Gramicidin מבוססי Assay פלואורסצנטי; לקביעת מולקולות קטנות פוטנציאל שינוי מאפייני bilayer ליפידים

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא למדוד שינויים בתכונות השכבה הכפולה המושרים על ידי תרופות, כפי שהם נתפסים על ידי חלבונים החוצים את השכבה הכפולה. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת sles חד-צדדיים גדולים הטעונים ב-Fluor. השלב השני של הפרוצדורה הוא שיבוץ של gramin בתוך הוזיקולות.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא הוספת משקיט חיצוני ומדידת קצב השקיטה של הפלואורופור הפנימי. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא כימות השינוי בשקיטת הפלואורסצנציה ביחס לפעילות הגרמין, באמצעות התאמת פונקציית אקספוננציאל נמתח (stretched exponential function) למהלך הזמן של הפלואורסצנציה. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות להערכה האם amfi files יכולים לשנות תכונות של שכבת ליפיד דו-שכבתית.

שלום, אני אולה אנדרסון. שלום, אני הלסון. היי, אני ריצ'י קאפו.

ואני ליה סנפורד מהמעבדה של ד"ר אולף אנדרסון במחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה ב-Weill Cornell Medical College. היום נראה לכם פרוצדורה למדידת שינויים בתכונות של שכבות ביליפידיות. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדתנו כדי לחקור את השפעותיהם של תרופות ומולקולות קטנות על תכונות של שכבות ביליפידיות.

בואו נתחיל. ביום הראשון של הליך זה, הוציאו את הליפיד מהמקפיא והניחו לו להגיע לטמפרטורת החדר. לאחר ההשגעה, הוסיפו 0.6 milliliters של תמיסת ליפיד וכלורופורם בריכוז 25 milligrams per milliliter לבקבוק תחתית עגולה בנפח 25 milliliters. לאחר מכן, ייבשו את התמיסה תחת גז חנקן תוך כדי סיבוב רציף של הבקבוק עד שכל הכלורופורם יתאדה.

שכבה לבנה ודקה של ליפידים מצפה את כל החצי התחתון של הבקבוק; ייבשו את הליפידים עוד יותר בדסיקטור תחת ואקום למשך לילה. הכינו תמיסה של 100 millimolar סודיום ניטראט, 25 millimolar ANTS ו-10 millimolar HEPes ב-pH 7. בעת כיוון ה-pH של תמיסה זו, הימנעו משימוש בתמיסות המכילות כלוריד.

מכיוון שמעכב התליום (thallium Quencher) יוצר קומפלקס בלתי מסיס עם הכלוריד ביום השני, יש להחזיר את הליפידים למצב הידרטי באמצעות 1.67 מיליליטר של תמיסת אלקטרוליטים זו כדי לקבל תגלוש ליפידים בריכוז 10 millimolar. לאחר הגעה לריכוז הנכון, יש לכסות ב-para film ולערבב את התגלוש היטב ב-vortex, להגן על הדגימה מהאור באמצעות נייר אלומיניום ולהניח לה להתבשלה בטמפרטורת החדר למשך לילה.

ביום השלישי, בצעו סוניקציה לתערובת למשך דקה אחת במכשיר סוניקטור בעוצמה נמוכה. לאחר מכן, בצעו הקפאה והפשרה לדגימה על ידי הצבתה למשך חמש דקות על קרח יבש, ולאחריה חמש דקות במים חמימים; חזרו על מחזור ההקפאה וההפשרה ארבע עד חמש פעמים. בצעו אקסטרוזיה לתסחיף הליפיד באמצעות Avanti mini extruder.

הכינו את המיני-אקסטרודר עם מסנן פוליקרבונט של 0.1 מיקרון ותומכי מסנן; בצעו אקסטרוזיה של התמיה הלוהית הלוך וחזור 21 פעמים, כך שתמיה שקופה למדי תגיע למזרק הנגדי, ובכך תיווצר תמיה של וזיקולות גדולות לאי-חוזרות (LUV). הסירו חומרי גלם שאינם רצויים (external A NTS) על ידי העברת התמיה שעברה אקסטרוזיה דרך עמודת PD 10 שעברה שיווי משקל עם בופר נתרן. הוסיפו לעמודה 1.5 מיליליטר של תמיחת ה-LUV פלוס מיליליטר אחד של בופר נתרן.

