Name: תא יחיד transfection בעוברים ציק (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-25T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: למד שיטת מיקרו-הזרקה לתא יחיד בעוברי תרנגולת ליצירת אוכלוסיות קלוניות המבטאות חלבון פלואורסצנטי ירוק. שיטה זו מאפשרת חקר תפקוד גנים בביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים שלומי קריספין עבור התמונה בצינור העצבי. בפרט, אנו מכירים יובל קינמון ליזום את הטכניקה transfection GFP. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי הקרן הלאומית למדע, אגודת Francaise contre les Myopathies ו Forschungsgemeinshaft Deutche, מרכז מחקר משותף ל 488 CK

1. הכנת micropipettes אנו למשוך pipettes שלנו על Narishige תקן PP-83 פיפטה חולץ עם הגדרת החום של 13.5. ההגדרה המדויקת חייב להיות מכויל, מכוון בקוטר טיפ פיפטה של ​​בין 8 ל 10 מיקרון. אנו משתמשים חוט המכילים צינורות זכוכית בורוסיליקט בקוטר חיצוני של 1.0 מ"מ בקוטר הפנימי של 0.75-0.78 מ"מ. Pipettes מאוחסנים ולכן בצלחת פלסטיק בקצות מוגן מפני מגע עם הקצוות של המנה. 2. ה-DNA הכנה פלסמיד של הריבית transfected לתוך DH5α E. coli באמצעות נהלים סטנדרטיים. תרבויות לינה ממושבות יחיד משמשים לטהר את הפלסמיד באמצעות maxi-מכין ערכות (כל ערכה המסחרי צריך לעשות). אנו משתמשים ריכוז הפלסמיד של 1.0 מיקרוגרם / μL שאינם משובטים זריקות. ריכוזים גבוהים יותר להגדיל את סתימת טיפים פיפטה. עבור יישומים המשובטים, ריכוזי פלסמיד הם הרבה יותר נמוך חייב להיות מותאם (ראו להלן). עבור pCAGG-GFP, ריכוז אופטימלי לייצור תוצאות המשובטים נמצאה על 0.05-0.1 מיקרוגרם / μL. אחת ל 2 μL של פלסמיד משמש בדרך כלל לכל הניסוי, כמות מזערית של אבקת מהיר ירוק (שמירה על קצה פיפטה יבשה זכוכית חדים) מתווסף הפלסמיד לפני שהניסוי יתחיל. הפלסמיד הוא centrifuged אז בצנטריפוגה השולחן במשך 2 דקות במהירות מקסימלית. הליך זה נראה להפחית פיפטה, סתימת בעיות. 3. הזרקה של עוברים 3.1 הכנת עוברים אנו משתמשים שליו כמו גם ביצי תרנגולת זריקות. הביצים מודגרות שוכב על ציר ארוך שלהם עד לשלב ההתפתחותי הרצוי. הביצים ניקה עם 70% אתנול ו להתייבש. בסוף הצביעה של הביצה הוא דקר במספריים כירורגית (זה הכרחי רק ביצי תרנגולת) ו 1 מ"ל (ב שלווים) או 2 מ"ל (חומוס) של חלבון הוא נמשך מן הביצה עם מזרק מ"ל 10 (19G מחט). החורים סגורים אז עם פרפין חם. לפני ההזרקה בפועל, חלון נפתח בחלק העליון של קליפת הביצה באמצעות מספריים כירורגיות. הנחת סרט דביק על הקליפה חיתוך דרך זה יכול לעזור להפחית את הפסולת מן הקליפה. חיץ PBS המכיל אנטיביוטיקה היא pipetted מיד לתוך הביצה. כדי לגשת את העובר ואת vitelline / או קרומי מי השפיר הם לגזור הוסט באמצעות סיכות חרקים 0.14 מ"מ מותקן על גבי מחזיק מחט. אינו רעיל דיו (שקנאי # 17) מוזרק מתחת blastoderm כדי לעזור להמחיש את העובר, באמצעות אש משך נימי רכוב על aspirator. 3.2 טוען ואת הרכבה של micropipettes Micropipettes חולץ ניתן לטעון עם הפלסמיד על ידי אש משך נימים בקוטר נאותה, רכוב על גבי aspirator. כמות מינימלית של פלסמיד נשאבים באמצעות נימי וטעון פיפטה ממול פתיחתו ועד קצה מחודד, והוא מתקרב קצה מבפנים כמה שיותר. פיפטה נטען וכתוצאה מכך על לחץ אוויר ידני מזרק רכוב על micromanipulator. לחץ מינימלי מוחלת, במידת הצורך, כדי לאפשר את פתרון פלסמיד להגיע אל קצה פיפטה. 3.3 הזרקת פלסמיד פיפטה היא מניפולציה לתוך המדיום הנוזלי של הביצה תוך יישום כמה לחץ אוויר כדי למנוע סתימת של קצה פיפטה. תחום הרקמה הרלוונטית היא פירסינג. השינוי בלחץ כמו קצה נכנס רקמה היא לעתים קרובות מספיק כדי לשחרר את הפלסמיד עם ירוק מהיר גלוי. אם זה לא המקרה, להפעיל לחץ קל על המזרק עד ירוק פלסמיד / מהר נפלטים. תהליך זה ניתן לחזור לאורך ציר של העובר, למשל somites הסמוך או לאורך היקף הצינור העצבי. בעקבות זריקות, PBS ניתן להוסיף. החלון אטום באמצעות סרט דביק (parafilm אינו רצוי במיוחד עבור שליו ביצים, הוא מגביר את שיעורי המוות העובר, ככל הנראה על ידי חסימת החליפין של חמצן דרך הקליפה). עוברים טיפול מוחזרים באינקובטור. הימנע אוורור המקום מכולות קטן עם מים בחממה כפי שהם מסייעים לשמור על התשואות לחות להגדיל. 