באופן מיידי, חנות ב 13 ° C לכל היותר 7 ימים. אזהרה: לא להקפיא או לקרר את הפתרון השומנים מתחת לנוזל, הטמפרטורה שלה גביש בשלב המעבר (~ 12 ° C), כמו זה יהרוס את השלמות של שלפוחית ​​ואת fluorophore ידלפו החוצה. </li></ol> 2. מערבבים Fluorescence פתרון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לפני השימוש, לדלל ליפוזומים ו דגירה עם gramicidin (ב 13 ° C). איזון של gramicidin בין monolayers הפנימיים והחיצוניים שלפוחית ​​"השומנים היא תהליך איטי, המחייב דגירה ארוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת ביסודיות נמלים מלא LUV פתרון מניות כמו 'לאב' יש צפיפות&gt; 1 גרם / מ"ל ​​ועל כן משקעים בפתרונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את נמלים מלא LUV 1:20 המניות Na-חיץ. מערבבים את כל ליפוזומים לשימוש יום אחד הניסויים יחד בבקבוק אחד כדי לשפר את אחידות המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את 3 / 4 של ליפוזומים ולהוסיף 260 nM gramicidin מראש מדולל DMSO (500 מיקרוגרם / מ"ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי הנותרים 1 / 4 להוסיף באותו נפח של DMSO (ללא gramicidin) כדי לשמור על ריכוז קבוע ממס כל הדגימות. </li></ol> 3. הגדרת כלי פלואורסצנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משתמשים יישומי Photophysics SX.20 הפסיקה זרימת spectrofluorometer עם בקרת טמפרטורה למדוד את קצב של מרווה פלואורסצנציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את המכשירים על שעה לפני הזמן, כדי לאפשר חימום. הרכיבים הם: מחשב יחידה אלקטרוניות לבקרת מים, אמבטיה (שניהם מקרר ותנור חימום), אספקת החשמל המנורה מיכל חנקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת התנאים ההקלטה באמצעות תוכנת Pro-SX נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את עירור monochromator הגל 352 ננומטר רוחב פתחים חריץ עבור עירור עד 1 / 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש λ = 455 nm גבוהה לעבור סינון כדי להקליט את הפליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש "תחזיק לחץ" הגדרה, המאפשר את המכשיר כדי לשמור על לחץ חנקן במהלך ההקלטה, ובכך מונע תנודות בלחץ (וחפצי הקלטה) במהלך אלפיות השנייה הראשונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת "טילי "עד 1 s ו" נקודות "אל 5000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתיבת לחזור ולהתאים את מספר חזרות, בדרך כלל אנו משתמשים 9 ו - 13 חזרות על חיץ ומפעיל מרווה, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טמפרטורת המים באמבטיה צריך להיות מוגדר 25 ° C: הטמפרטורה צריכה להיות במעקב בתוכנה SX. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את נפח הכונן μL 120, כלומר כל פעם המכשיר פועל מדגם, הוא מתערבב 60 μL מתוך כל אחד משני מזרקים. עם ההגדרה הזו אינסטרומנטלית, נפח μL 120 נותן זמן מת ≈ של 1.2 ms. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את מתח גבוה (רווח) על גלאי הקרינה עבור פלט של נמלים, liposome להיות סביב 8. לקבלת תערובת ניסיוני רגיל לזכות צריך להיות 400-420 V. חלק מהתרופות הם פלורסנט, כך הם יכולים להרוות את אותות הקרינה. במקרים אלה, רווח / מתח צריכה להיות ירידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמיד לטעון את מדגם ניאון לתוך המזרק שמאל חיץ / מרווה בתוך מזרק הנכון. הקפד מערבולת ביסודיות את כל דגימות המכילה ליפוזומים לפני הטעינה, ולהיות מודעים לכך 'לאב' עם הזמן יהיה להתיישב המזרק. </li></ol> 4. עושה ניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מדגם של נמלים טעון 'לאב' עם או ממס או תרכובת, לטעון לתוך spectrofluorometer יחד עם או Na-חיץ או TL-מרווה (50 mM TlNO 3, 94 mM NANO 3, 10 mM HEPES ב-pH 7.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ב 1.5 מ"ל מדולל נמלים-LUV פתרון, עם או בלי gramicidin, שהוכן יום קודם לכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את התרכובת בריכוז הרצוי או ממס עבור פקדי. לשמור על ריכוז ממס על מינימום וקבוע בכל הדגימות. ריכוזים יהיה צריך להיות מותאם עם מתחם כלשהו (לא ידוע) חדש כדי להשיג את הרצוי מנה תגובה מגוון. דגירה של 10 דקות במהירות של 25 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס LUV מדגם לטעון לתוך מזרק שמאל. טען את Na-TL-חיץ או מרווה לתוך מזרק הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות להסיר בועות אוויר דגימות הן על ידי לחיצה על מזרקים קדימה ואחורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שני מזרקים נטענים באותה מידה לפני סגירת ברזים. טעינת Unequal תגרום מראש ערבוב של פתרונות לפני שהם מגיעים לתא הקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור המדגם הראשון, להקליט את הקרינה עם Na-חיץ, לחזור 4 פעמים, להתאים את מתח גבוה (רווח) לפי הצורך, וחזור 5 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת דוגמיות הנותרים, 9 חוזר להקליט עם Na-חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את Na-חיץ עם TL-מרווה ולהקליט 13 חזרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם מים וממשיכים עם מדגם הבאה. כפי שולטת אנו משתמשים דגימות עם: לא gramicidin עם ממס, לא gramicidin ובריכוז מתחם מקסימלית, עם שני gramicidin ממס. </li></ol> 5. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תוצאות למחשב ניתוח. קרא את כל הנתונים לתוך MATLAB לניתוח. עבור כל דגימה, לקרוא למאגר כל וחוזר מרווה, למעט ארבעת הראשונים בכל מקרה, אלו מכילים ממצאים ערבוב. בהנחה נפח כונן של 120 μL זה לוקח קצת פחות מארבע יריות לחלוטין לנקות את התערובת הקודמת צינורות הפסיק-הזרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חוזר חיץ עבור כל דגימות צריך להיות דומה מאוד. אם יש שינוי משמעותי האות הקרינה, אשר תלויה בריכוז המתחם, ואז את המתחם עצמו עשוי להיות פלורסנט ייתכן שיהיה צורך קודם לחסר זה אות הקרינה נוסף לפני נורמליזציה דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידנית לעבור עקבות ולהסיר "הרע" חוזר: חוזר ובו קוצים או סטיות exponentiality רב בשל ערבוב חפצים ו / או בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נרמל חוזר מרווה לערך החל הממוצע של חוזר חיץ עבור כל דגימה. שלב ממוצעים של כל הדגימות לתוך גרף אחד עבור להדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקבות מוקלט עם gramicidin לא צריכים להיות דומים להראות כמעט שום מרווה פלואורסצנציה, ייתכן שיש ירידה איטית האות הקרינה בשל דליפה איטית של טי + דרך bilayer שלפוחית ​​8. אם המדגם עם gramicidin וללא משנה מראה מרווה משמעותי, אז שלפוחית ​​התדרדרו ולא אמור לשמש נוספת. אם דגימות עם gramicidin אבל לא משנה את ההצגה עם מרווה משמעותי, ולאחר מכן צירוף מדאיג bilayer שלפוחית ​​עד כדי כך שזה מאפשר fluorophore או מרווה לחצות את bilayer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם המתחם משנה bilayer נכסים שומנים בדם, כמו חש ידי ערוצי gramicidin, במהלך הזמן הקרינה יהיה שונה בעליל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל דגימה, מתוח מעריכי <img src="/files/ftp_upload/2131/2131eg1.jpg" alt="משוואה 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="משוואה 1"> לדוגמא: 4) הוא כשיר הראשון 200-100 ms של עקומת מרווה מנורמל את הקרינה של הפרט חוזר ושיעור <img src="/files/ftp_upload/2131/2131eg2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> 4מחושב על 2 ms. ממוצעים וסטיות תקן מחושבים למדגם נתון מכל חוזר על הפרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ולבסוף, לקבוע את השינוי היחסי בקצב להרוות ידי נרמול המדגם לשלוט בזמן הקרוב כי יש gramicidin ולא משנה. </li></ol> 6. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1: היסודות של assay להרוות מבוססי פלואורסצנציה לזהות שינויים במאפייני bilayer השומנים למעלה משמאל:. זום על שלפוחית ​​השומנים יחיד עם נמלים פלוס NANO 3 ​​מבפנים ננו 3 פלוס TlNO 3 בחוץ. למעלה מימין: אות הקרינה רשמה משתמש (טופס מלמעלה למטה) נמלים מלא שלפוחיות ללא מרווה, עם מרווה, עם מרווה מראש מסוממים עם gramicidin nM 87, 260 ו - 780. למטה: ייצוג סכמטי של תא הפסיק זרימה ערבוב. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2: צילום מסך מתוך התוכנה SX Pro-Data הממחישות את לוחות שונים הפניה בתיאור ההתקנה הניסוי. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3:. קביעות חוזרות מרובות של האות הקרינה מן נמלים טעון 'לאב' עם Na-חיץ הראשון ארבע חזרות אינם נכללים תמיד, כפי שהם מכילים חפצים ערבוב. צינור המחבר את מזרקים מדגם לתא ערבוב יש נפח מוגדר, ולכן חוזר על הראשונות ייתן לנו קריאה של מה שהיה בעבר צינורות: מים לחזור על 1 ו 2, שילוב של מים דגימה לחזור 3, בעיקר מדגם עבור 4 לחזור, ופשוט לדוגמה עבור חוזר הנותרים. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4:. קביעות חוזרות מרובות של האות הקרינה מן נמלים טעון 'לאב' עם Na-חיץ עם TL-מרווה הראשון ארבע חזרות הוסרו שני המצבים. בנוסף, עבור TL-מרווה מדידות, לחזור על 8 יש להסיר בשל חפצים, בועות אוויר סביר ביותר. <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> . איור 5: השפעת קפסאיצין (שווי) על מהלך הזמן של מרווה נמלים פלואורסצנטי (א) אות הקרינה מנורמל מעל 1 s, נקודות אפורות לציין תוצאות מכל חזרות (n&gt; 5 לכל מצב); הקווים האדומים מציינים את הממוצע של כל חוזר. (ב) הראשון 100 ms, נקודות אפורות לציין נובע לחזור יחיד עבור כל תנאי; הקווים האדומים נמתחים מתאים מעריכי (2-100 ms) לאלה חוזר. הקו הכחול מציין את מנומרות 2 ms סימן, הזמן שבו שיעור מרווה נקבע. בשני A ו-B עקבות העליונה מראה תוצאות בהעדר טי +; את שני עקבות להראות תוצאות בהעדר GA, עם טי + שווי ±; ארבע עקבות להראות תוצאות נמוכות עם 260 nM GA ו טי +, שם המספרים מציינים [יתר] ב מיקרומטר. שיעורי מרווה עבור שווי 0, 10, 30 ו - 90 מיקרומטר, כפי שנקבע על ידי בשיעור של מעריכי מתוח, הם 36 ± 6, 69 ± 6, 8 ו - 85 ± 247 ± 27 (ממוצע ± סטיית תקן, n&gt; 8) , בהתאמה.

