Gramicidin מבוססי Assay פלואורסצנטי; לקביעת מולקולות קטנות פוטנציאל שינוי מאפייני bilayer ליפידים
13 באוקטובר 2010
אנחנו מציגים את assay מהיר הקרינה מבוססי המנטרת את קצב מרווה פלואורסצנציה כמדד לפעילות ערוץ gramicidin. ערוצי gramicidin משמשים מתמרים כוח מולקולרית כדי לעקוב אחר שינויים במאפייני bilayer שומנים כמו חש ידי חלבונים bilayer פורש.
המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד שינויים הנגרמים על ידי תרופות בתכונות דו-שכבתיות כפי שמורגשות על ידי חלבונים דו-שכבתיים. זה מושג על ידי ייצור תחילה של סולות חד צדדיות גדולות עמוסות פלואור. השלב השני בהליך הוא לסמם את השלפוחיות בגראמין.
השלב השלישי בהליך הוא הוספת מרווה חיצונית ומדידת קצב המרווה של הפלואורו הפנימי. ארבע. השלב האחרון של ההליך הוא לכמת את השינוי במרווה פלואור לפעילות גרמין על ידי התאמת פונקציה מעריכית מתוחה לקורס זמן הקרינה. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות כדי להעריך אם קבצי amfi יכולים לשנות את תכונות השומנים הדו-שכבתיים.
שלום, אני אולה אנדרסון. שלום, אני הלסון. היי, אני ריצ'י קאפו.
ואני לאה סנפורד מהמעבדה של ד"ר אולף אנדרסון במחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה בקולג' הרפואי וייל קורנל. היום נראה לך נוהל למדידת שינויים בתכונות השכבה הביולוגית של השומנים. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את ההשפעות של תרופות ומולקולות קטנות על תכונות השומנים הבילאריים.
אז בואו נתחיל ביום הראשון של הליך זה, הוציאו את השומן מהמקפיא ותנו לו להתייצב לטמפרטורת החדר. לאחר שיווי המשקל, הוסף 0.6 מיליליטר של 25 מיליגרם למיליליטר, תמיסת שומנים וכלורופורם לבקבוק תחתון עגול של 25 מיליליטר. לאחר מכן יבש את התמיסה תחת גז חנקן תוך סיבוב רציף של הבקבוק עד שכל הכלורופורם התאדה.
וסרט לבן דק של ליפידים מצפה את כל החצי התחתון של הבקבוק מייבש את השומן עוד יותר בייבוש תחת ואקום למשך הלילה. הכן תמיסה של 100 מילי-מולרי נתרן חנקתי 25 מילי-מולארי, A NTS ו-10 מילי-מולרי HEPs של pH שבע. בעת התאמת ה-pH של תמיסה זו, הימנע מכל תמיסות המכילות כלוריד.
מכיוון שהתליום קוונצ'ר יוצר קומפלקס בלתי מסיס עם הכלוריד ביום השני, החזר לחות לשומנים ב-1.67. מיליליטר אחד של תמיסת אלקטרוליטים זו כדי לקבל תרחיף שומנים של 10 מילי-מולארי. לאחר שהושג הריכוז הנכון, מכסים בסרט פרה ומערבולת את המתלה מגנים היטב על הדגימה מפני אור בנייר כסף ונותנים לה להתיישן בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
ביום השלישי, סוניקט את התערובת למשך דקה אחת בסוניקט בעל הספק נמוך. לאחר מכן הקפיא את הדגימה בחמש דקות על קרח יבש, ולאחר מכן חמש דקות במים חמים, חזור על מחזור ההפשרה בהקפאה ארבע עד חמש פעמים. הוצא את מתלה השומנים באמצעות מכבש מיני של Avanti.
הגדר את מכבש המיני עם מסנן פוליקרבונט 0.1 מיקרון ותומכי מסנן להוציא את המתלה קדימה ואחורה 21 פעמים כך שמתלה כמעט שקוף מסתיים במזרק הנגדי, וכתוצאה מכך שלפוחית אולרית גדולה או מתלה LUV. הסר את A NTS חיצוני על ידי הפעלת המתלה המוחצן על עמוד דולינג PD 10 שאוזן עם מאגר נתרן. הוסף 1.5 מיליליטר של תרחיף LUV בתוספת מיליליטר אחד של מאגר נתרן לעמודה.
לאחר שהתמיסה משולבת במלואה בעמודה, יש להוציא את הליפוזומים עם שלושה מיליליטר של מאגר נתרן ולאסוף את הפליטה. תמיסת מלאי LUV מלאה ב-NTS המתקבלת צריכה להכיל כארבעה עד חמישה שומנים מילי-מולאריים ולהיראות שקופה. לבן חלבי.