לאחר שהתמיסה נספגה במלואה בעמודה, בצעו אלוציה של הליפוזומים באמצעות שלושה מיליליטר של sodium buffer ואספו את התוצר (eluate). תמיסת המלאי של ה-LUV המלאים ב-A NTS שנוצרה צריכה להכיל כ-ארבעה עד חמישה מילימולאר ליפיד ולהיראות שקופה-לבנה.

הגנו על התמיסה מהאור באמצעות נייר אלומינום ואחסנו בטמפרטורה של 13 degrees celsius. 24 שעות לפני השימוש, ערבבו היטב באמצעות וורטקס (vortex). תמיסת המלאי של LUV מלאה ב-A NTS. מכיוון שצפיפותם של UUVs גדולה מ-1 gram per milliliter, הם עלולים לשקוע.

לאחר מכן, דוהלו את תמיסת המלאי של ה-LUV הממולאים ב-A NTS ביחס של 1:20 עם בופר נתרן. דגרו שלושה רבעים מהליפוזומים עם 260 nanogram של abidin ב-DMSO. הוסיפו את אותו הנפח של DMSO ללא gramin לרבע הנותר.

כדי לשמור על ריכוז ממס קבוע בכל הדגימות, יש לאפשר ל-gramin להגיע לשיווי משקל בין השכבות המונימולקולריות הפנימיות והחיצוניות של וסיקולות הליפידים למשך 24 שעות בטמפרטורה של 13 degrees Celsius. לשם כך, נעשה שימוש בספקטרו-פלואורימטר מסוג stopped flows דגם applied photophysics SX point 20 בעל בקרת טמפרטורה, כדי למדוד את קצב כיבוי הפלואורסצנציה. לתחילת העבודה, יש להדליק את המכשירים שעה מראש כדי לאפשר להם להתחמם.

רוחב הסדק עבור העירור צריך להיות 1/1 ויש להשתמש במסנן מעביר גבוה (high pass filter) של 455 nm להקלטת פליטה באמצעות תוכנת ה-pro data SX. הגדירו תחילה את תנאי ההקלטה, והגדירו את אורכי גל העירור של המונוכרומטור ל-352 nm. השתמשו בהגדרת השמירה על הלחץ (pressure hold).

הגדירו את הזמן לשנייה אחת ואת מספר הנקודות ל-5,000. התאימו את מספר החזרות לתשעה עבור הרצות בופר ול-13 עבור הרצות קוונצ'ר. עקבו אחר הטמפרטורה בפרופיל בדיקת ההנעה של תוכנת Essex.

יש להגדיר את נפח ההזרקה ל-120 µL, המערבבים 60 µL מכל מזרק. פעולה זו יוצרת זמן מת של כ-1.2 ms. יש לכוון את המתח הגבוה או את ההגבר של גלאי הפלואורסצנציה לכ-420 V.

המטרה היא להשיג קריאת פלואורסצנציה של כ-שמונה; יש להביא את ה-UUVs הטעונים ב-A NTS שהוכנו קודם לכן למצב של שיווי משקל במשך 10 דקות ב-25 degrees Celsius בחושך. לאחר השגת שיווי משקל, יש לערבב את הדגימה באמצעות וורטקס, ולאחר מכן להטעין אותה למזרק השמאלי. במזרק הימני יש להטעין באפר נתרן או Thallium Quencher.

הסר בועות אוויר על ידי דחיפה של המזרקים קדימה ואחורה. שני המזרקים צריכים להיות טעונים באופן שווה. לפני סגירת השסתומים עבור הדגימה הראשונה, רשום את הפלואורסצנציה עם בופר נתרן.

חזור על הפעולה ארבע פעמים וכוונן את ההגבר (gain) לפי הצורך. לאחר מכן, חזור על הפעולה חמש פעמים נוספות עבור שאר הדגימות. רשום תשע חזרות עם בופר נתרן.