<ol><li>Andersen, O. S. Ion transport through simple membranes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndersen%2C+OS+%22Renal+Function%22">Renal Function</a>. Giebisch, G. H., Purcel, E. F. , The Josiah Macy, Jr. Foundation. New York. (1978).</li>
<li>Andersen, O. S., Koeppe, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bilayer+thickness+and+membrane+protein+function%3A+An+energetic+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Bilayer thickness and membrane protein function: An energetic perspective.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 107-130 (2007).</li>
<li>Andersen, O. S., Koeppe, R. E., Roux, B. Gramicidin channels. Versatile tools. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndersen%2C+OS+%22Biological+Membrane+Ion+Channels%3A+Dynamics%2C+Structure%2C+and+Applications%22">Biological Membrane Ion Channels: Dynamics, Structure, and Applications</a>. Chung, S. -H., Andersen, O. S., Krishnamurthy, V. , Springer Verlag. New York. (2007).</li>
<li>Berberan-Santos, M. N., Bodunov, E. N., Valeur, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mathematical+functions+for+the+analysis+of+luminescence+decays+with+underlying+distributions+1.+Kohlrausch+decay+function+%28stretched+exponential%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Mathematical functions for the analysis of luminescence decays with underlying distributions 1. Kohlrausch decay function (stretched exponential.</a> Chem. Phys. 315, 171-182 (2005).</li>
<li>Bruggemann, E. P., Kayalar, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+molecularity+of+the+colicin+E1+channel+by+stopped-flow+ion+flux+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Determination of the molecularity of the colicin E1 channel by stopped-flow ion flux kinetics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83, 4273-4276 (1986).</li>
<li>Bruno, M. J., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docosahexaenoic+acid+alters+bilayer+elastic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Docosahexaenoic acid alters bilayer elastic properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 9638-9643 (2007).</li>
<li>Buboltz, J. T., Feigenson, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+for+the+preparation+of+liposomes%3A+rapid+solvent+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">A novel strategy for the preparation of liposomes: rapid solvent exchange.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1417, 232-245 (1999).</li>
<li>Gutknecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadmium+%26+thallous+ion+permeabilities+through+lipid+bilayer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Cadmium & thallous ion permeabilities through lipid bilayer membranes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 735, 185-188 (1983).</li>
<li>Ingólfsson, H. I., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+is+a+modulator+of+bilayer+material+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Curcumin is a modulator of bilayer material properties.</a> Biochemistry. 46, 10384-10391 (2007).</li>
<li>Keserü, G. M., Makara, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+lead+discovery+strategies+on+the+properties+of+drug+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The influence of lead discovery strategies on the properties of drug candidates.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 8, 203-212 (2009).</li>
<li>Leeson, P. D., Springthorpe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+drug-like+concepts+on+decision-making+in+medicinal+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The influence of drug-like concepts on decision-making in medicinal chemistry.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 6, 881-890 (2007).</li>
<li>Lundb k, J. A., Collingwood, S. A., Ingólfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S., S, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+bilayer+regulation+of+membrane+protein+function%3A+gramicidin+channels+as+molecular+force+probes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes.</a> J. R. Soc. Interface. 7, 373-395 (2010).</li>
<li>Moore, H. P. &amp, Raftery, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+spectroscopic+studies+of+cation+translocation+by+Torpedo+acetylcholine+receptor+on+a+time+scale+of+physiological+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Direct spectroscopic studies of cation translocation by Torpedo acetylcholine receptor on a time scale of physiological relevance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77, 4509-4513 (1980).</li>
<li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+specificity+of+the+gramicidin+channel+and+the+thallous+ion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Ionic specificity of the gramicidin channel and the thallous ion.</a> Biochim. Biophys. Acta. 401, 540-544 (1975).</li>
<li>O'Connell, A. M., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+gramicidin+channel+formation+in+lipid+bilayers%3A+transmembrane+monomer+association%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Kinetics of gramicidin channel formation in lipid bilayers: transmembrane monomer association.</a> Science. 250, 1256-1259 (1990).</li>
<li>Søgaard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAA+receptor+function+is+regulated+by+lipid+bilayer+elasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">GABAA receptor function is regulated by lipid bilayer elasticity.</a> Biochemistry. 45, 13118-13129 (2006).</li>
<li>Waring, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+optimum+lipophilicity+and+molecular+weight+ranges+for+drug+candidates-Molecular+weight+dependent+lower+logD+limits+based+on+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">Defining optimum lipophilicity and molecular weight ranges for drug candidates-Molecular weight dependent lower logD limits based on permeability.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 2844-2851 (2009).</li>
</ol>