4. התאמת פרמטרים הזרקת ניטור שיעורי ההצלחה Asessing ו כיול פרמטרים שונים זריקה קריטית עבור יישומים מכוון ניתוח מתא בודד. לא כל אירוע זריקת תוביל תיוג מוצלח של תא בודד. ריכוז פלסמיד אשר גבוה מדי עלול להוביל תיוג לא משובטים, בעוד ריכוזים נמוכים מאוד עקב שיעורי כישלון גבוהים. ריכוז של פלסמיד שהוחדר חייב להיות מותאם זריקות משובט. אנו ממליצים על דילול המניות כולו פלסמיד מטוהרים ולא דילול preps הפרט הריכוז שנקבע מראש. האחרוניםאולי להכניס קצת שונות של אחוזי ההצלחה, ככל הנראה בשל שינויים טוהר ופרמטרים נוספים כגון שיעור פלסמיד supercoiled. 4.1 הערכת שיעורי ההצלחה על ידי תצפית הר שלם הערכה ראשונית של עוברים מוזרק יכול להתבצע על ידי כל תצפית הר המשקפת תחת ניאון. שש עד שמונה שעות לאחר הזרקת מספיקים כדי להעריך את שיעורי ההצלחה עם לבנות pCAGG משופרת GFP. זה סיפק את אתר היעד היא שטחית מספיק כדי להיות ברורה ממבט ראשון (למשל somite הגבי, בצינור העצבי הגבי, וכו 'האאקטודרם, ראה איור 1A-C.). צעד זה שימושי במיוחד להערכת סדרת ניסויי בתערוכה או תאים שכותרתו יותר מדי או לחילופין, חסר כל התאים ניאון. אם הדגירה נוסף הוא הרצוי, אנטיביוטיקה המכילים פתרון PBS יש להוסיף את הביצה לאחר צפייה בקלטת איטום צריך להיות מוחלף. 4.2 clonality הערכת ידי ניתוח סדרתי, בסעיף האמצעי הטוב ביותר להערכת שיעורי זריקות מוצלחת היא סדרתי, חתך עוברים מוזרק באמצעות אימונוהיסטוכימיה לדמיין את התאים שכותרתו. בתנאים אלה, פעמים הדגירה יכול להיות קצר ככל 4 שעות לאחר ההזרקה. עוברים קבועים ומעובדים עבור חתך פרפין (או cryosectioning). זכוכית רכוב חלקים אז הם דה paraffinized ו חיסונית מוכתם להדמיה הכתב. שיטות הגברה כגון ביוטין, streptavidin עשויה להיות רצויה. לבסוף, סעיפים הסידורי נסרקים לגילוי תאים שכותרתו במגזרי מוזרק. אם על הניסויים הראשוניים מרובים יותר מאשר תאים בודדים מתקבלים, המניה פלסמיד חייב להיות מדולל והתהליך חוזר על עצמו עד תוצאות נאות מושגות. שני עד פי 10 דילולים של הפתרון מניות פלסמיד עשוי להיות נחוץ במקרים של שיעורי ההצלחה להיות גבוה מדי. עבור כל פלסמיד להיות transfected, כיול יסודית שתבטיח clonality יש לחזור. 5. נציג תוצאות אנחנו בדרך כלל לבצע הזרקה בודדת של pCAGG-GFP לכל somite, תוך מיקוד קטעים 6-12 לכל העובר 1 2. תחת הגדרה זו, אות ברור יכולים להתגלות כל הר 8 זריקה תצפית שלאחר שעות, בקטע אחד לפחות של עובר אחד מתוך עשרה. בתנאים אלה, תיוג אושרה עוד להיות משובט (איור 1 ב ', ג'). בעת שימוש בריכוזים גבוהים DNA, רוב העוברים עשוי להפגין לפחות זריקה אחת מוצלחת, מעלים את האפשרות כי מספר תאים כבר transfected. ניתוח סעיף סידורי גילה כי transfections המשובטים הושגו כאשר שיעור ההצלחה היה 10%. משמעות הדבר היא כי על מנת להשיג clonality, הטכניקה היא לפי הגדרה, לא יעיל במיוחד. מצד שני, בתנאים אלה, יותר מ 93% של אירועים תיוג חיובי נמצאו 1 משובט. <img src="/files/ftp_upload/2133/2133fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. זריקות המשובטים של pCAGGS-GFP לתוך אבות עצביים השלד. (AC) סעיפים רוחבי מראה תיוג של הצינור העצבי הגבי (NT) (א), תחום ventrolateral של dermomyotome (DM) (ב), או גיליון DM מרכזי (C) , 6hr לאחר microinjection של pCAGGS-GFP על אב אחד. (ד) יומיים לאחר transfection המשובטים של המרכזי, אבות DM יחיד שנוצר נגזרים בדרמיס שני (ד '), כמו גם שרירים (M) (ראו נ"צ. 1 לפרטים נוספים).