החליפו את תמיסת הבאפר של הנתרן בחומר המעכב (quencher) של התליום והקליטו 13 חזרות. שטפו במים והמשיכו לבקרות של הדגימה הבאה. כללו דגימות ללא gramin ועם ממס, ודגימות ללא gramin ובריכוז המקסימלי של התרכובת.

לאחר ביצוע בדיקת הפלואורסצנציה הן עבור ה-gramin והן עבור הממיס, הזינו את הנתונים לתוכנת MATLAB לצורך ניתוח. עבור כל דגימה, קראו את כל החזרות של הבאפר והמכבה (quencher); ארבע החזרות הראשונות יהיו מזוהמות על ידי מה שהיה קודם לכן בצינורית. במקרה זה, האות נובע מערבוב של דגימת באפר נתרן עם מים משטיפה קודמת.

חזרות חמש עד תשע מייצגות אות מהדגימה בלבד. לפיכך, אנו תמיד מוסירים את ארבע החזרות הראשונות בכל מקרה. כדי למנוע ארטיפקטים של ערבוב, עברו ידנית על העקבות והסירו חזרות פגומות, כגון העקבה האדומה המכילה קפיצות או סטיות הנובעות מארטיפקטים של ערבוב ו/או בועות.

לאחר מכן, נרמלו את חזרות המכבה (quencher) לממוצע ערכי ההתחלה של חזרות הבאפר עבור כל דגימה בכל תנאי ניסוי, ושלבו את הממוצעים של כל הדגימות בגרף אחד של דגימות ויזואליזציה; דגימות ללא gramine צריכות להיות דומות ולהראות כמעט ללא כיבוי פלואורסצנציה. קיימת ירידה איטית באות הפלואורסצנציה עקב חדירה איטית של יוני thallium לתוך הוזיקולות עבור דגימות עם gram sidin. אם מהלך הזמן של הפלואורסצנציה השתנה באופן נראה לעין על ידי התרכובת, הרי שהתרכובת משנה את תכונות השכבה הליפידית הדו-שכבתית בריכוז שנבדק; בשלב הבא, התאימו פונקציית מעריכית מתוחה (stretched exponential) ל-2 עד 100 המילי-שניות הראשונות של עקומות כיבוי הפלואורסצנציה המנורמלות.

עבור החזרות הבודדות, חשבו את הקצב בשני מילישניות. לאחר מכן, חשבו את הממוצעים ואת סטיות התקן עבור דגימה נתונה מתוך החזרות הבודדות. השפעת ה-capsaicin, המסומנת כאן כ-cap, נבחנה על פני מהלך הזמן של כיבוי פלואורסצנציה (fluorescent quenching) בהיעדרו או בנוכחותו של gramin, המסומן כ-ga; האות הפלואורסצנטי הנורמל מוצג כאן על פני שנייה אחת. נקודות אפורות מייצגות תוצאות מכל החזרות, בעוד שהקווים האדומים הם הממוצעים.

מוצגים 100 המילישניות הראשונות של האות הפלואורסצנטי הנורמל. הנקודות האפורות הן תוצאות מחזרה אחת עבור כל תנאי. הקווים האדומים הם התאמות אקספוננציאליות מתוחות (stretched exponential fits) לחזרות אלו.

הקו הכחול המקווקו מסמן את נקודת השנייה השנייה. זהו הזמן שבו נקבע קצב ההחסמה (quenching). השינוי היחסי בקצב החסמה נקבע על ידי נרמול הנתונים לדגימת הביקורת עם gramin וללא משנה.

כאשר קפסאיצין נספג לשכבה הליפידית הד双ה, הוא משנה את תכונות השכבה. השינוי לכיוון של שכבה רכה יותר יבוא לידי ביטוי כהסטה של שיווי המשקל בין מונומרים לדימרים לטובת הדימר המוליך. הרגע הצגנו בפניכם פרוצדורה למדידת השפעות ההפרעה של מולקולה קטנה על השכבה הליפידית.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשתמש בביקורות המתאימות לכל ניסוי תוך שימוש באותה סדרת וזיקולות. זהו כל הפרוצדורה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.