יישום הפטנט הזמני שמכסה את השיטות המתוארות בכתב היד הוגשה. שיתוף הממציאים הם HII ו OSA.

יש לנו הפגינו assay מהיר הקרינה מבוססי לקביעת פוטנציאל bilayer שינוי של תרופות amphiphiles קטנים אחרים. תרכובות לשנות את מאפייני bilayer צפויים לשנות חלבון קרום לתפקד באופן עקיף, ספציפי, אולי תורם &quot;מחוץ היעד&quot; השפעות התרופה. Assay מנצל את כוחו של ערוצי gramicidin כמו בדיקות לשינויים המאפיינים bilayer 12 כי הם חשו על ידי bilayer-פורש חלבונים. התוצאות שהושגו באמצעות assay הקרינה מבוססי הם בהסכם טוב עם תוצאות חד ערוץ ניסויים GA 12, המציין כי בשיטה זו ני...

<table><tbody><tr><td>ANTS</td><td>Invitrogen</td><td>A-350</td><td></td></tr><tr><td>גרמיצידין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-5002</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850398C</td><td></td></tr><tr><td>ערכה למיני-אקסטרודריה</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>עמודת הסמכה PD-10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54805</td><td></td></tr></tbody></table>

gramicidin מבוססי assay פלואורסצנטי; לקביעת מולקולות קטנות פוטנציאל שינוי מאפייני bilayer ליפידים

Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

תרופות רבות מולקולות קטנות אחרות נהגו לווסת את הפונקציה הביולוגית הם amphiphiles כי לספוג בממשק bilayer / הפתרון ובכך לשנות את מאפייני bilayer השומנים. זה חשוב כי חלבונים בממברנה הם מצמידים במרץ bilayer המארח שלהם על ידי אינטראקציות הידרופוביות. שינויים במאפייני bilayer ובכך לשנות את חלבון קרום פונקציה, אשר מספק דרך עקיפה amphiphiles לווסת את תפקוד החלבון ומנגנון אפשרי &quot;מחוץ היעד&quot; השפעות התרופה. פיתחנו בעבר assay אלקטרו לאיתור שינויים במאפייני bilayer השומנים באמצעות ערוצים gramicidin ליניארי כמו בדיקות 3,12. ערוצי Gramicidin הם מיני חלבונים שהוקמה על ידי dimerization transbilayer של שתי יחידות משנה שאינם מנהלים. הם רגישים לשינויים בסביבה הממברנה שלהם, מה שהופך אותם בדיקות עוצמה עבור ניטור שינויים במאפייני bilayer שומנים כמו חש ידי חלבונים bilayer פורש. אנחנו עכשיו להפגין assay הקרינה לאיתור שינויים במאפייני bilayer באמצעות אותם ערוצי בדיקות. Assay מבוססת על מדידת זמן מהלך מרווה פלואורסצנציה מ fluorophore טעון שלפוחית ​​unilamellar גדול בשל כניסתם של מרווה בצינורות gramicidin. אנו משתמשים זוג הקרינה אינדיקטור / מרווה 8-aminonaphthalene-1-,3,6 trisulfonate (נמלים) / טי + כי שימש בהצלחה אחרות מבחני מרווה פלואורסצנציה 5,13. טי + מחלחלת לאט bilayer השומנים 8 אך עובר בקלות דרך מנהל ערוצי gramicidin 1,14. השיטה היא מדרגי מתאים גם מחקרים מכניסטית תפוקה גבוהה ההקרנה של מולקולות קטנות עבור מביך-bilayer, ואת הפוטנציאל &quot;מחוץ היעד&quot;, אפקטים. אנו מוצאים כי התוצאות בשיטה זו הן בהסכם טוב עם תוצאות אלקטרו הקודם 12.