יש להגן על התמיסה מפני אור בעזרת נייר כסף ולאחסן בטמפרטורה של 13 מעלות צלזיוס 24 שעות לפני השימוש במערבולת יסודית. ה- NTS מילא את פתרון מלאי LUV. מכיוון שלרחפנים יש צפיפות גדולה מגרם אחד למיליליטר ו/או משקעים.
לאחר מכן יש לדלל את תמיסת מלאי ה-LUV המלאה ב-NTS. אחד עד 20 עם בופר נתרן דוגר שלושה רבעים מהליפוזומים עם 260 ננוגרם אבידין ב-DMSO. הוסף את אותו נפח של DMSO ללא גראמין לרבע הנותר.
כדי לשמור על ריכוז הממס קבוע בכל הדגימות, אפשר לגרמין לאזן בין שלפוחיות השומנים החד-שכבות הפנימיות והחיצוניות למשך 24 שעות ב-13 מעלות צלזיוס. כאן, פלואורמד ספקטרו זרימות עצור של פוטופיזיקה יישומית SX נקודה 20 עם בקרת טמפרטורה משמש למדידת קצב כיבוי הקרינה. כדי להתחיל, הפעל את המכשירים שעה לפני הזמן כדי לאפשר חימום מכשירים.
החריץ עם הדווחים לעירור צריך להיות קו נטוי אחד ויש להשתמש במסנן מעבר בגובה 4 55 ננומטר להקלטת פליטה באמצעות תוכנת pro data SX. הגדר תחילה את תנאי ההקלטה, הגדר את אורכי הגל של עירור המונוכרומטור ל-3 52 ננומטר. השתמש בהגדרת החזקת הלחץ.
הגדר את הזמן לשנייה אחת ואת הנקודות ל-5,000. התאם את מספר החזרות לתשע עבור ריצות מאגר ול-13 עבור ריצות מרווה. עקוב אחר הטמפרטורה בפרופיל כונן הבדיקה של תוכנת אסקס.
יש להגדיר את נפח הכונן ל-120 מיקרוליטר, מה שמערבב 60 מיקרוליטר מכל מזרק. זה נותן זמן מת של כ-1.2 אלפיות השנייה. כוונן את המתח הגבוה או הרווח בגלאי הקרינה לכ-420 וולט.
המטרה היא להשיג קריאת פלואורסצנטיות של כשמונה כטב"מים שהוכנו קודם לכן למשך 10 דקות ב-25 מעלות צלזיוס בחושך. לאחר שיווי משקל מערבולת הדגימה, ואז טען אותה למזרק השמאלי. בעומס המזרק הימני, או מאגר נתרן או תליום. מרווה.
הסר בועות אוויר על ידי דחיפת המזרקים קדימה ואחורה. יש לטעון את שני המזרקים באופן שווה. לפני סגירת השסתומים עבור הדגימה הראשונה, רשום פלואורסצנטיות עם מאגר נתרן.
חזור על הפעולה ארבע פעמים והתאם את הרווח לפי הצורך. לאחר מכן חזור על חמש פעמים נוספות עבור שאר הדגימות. הקלט תשע חזרות עם מאגר נתרן.
החלף את מאגר הנתרן במרווה התליום והקלט 13 חזרות. שוטפים במים וממשיכים עם בקרות הדגימה הבאות. כלול דגימות ללא גרמין ועם ממס, ללא גרמין וריכוז התרכובת המרבי.
ועם גרמין וממס לאחר בדיקת הקרינה, קרא את הנתונים לתוכנת MATLAB לניתוח. עבור כל דגימה שנקראת בכל חזרות המאגר והמרווה, ארבע החזרות הראשונות יזדהמו על ידי מה שהיה קודם לכן בצינור. במקרה זה, האות מגיע מדגימת מאגר הנתרן המתערבבת עם מים מהכביסה הקודמת.
חזרות חמש עד תשע מייצגות אות מהדגימה בלבד. לכן, אנו תמיד לא כוללים את ארבע החזרות הראשונות בכל מקרה. כדי למנוע ערבוב של חפצים, עברו ידנית על העקבות והסירו חזרות שגויות, כגון עקבות אדומות המכילות קוצים או סטיות עקב ערבוב חפצים או בועות.
