תא יחיד transfection בעוברים צ'יק

המטרה הכוללת של הליך זה היא להזריק תאים בודדים של סומיטים אופנתיים או צינורות עצביים עם פלסמיד המקודד חלבון פלואורסצנטי ירוק. זה מושג על ידי משיכה ראשונה של פיפטות מיקרו-הזרקה בקוטר פתיחת קצה מתאים. השלב השני בהליך הוא הכנת מלאי פלסמיד לזריקות.

השלב השלישי בהליך הוא הכנת העוברים להזרקה. השלב הרביעי בהליך הוא העמסת המיקרו פיפטות ב- DNA פלסמיד. השלב האחרון בהליך הוא הזרקת הרקמות הרצויות.

בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את טווח הנגזרות במספר התאים המיוצרים על ידי אבות בעלי תווית בודדת בתת-דומיינים נבחרים של סום וצינור עצבי באמצעות מיקרוסקופיה אימונו-פלואורסצנטית. היי, אני ראל מהמעבדה של פרופסור היים במחלקה לנוירוביולוגיה רפואית באוניברסיטה העברית בירושלים. היום נראה לכם נוהל להזרקת תאים בודדים של סומיטים עוף וצינורות עצביים.

אנו משתמשים בהליך זה במעבדה כדי לחקור הפרדת קווים של תאי קרדית ותאי צינור עצבי. אז בואו נתחיל: כדי ליצור תאים בודדים שעברו טרנספטציה בעוברי אפרוחים, התחל במשיכת מיקרו פיפטות. אנו מושכים את הפיפטות שלנו על חולץ פיפטות סטנדרטי Naga PP 83 עם הגדרת חום של 13.5.

יש לכייל את ההגדרה המדויקת כדי להשיג קוטר קצה פיפטה של בין שמונה ל-10 מיקרון. אנו משתמשים בחוטים המכילים צינורות זכוכית בוריס סיליקט בקוטר חיצוני של מילימטר אחד וקוטר פנימי של 0.75 עד 0.78 מילימטרים. אתה יכול גם להשתמש במיקרו פיפטות זמינות מסחרית, חסרות חוט בקוטר חיצוני של מילימטר אחד וקוטר פנימי של 0.75 מילימטר.

הפיפטות המוכנות מאוחסנות בכלי פלסטיק כשהקצוות מוגנים מפני מגע עם קצה המנה. כדי להכין את ה-DNA למיקרו-הזרקה, הפלסמיד המעניין מועבר ל-DH חמש אלפא אי קולי. באמצעות נהלים סטנדרטיים למחרת, הפלסמיד מטוהר באמצעות ערכת הכנה מקסי להזרקות לא משובטות, אנו משתמשים בריכוז DNA של מיקרוגרם אחד למיקרוליטר.

עבור ניסויים שבהם רצויים שיבוטים בודדים, ריכוז הפלסמיד יהיה נמוך בהרבה ויהיה צורך להתאים אותו. עבור P-C-A-G-G-F-P-A ריכוז של 0.05 עד 0.1 מיקרוגרם למיקרוליטר עובד היטב. לאחר קביעת הריכוז האופטימלי, אנו ממליצים לדלל את כל מלאי הפלסמיד המטוהר ולא תכשירים בודדים לריכוז קבוע מראש.

האחרון עשוי להציג שונות מסוימת בשיעורי ההצלחה, ככל הנראה בשל שינויים בטוהר ופרמטרים אחרים, כגון שיעור הפלסמיד של סליל העל להכנת ביצים להזרקת מיקרו ביצי תרנגולות שהודגרו בשכיבה על ציריהן הארוכים עד לשלב ההתפתחותי הרצוי נשטף באתנול 70% ומניח להתייבש. לאחר מכן, חודרים את הקצה המחודד של הביצה במספריים כירורגיים. בעזרת מזרק של 10 מיליליטר ומחט בגודל 19, שואבים שני מיליליטר אלבומין מהביצה, אוטמים את החורים בפרפין חם לפני ההזרקה.

השתמש במספריים כירורגיים כדי לפתוח חלון בחלק העליון של קליפת הביצה כדי למנוע כניסת פסולת לחור. הניחו פיסת סרט מעל החלון וחתכו דרכו חור. כדי לעזור לדמיין את העובר, השתמש בנימי אש המותקנים על שואב כדי להזריק דיו לא רעיל כמו שקנאי 17 מתחת לעור המפוצץ.

לאחר מכן, גש לעובר על ידי חיתוך והסטת הממברנות החיוניות ו/או מי השפיר באמצעות סיכות חרקים של 0.14 מילימטר המותקנות על מחזיק מחט כדי להעמיס את ה-DNA לתוך הפיפטה הנמשכת Eloqua ולהוסיף כמות קטנה של אבקה ירוקה מהירה באמצעות הנימים. צייר כמות מינימלית של נימי פלסמיד בקוטר מתאים על שואב. לאחר מכן הכנס אותו לקצה הפיפטה שממול לקצה המושחז וטען את ה- DNA קרוב ככל האפשר לקצה המושחז.