אנחנו מציגים את assay מהיר הקרינה מבוססי המנטרת את קצב מרווה פלואורסצנציה כמדד לפעילות ערוץ gramicidin. ערוצי gramicidin משמשים מתמרים כוח מולקולרית כדי לעקוב אחר שינויים במאפייני bilayer שומנים כמו חש ידי חלבונים bilayer פורש.

Gramicidin מבוססי Assay פלואורסצנטי; לקביעת מולקולות קטנות פוטנציאל שינוי מאפייני bilayer ליפידים

תרופות רבות ומולקולות קטנות אחרות המשמשות לוויסות תפקוד ביולוגי הן אמפיפיילים שנספחים בממשק שבין השכבה הכפולה לתמיסה ובכך משנים...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא למדוד שינויים בתכונות השכבה הכפולה המושרים על ידי תרופה, כפי שהם נתפסים על ידי חלבונים החוצים את השכבה הכפולה. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת LUVs חד-צדדיים טעונים ב-Fluor. השלב השני של הפרוצדורה הוא הוספת gramin לוזיקולות.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא הוספת משתיק חיצוני ומדידת קצב השתיקה של הפלואורופור הפנימי. ארבע. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא כימות השינוי בשתיקת הפלואורסצנציה ביחס לפעילות הגרמין, על ידי התאמת פונקציית מעריך מתוחה (stretched exponential function) למהלך הזמן של הפלואורסצנציה. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות להערכה אם amfi files יכולים לשנות את תכונות השכבה הליפידית הכפולה.שלום, אני אולה אנדרסון. שלום, אני הלסון. היי, אני ריצ'י קאפו.ואני ליה סנפורד מהמעבדה של ד"ר אולף אנדרסון במחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה ב-Weill Cornell Medical College. היום נדגים לכם פרוצדורה למדידת שינויים בתכונות של שכבות ביו-ליפידיות. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדתנו כדי לחקור את ההשפעות של תרופות ומולקולות קטנות על תכונות של שכבות ביו-ליפידיות.בואו נתחיל. ביום הראשון של פרוצדורה זו, הוציאו את הליפיד מהמקפיא והניחו לו להגיע לטמפרטורת החדר. לאחר ההשוואה לטמפרטורה, הוסיפו 0.6 milliliters של תמיסת ליפיד וכלורופורם בריכוז 25 milligrams per milliliter לבקבוק תחתית עגולה של 25 milliliters. לאחר מכן, ייבשו את התמיסה תחת גז חנקן תוך סיבוב רציף של הבקבוק עד שכל הכלורופורם יתאדה.שכבה דקה ולבנה של ליפידים מצפה את כל החלק התחתון של הבקבוק; ייבשו את הליפידים עוד יותר בדססיקטור תחת ואקום למשך לילה. הכינו תמיסה של 100 millimolar sodium nitrate, 25 millimolar ANTS ו-10 millimolar HEPs ב-pH 7. בעת כיוון ה-pH של תמיסה זו, הימנעו משימוש בתמיסות המכילות כלוריד.כיוון שהמכבה (Quencher) טליום יוצר קומפלקס בלתי מסיס עם הכלוריד ביום השני, יש להמיס מחדש את הליפידים ב-1.67 מיליליטר של תמיסת אלקטרוליט זו כדי לקבל סספנזיית ליפידים בריכוז 10 millimolar. לאחר הגעה לריכוז הנכון, יש לכסות ב-para film ולערבב את הסספנזיה היטב במכשיר vortex, להגן על הדגימה מאור באמצעות נייר אלומיניום ולהניח לה להתבגר בטמפרטורת החדר למשך הלילה.