לאחר מכן לנרמל את חזרות המרווה לערך ההתחלתי הממוצע של חזרות המאגר עבור כל דגימה עבור כל תנאי ניסוי, לשלב ממוצעים של כל הדגימות לגרף אחד של דגימות הדמיה ללא גרמין צריכות להיות דומות ולהראות כמעט ללא כיבוי פלואורסצנטי. יש הפחתה איטית באות הפלואורסצנטי עקב איטיות בגלל יון תליום לתוך השלפוחיות עבור דגימות עם גרם סידין. אם מהלך הזמן הפלואורסצנטי משתנה באופן ניכר על ידי התרכובת, אז התרכובת משנה את תכונות השומנים הדו-שכבתיות בריכוז שנבדק לאחר מכן מתאים לאקספוננציאלי מתוח לשתיים עד 100 אלפיות השנייה הראשונות של עקומות המרווה הקרינה המנורמלות.
עבור הפרט חוזר וחשב את הקצב בשתי אלפיות השנייה. לאחר מכן חשב את הממוצעים וסטיות התקן עבור דגימה נתונה מהפרט חוזר על השפעת הקפסאיצין המסומנת כאן כמכסה נצפתה על מהלך הזמן של מרווה פלואורסצנטית בהיעדר או נוכחות של גרמין המסומן כ-ga, האות הפלואורסצנטי המנורמל מוצג כאן על פני שנייה אחת. נקודות אפורות מייצגות תוצאות מכל החזרות ואילו הקווים האדומים מייצגים את הממוצעים.
מוצגות 100 אלפיות השנייה הראשונות של אות הפלואורסצנט המנורמל. נקודות אפורות הן תוצאה של חזרה אחת עבור כל תנאי. קווים אדומים נמתחים בהתאמות אקספוננציאליות לחזרות האלה.
הקו הכחול החנוק מציין את סימן שתי אלפיות השנייה. הזמן בו נקבע קצב המרווה. השינוי היחסי בקצב המרווה נקבע על ידי נורמליזציה של הנתונים לדגימת הבקרה עם גרמין וללא משנה.
כאשר קפסאיצין נספג בשכבת השומנים הדו-שכבתית, הוא משנה את תכונות הדו-שכבתיות. השינוי לכיוון הדו-שכבתי הרך יותר יבוא לידי ביטוי כשינוי בצד הגרם בשיווי משקל מונו דימר לטובת הדימר המוליך. זה עתה הראינו לכם נוהל למדידת ההשפעות המפריעות הדו-שכבתיות של מולקולה קטנה.
בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בבקרות המתאימות עבור כל ניסוי באמצעות אותה אצווה של שלפוחית. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג מבחן המבוסס על פלואורסצנציה לניטור פעילות ערוצי גרמיצידין (gramicidin) באמצעות מדידת קצבי כיבוי פלואורסצנציה. מטרת המבחן היא להעריך שינויים בתכונות השכבה הליפידית המושרים על ידי תרופות, כפי שהם נתפסים על ידי חלבונים החוצים את השכבה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביופיזיקה
- ביוכימיה
רקע
- תעלות גרמיצידין משמשות כמתמירים של כוח מולקולרי.
- כיבוי פלואורסצנציה הוא מדד שימושי לפעילות התעלה.
- תכונות השכבה הליפידית הכפולה הן קריטיות להבנת הדינמיקה של הממברנה.
- אינטראקציות של תרופות יכולות לשנות תכונות אלו באופן משמעותי.
מטרת המחקר
- למדידת שינויים במאפייני השכבה הכפולה המושרים על ידי תרופות.
- לשימוש בתעלות גרמיצידין (gramicidin) לצורך ניטור שינויים אלו.
- לכימות כיבוי פלואורסצנציה הקשור לפעילות הגרמיצידין.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת ספרופלסטים חד-צדדיים גדולים טעונים בצבע פלואורסצנטי.
- סימון של וזיקולות באמצעות גרמיצידין.
- הוספת מחמד (quencher) חיצוני למדידת קצבי החמידה.
- כימות שינויים בפלואורסצנציה באמצעות התאמה לפונקציית מעריכית מתוחה (stretched exponential function).
תוצאות עיקריות
- מדידה מוצלחת של קצבי כיבוי פלואורסצנציה.
- הערכה של השפעת הגרמיצידין על תכונות השכבה הליפידית הכפולה.
- הדגמה של יעילות הבדיקה בניטור פעילות התעלות.
- תובנות לגבי האופן שבו תרופות יכולות לשנות את הדינמיקה של הממברנה.
מסקנות
- הבדיקה מספקת שיטה מהירה להערכת פעילות התעלות.