לאחר מכן, חבר את הפיפטה למזרק לחץ אוויר ידני המותקן על מניפולטור מיקרו. הפעל כמות מינימלית של לחץ במידת הצורך כדי לאפשר לתמיסת הפלסמיד להגיע לקצה הפיפטה. תפעל את הפיפטה לתוך המדיום הנוזלי של הביצה תוך הפעלת לחץ אוויר כדי למנוע סתימת קצה הפיפטה.

לאחר ניקוב תחום הרקמה הרלוונטי, השינוי בלחץ מספיק לרוב כדי לשחרר את הפלסמיד עם ירוק מהיר גלוי. אם זה לא קורה, הפעל לחץ קל על המזרק עד לפליטת התערובת הירוקה המהירה של הפלסמיד. חזור על הליך זה לאורך ציר העובר לאחר ההזרקה ניתן להוסיף PBS.

לבסוף, אטמו את החלון בנייר דבק והחזירו את הביצים לחממה. הימנע מאוורור וכלול מיכלי מים קטנים בחממה כדי לסייע בשמירה על לחות ולהגדיל את התשואות. אם אתר המטרה של ההזרקה היה שטחי מספיק כדי להיות גלוי בקלות, כמו בתוך הצינור העצבי של הסומיטים הגביים או האקטודרם, ניתן למדוד את שיעור ההצלחה של הניסוי על ידי ביצוע תצפית שלמה באמצעות משקפת פלואורסצנטית.

שלב זה מועיל במיוחד להערכה אם תווית תאים רבים מדי או מעטים מדי. אם רוצים דגירה נוספת, הוסיפו אנטיביוטיקה המכילה תמיסת PBS לביצה לאחר הצפייה והחליפו את סרט התקרה. בנוסף, ניתן להעריך את שיעור ההצלחה של ההזרקה על ידי חתך סדרתי של העוברים וביצוע אימונוהיסטוכימיה.

לאחר ארבע שעות או יותר, העוברים לאחר ההזרקה מקובעים ומעובדים לחיתוך פרפין. לאחר מכן חלקים המורכבים על זכוכית מסתיימים ושיטות הגברה של Immunostain עבור הדמיה של מדווח כגון ביוטין סטרפטווידין עשויות להיות רצויות. לבסוף, החלקים הסדרתיים נסרקים כדי לזהות תאים מסומנים במקטעים מוזרקים.

אם בניסויים ראשוניים מתקבלים תאים מרובים ולא בודדים, יש לדלל את מלאי הפלסמיד בתהליך החוזר על עצמו עד להשגת תוצאות נאותות. בדרך כלל אנו מבצעים הזרקה בודדת של P-C-A-G-G-F-P לכל קרדית כזו תוך התמקדות בשישה עד 12 מקטעים לכל עובר. תחת הגדרה זו, ניתן לזהות אות ברור על ידי תצפית על הר שלם, שמונה שעות לאחר ההזרקה לפחות במקטע אחד בעובר אחד מתוך 10.

בדוגמה זו, קרדית so הוזרק עם פלסמיד מקודד GFP, וחמש שעות לאחר מכן נצפה תא פלואורסצנטי בודד במבט שלם של העובר המוצג כאן. כאשר נצפה 24 שעות לאחר ההזרקה לקרדית המרכזית, נצפה שיבוט של תאים פלואורסצנטיים בעובר רכוב שלם יומיים לאחר הזרקת שיבוט. חתך של מקטע זה חושף את נוכחותם של צאצאים משובטים הן בדרמיס והן בשריר, ומדגים כי אבות בודדים מייצרים את שתי הנגזרות.

באשר לסומיטים, ניתן גם לפגוע באבות אפיתל עצביים בודדים בצינור העצבי הגבי כפי שמודגם בקטע רוחבי זה, שצולם חמש שעות לאחר ההזרקה כאן. ניתוח חתך סדרתי גילה כי טרנספקט משובט הושג כאשר שיעור ההצלחה היה כ-10%. מצד שני, בתנאים אלה, יותר מ-93% מאירועי התיוג החיוביים נמצאו משובטים.

זה עתה הראינו לך כיצד להזריק תאים בודדים של עוברי עוף בעת ביצוע הליך זה. חשוב לזכור לדלל כמות גדולה של פלסמיד מלאי לריכוז אידיאלי לזיהומים של תאים בודדים, ולאחר מכן להשתמש בו לאורך כל הניסויים שלך. אז זהו.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.