ביום השלישי, בצעו סוניקציה לתערובת למשך דקה אחת במכשיר סוניקטור בעוצמה נמוכה. לאחר מכן, בצעו למדגם הפשרה והקפאה (freeze-thaw) על ידי השהייה של חמש דקות על קרח יבש, ולאחריה חמש דקות במים חמים; חזרו על מחזור ההקפאה וההפשרה ארבע עד חמש פעמים. בצעו אקסטרוזיה לתלי השומנים באמצעות mini extruder של חברת Avanti.הכינו את המיני-אקסטרודר (mini extruder) עם מסנן פוליקרבונט של 0.1 מיקרון ותומכי מסנן; בצעו אקסטרוזיה של הסספנזיה הלוך ושוב 21 פעמים, כך שתתקבל סספנזיה שקופה למדי במזרק הנגדי, ובכך תיווצר סספנזיה של וסיקולות גדולות (LUV - large unilamellar vesicles). הסירו ANTS חיצוני על ידי העברת הסספנזיה שעברה אקסטרוזיה דרך עמודת PD 10 ששומששה עם בופר נתרן. הוסיפו לעמודה 1.5 מיליליטר של סספנזיית ה-LUV בתוספת מיליליטר אחד של בופר נתרן.לאחר שהתמיסה נספגה במלואה בעמודה, בצעו אלוציה של הליפוזומים באמצעות שלושה מיליליטר של בופר נתרן ואספו את התמיסה שנשטפה. תמיסת המלאי של LUV ממולאים ב-A NTS שנוצרה צריכה להכיל כ-4 עד 5 מילימולר ליפיד ולהיראות שקופה-לבנה.הגנו על התמיסה מפני אור באמצעות נייר אלומיניום ואחסנו אותה בטמפרטורה של 13 °C. 24 שעות לפני השימוש, ערבבו היטב באמצעות vortex. תמיסת מלאי של LUV ממולאת ב-A NTS. מכיוון של-UUVs יש צפיפות הגבוהה מ-1 g/mL, הם עלולים לשקוע.לאחר מכן, דללו את תמיסת המלאי של ה-LUV הממולאים ב-A NTS ביחס של 1:20 עם בופר נתרן. דגרו שלושה רבעים מהליפוזומים עם 260 nanogram של abidin ב-DMSO. הוסיפו את אותו הנפח של DMSO ללא gramin לרבע הנותר.כדי לשמור על ריכוז ממס קבוע בכל הדגימות, יש להמתין עד שה-gramin יגיע לשיווי משקל בין השכבות המונימולקולריות הפנימיות והחיצוניות של וסיקולות הליפידים למשך 24 שעות בטמפרטורה של 13 degrees Celsius. לשם כך, נעשה שימוש בספקטרו-פלואורימטר מסוג stopped flows דגם applied photophysics SX point 20 עם בקרת טמפרטורה, כדי למדוד את קצב כיבוי הפלואורסצנציה. לתחילת העבודה, הפעילו את המכשירים שעה מראש כדי לאפשר להם להתחמם.הסבך עם הדיווחים עבור העירור צריך להיות one slash one ויש להשתמש במסנן מעביר גבוה של 455 nanometer להקלטת הפליטה באמצעות תוכנת pro data SX. הגדירו תחילה את תנאי ההקלטה, והגדירו את אורכי גל העירור של המונוכרומטור ל-352 nanometer. השתמשו בהגדרת pressure hold.הגדירו את הזמן לשנייה אחת ואת מספר הנקודות ל-5,000. התאימו את מספר החזרות לתשעה עבור הרצות באפר ול-13 עבור הרצות עם ממתן (quencher). עקבו אחר הטמפרטורה בפרופיל בדיקת ההנעה של תוכנת Essex.יש להגדיר את נפח ההנעה ל-120 µL, המהווים תערובת של 60 µL מכל מזרק. הגדרה זו נותנת זמן מת של כ-1.2 ms. יש לכוון את המתח הגבוה או את ההגבר של גלאי הפלואורסצנציה לכ-420 V.המטרה היא להגיע לקריאת פלואורסצנציה של כ-שמונה; יש להביא את ה-UUVs הטעונים ב-NTS שהוכנו קודם לכן למצב של שיווי משקל במשך 10 דקות ב-25 degrees Celsius בחשיכה. לאחר הגעתם לשיווי משקל, יש לערבב את הדגימה בוורטקס, ולאחר מכן להטעין אותה למזרק השמאלי. למזרק הימני יש להטעין או sodium buffer או thallium Quencher.הסר בועות אוויר על ידי דחיפת המזרקים קדימה ואחורה. שני המזרקים צריכים להיות טעונים באופן שווה. לפני סגירת השסתומים עבור הדגימה הראשונה, רשום את הפלואורסצנציה עם בופר נתרן.