- היא מציעה תובנות בעלות ערך לגבי אינטראקציות של שכבת ליפידים דו-שכבתית עם תרופות.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול חקר של חלבונים ממברנליים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודולציה עקיפה של תפקוד חלבוני ממברנה על ידי מולקולות קטנות באמצעות שינוי בתכונות השכבה הכפולה היא אתגר קריטי בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות. בדיקת פלואורסצנציה המבוססת על גרמיצידין מאפשרת זיהוי של השפעות המשבשות את השכבה הכפולה, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מנגנונית ובביטחון ניבוי לגבי פגיעות לא מכוונות (off-target). גישה ניתנת להרחבה זו מסייעת בתעדוף תיק התרכובות על ידי זיהוי תרכובות בעלות פעילות ממברנלית לא מכוונת לפני השקעה בשלבים מאוחרים יותר.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינת השפעות של מולקולות קטנות על ביופיזיקה של ממברנות הרלוונטית לתפקוד המטרה.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי חשיפת הפוטנציאל להפרעה של השכבה הכפולה במטרות לא רצויות (off-target).
- מסייע בביסוס ביטחון חיזוי בבחירת תרכובות באמצעות כימות סיכוני מודולציה עקיפה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות מבוססות וזיקולות שעברו תיקוף לסריקה בתוספת גבוהה (high-throughput screening) של תרכובות הפעילות בשכבה כפולה.
- מספק קריאות פלואורסצנציה כמותיות וסטנדרטיות לצורך הערכה הדירה.
- מאפשר הערכה מהימנה של שינויים בתכונות הממברנה המושרים על ידי תרכובות לצורך פיתוח בדיקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה ממצאים מכניסטיים למודולציה של חלבוני ממברנה הרלוונטיים למחלה, כאשר הדבר נתמך על ידי מודלים במורד הזרם (downstream).
- מספקת המשכיות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות סימון תרכובות בעלות בעיות תפקוד בממברנה.
- תומכת בהחלטות קידום מבוססות ניהול סיכונים על ידי שילוב נתונים ביופיזיקליים בתהליכי עבודה תרגומיים.
שילוב בקו תהליך (Pipeline) ובזרימת עבודה
בדיקת פלואורסצנציה זו מתאימה לממשק שבין שלבי הגילוי המוקדמים לזיהוי מובילים (lead identification), ומספקת פלטפורמה רב-פעמית לסריקה מכניסטית של מולקולות קטנות לבדיקת הפרעה בשכבה הכפולה לפני בדיקה במודלים פרה-קליניים.
- ביולוגיה של גילוי: מכמת שינויים בתכונות השכבה הכפולה המושרים על ידי תרכובות, ובכך מבהיר מנגנונים עקיפים המשפיעים על חלבוני ממברנה.
- סריקה: מציע מדידות פלואורסצנציה הניתנות לשחזור ובקנה מידה רחב לצורך ניתוח השוואתי בין ספריות של תרכובות.
- אנליטיקה: מספק קריאות מנורמלות ורובסטיות מבחינה סטטיסטית להערכה בין תנאים שונים ולקבלת החלטות.
- מחקר תרגומי: מסייע בהערכת סיכונים פרה-קליניים על ידי זיהוי תרכובות בעלות השפעות ממברנה פוטנציאליות חוץ-מטרה (off-target).
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כבדיקה גנריזבלית להערכה שוטפת של תרכובות לרוחב כל פורטפוליו הפיתוח.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף המטרה.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של זיהוי הפרעות בשכבה הכפולה עם תוצרים ניתנים לשחזור ובקנה מידה רחב.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מוקדמת יותר לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) ויעילות הונית על ידי סימון בעיות בשלב הפרה-קליני.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון ובקידום תרכובות בעלות פרופיל ממברנה נוח.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביופיזיקה של ממברנות ובתכנון בדיקות פלואורסצנציה.
- דורש גישה לפלואורימטריית stopped-flow ותשתית חזקה לניתוח נתונים.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים להכנת וסיקולות ולביצועי בקרות.
- עשוי לדרוש התאמה להרכבי ליפידים שונים או להקשרים שונים של חלבוני ממברנה.
- תלוי בנורמליזציה קפדנית ובניתוח סטטיסטי כדי להבטיח פרשנות מהימנה.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Title
0:50
Introduction
1:22
Generation of 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonate (ANTS) Filled Liposomes
4:12
Fluorescent Solution Preparation
5:02
Fluorescence Instrument Setup
6:21
Performing a Gramicidin-based Fluorescence Assay
7:34
Data Analysis
9:16
Representative Results
10:25
Conclusion