חזור על הפעולה ארבע פעמים וכוונן את ההגבר (gain) לפי הצורך. לאחר מכן, חזור על הפעולה חמש פעמים נוספות עבור שאר הדגימות. רשום תשע חזרות עם בופר נתרן.החליפו את תחליל הנתרן במכבה התליום והקליטו 13 חזרות. שטפו במים והמשיכו לבקרות הדגימות הבאות. כללו דגימות ללא gramin ועם ממס, ודגימות ללא gramin עם ריכוז התרכובת המקסימלי.לאחר ביצוע בדיקת הפלואורסצנציה עבור ה-gramin והממס, הזינו את הנתונים לתוכנת MATLAB לצורך ניתוח. עבור כל דגימה, קראו את כל חזרות הבאפר והמעכב (quencher); ארבע החזרות הראשונות יהיו מזוהמות על ידי מה שהיה קודם לכן בצינוריות. במקרה זה, האות נובע מערבוב של דגימת באפר נתרן עם מים משטיפה קודמת.חזרות חמש עד תשע מייצגות את האות מהדגימה לבדה. לכן, אנו תמיד מחריגים את ארבע החזרות הראשונות בכל מקרה. כדי למנוע ארטיפקטים של ערבוב, עברו ידנית על העקבות והסירו חזרות פגומות, כגון העקבה האדומה המכילה קפיצות או סטיות הנובעות מארטיפקטים של ערבוב ו/או בועות.לאחר מכן, נרמלו את החזרות של המהוון (quencher) לממוצע ערכי ההתחלה של חזרות הבאפר עבור כל דגימה בכל תנאי ניסוי, ושלבו את הממוצעים של כל הדגימות לגרף אחד של דגימות ויזואליזציה; דגימות ללא gramine צריכות להיות דומות ולהראות כמעט ללא כיבוי פלואורסצנציה. קיימת הפחתה איטית באות הפלואורסצנציה עקב כניסה איטית של יוני thallium לתוך הוזיקולות עבור דגימות עם gram sidin. אם מהלך הזמן הפלואורסצנטי השתנה באופן נראה לעין על ידי התרכובת, הרי שהתרכובת משנה את תכונות השכבה הליפידה הד双ית בריכוז שנבדק; לאחר מכן, התאימו פונקציית מעריכי מתוח (stretched exponential) ל-100 המילי-שניות הראשונות של עקומות כיבוי הפלואורסצנציה המנורמלות.עבור החזרות הבודדות, חשבו את הקצב בשני מילישניות. לאחר מכן, חשבו את הממוצעים וסטיות התקן עבור דגימה נתונה מתוך החזרות הבודדות. השפעת ה-capsaicin, המסומן כאן כ-cap, נבחנה על פני מהלך הזמן של כיבוי פלואורסצנציה (fluorescent quenching) בהיעדרו או בנוכחותו של gramin, המסומן כ-ga; אות הפלואורסצנציה הנורמליזציה מוצג כאן לאורך שנייה אחת. נקודות אפורות מייצגות תוצאות מכל החזרות, בעוד שהקווים האדומים הם הממוצעים.מוצגים 100 המילישניות הראשונות של אות הפלואורסצנציה הנורמלי. הנקודות האפורות הן תוצאות מחזרה בודדת עבור כל תנאי. הקווים האדומים הם התאמות אקספוננציאליות מתוחות (stretched exponential fits) לחזרות אלו.הקו הכחול המקווקו מסמן את נקודת השנייה השנייה (2 ms). זהו הזמן שבו נקבע קצב ההחסום (quenching). השינוי היחסי בקצב החסום נקבע על ידי נרמול הנתונים אל מול דגימת הביקורת עם gramin ללא מודיפיקטור.כאשר קפסאיצין נספח לשכבה הליפידית הכפולה, הוא משנה את תכונותיה. השינוי לכיוון שכבה רכה יותר יבוא לידי ביטוי כהסטה בצד הגרם בשיווי המשקל בין מונומר לדימר, לטובת הדימר המוליך. הרגע הצגנו בפניכם פרוצדורה למדידת השפעות ההפרעה של מולקולה קטנה על השכבה הכפולה.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשתמש בביקורות המתאימות לכל ניסוי תוך שימוש באותה סבב של וזיקולות. זהו כל הפרוצדורה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

gramicidin-based-fluorescence-assay-for-determining-small-molecules

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

חלבון ממברנה פונקציה מוסדר על ידי הרכב קרום התא השומנים. זה וידאו המאמר מפרט כיצד ליצור תיקון באמצעות אלקטרודות תיקון bilayer, כמו גם כיצד להשתמש ערוצי gramicidin כמו כתבים של תכונות הממברנה משתנה.

שיטות מולקולה בודדת עבור ניטור שינויים ב bilayer תכונות אלסטיות

בזמן אמת ההקרנה הליך לזיהוי סמים כי אינטראקציה עם חלבון G-מגודרת פנימה מיישר...

Assay הקרנת פלורסנט לזיהוי מאפננים של ערוצים GIRK

בסרטון זה, אנו מדגימים אינטראקציות חלבון-פוספואינסיטיד בתבנית מיקרופלואידית באמצעות בדיקת אפנון pH, באמצעות צבע פלואורסצנטי רגיש ל-pH המתויג לשומנים פוספטידיל-אתנולמין של דו-שכבה ליפידית נתמכת, הנקראת פלטפורמה מיקרופלואידית. המודולציות ב- pH לאחר קשירת חלבון לפוספוליפידים גורמות למרווה פלואורסצנטית.

בדיקת אפנון pH על שכבות שומנים נתמכות לזיהוי אינטראקציות חלבון-פוספואינסיטיד

אנו מדגימים מערכת היווצרות bilayer שומנים שאפשר לשמור, יבילה. קרום bilayer השומנים יכול להיווצר בתוך שעה 1 עם למעלה מ -80% אחוזי הצלחה כאשר מבשר קרום קפוא מובא טמפרטורת הסביבה. מערכת זו תפחית תהליכי מייגע ומומחיות הקשורים תעלות יונים.

גיבוש ליפידים אוטומטי bilayer ממברנה באמצעות סרט polydimethylsiloxane רזה

כאן נתאר של תפוקה גבוהה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית assay המודד קרום פלזמה חתימת יעילה באמצעות ניתוחים fluorometric, הדמיה בתאים חיים. Assay הזה יכול לשמש לסינון סמים או היעד גנים המווסתים קרום פלזמה חתימת בתאי יונקים.

תפוקה גבוהה מדידה של קרום פלזמה חתימת יעילות בתאים בתרבית

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של ליפוזומים וכיצד ניתן להשתמש בקיבוע על פני השטח ולעבור באופן אינדיבידואלי בצורה מקבילה מסיבית תוך שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. הדבר מאפשר לכמת את הגודל והאחידות בין ליפוזומים בודדים של האוכלוסייה.

מיקרוסקופ כמותי מיקרופלואורסצנטית בודד מבוססי ליפומה שיטת הזיהוי של הומוגניות בין ליפוזומים בודדים

בדיקת דליפת הפלואורסצנטיות היא שיטה פשוטה המאפשרת לחקור אינטראקציות פפטיד/ממברנה על מנת להבין את מעורבותם במספר תהליכים ביולוגיים ובמיוחד את היכולת של פפטידים חודרי תאים להפריע לפולניידים דו-שכבתיים במהלך תהליך טרנסלוקציה תאית ישירה.

דליפת פלואורסצנטית אסאי לחקור את היציבות בקרום על ידי פפטיד חודר תאים

פרוטוקול זה מציג שיטת הדמיה פלואורסצנטית המשתמשת במחלקה של פלואורופורים ליפידים רגישים ל- pH כדי לעקוב אחר תנועת קרום השומנים במהלך אקסוציטוזה של התא ומחזור האנדוציטוזה.

מדידת תחלופת שומנים בממברנה עם ND6 אנלוגי פלואורסצנטי רגיש ל- pH

פרוטוקול זה מציג סדרה של ניסויים שאומצו להערכת פפטידים אנטי-סרטניים הניתנים להחלפה, שניתן להשתמש בהם בסינון פרה-קליני של תרכובות כאלה. זה כולל הערכת ציטוטוקסיות בתרביות תאים דו-ממדיות ותלת-ממדיות, הערכת יעילות פוטואיזומריזציה של רקמת מודל (ex vivo) ויעילות in vivo .

הערכה חוץ גופית ו-in vivo של תרכובות פעילות ביולוגיות מבוקרות - תרופות מועמדות פוטנציאליות לפוטופרמקולוגיה של סרטן

מוצג פרוטוקול ניסיוני להרכבה, גירוי חשמלי וניתוח דו-שכבתיות מממשק טיפות עם גרמיצידין A. יחסי מבנה-תפקוד בין ליפידים לחלבון נמדדים על ידי מדידת שינויים בשטח הממברנה, בזרם יוני ובהולכה חד-ערוצית, וקישור תגובות אלו לשינויים דמויי פלסטיות בהולכה יונית במודל ממברנה בהשראת סינפסות חשמליות.

אפיון מבנה תפקוד ממברנת ליפידים-חלבון באמצעות דו-שכבות ממשק טיפות

חקור שיטת מדידת שינויים בתכונות שכבת הליפידים באמצעות ערוצי גרמיצידין ומדידת קצב דעיכת פלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה של השפעת תרופות על דינמיקת הממברנה.

Gramicidin מבוססי Assay פלואורסצנטי; לקביעת מולקולות קטנות פוטנציאל שינוי מאפייני bilayer ליפידים

גלה סרטונים נוספים