<ol><li>Ben-Yair, R., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+analysis+of+the+avian+dermomyotome+sheet+reveals+the+existence+of+single+cells+with+both+dermal+and+muscle+progenitor+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Lineage analysis of the avian dermomyotome sheet reveals the existence of single cells with both dermal and muscle progenitor fates.</a> Development. 132, 689-701 (2005).</li>
<li>Ben-Yair, R., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+and+bone+morphogenetic+protein+differentially+act+on+dermomyotome+cells+to+generate+endothelium%2C+smooth%2C+and+striated+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Notch and bone morphogenetic protein differentially act on dermomyotome cells to generate endothelium, smooth, and striated muscle.</a> J Cell Biol. 180, 607-618 (2008).</li>
<li>Cinnamon, Y., Kahane, N., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+early+development+of+specific+hypaxial+muscles+from+the+ventrolateral+myotome.+%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Characterization of the early development of specific hypaxial muscles from the ventrolateral myotome. </a> Development. 126, 4305-4315 (1999).</li>
<li>Stark, D. A., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+green+fluorescent+protein+as+a+single-cell+marker+in+living+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable green fluorescent protein as a single-cell marker in living embryos.</a> Dev Dyn. 233, 983-992 (2005).</li>
<li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo--from+single+cells+to+the+entire+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70, 148-154 (2002).</li>
<li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li>
<li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li>
<li>Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+integration+and+conditional+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Dev Biol. 305, 616-624 (2007).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה המתוארת לעיל הוא שינוי של טכניקה שתואר לעיל עבור אספקת צבעים lipophilic אל תת תאים קטנים או אבות חד 3. יש שלושה יתרונות עיקריים על הטכניקה electroporation סטנדרטי. ראשית, הוא מספק אמצעי עם תיוג אתרים ביטחון דיסקרטית ברקמות היעד, ומאפשר ברזולוציה מרחבית הרבה יותר מאשר electroporation (ראו איור 1B לדוגמה, C). שנית, הוא מאפשר תיוג של תאים בודדים, ובכך מאפשר להתחקות אחר שושלת היוחסין שלהם ב-vivo אחרת תחת תנאים נורמליים 1 2 (איור 1 ג, ד). שלישית, גן...

<table><tbody><tr><td>מבחנות פיפטה</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>נימיות</td><td>Drummond Scientific</td><td>2-000-100</td><td></td></tr><tr><td>מחטים לחרקים</td><td>Watkins Doncaster</td><td>E6871</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת Pen-Strep</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr></tbody></table>

תא יחיד transfection בעוברים צ&#39;יק

Single Cell Transfection in Chick Embryos

נושא מרכזי בביולוגיה התפתחותית היא גיוון של שושלות ועל הבהרת המנגנונים המולקולריים שבבסיס. זה כרוך ניתוח מעמיק של גורלם של תאים בודדים בתנאים נורמליים וניסיוני. לשם כך, שיטות transfection כי היעד אבות חד הם תנאי מוקדם. אנו מתארים כאן שיטה פשוטה מבחינה טכנית עבור transfecting תאים בודדים ברקמות עוף, אובו, המאפשר מעקב אחר השושלת אמין כמו גם מניפולציה גנטית. תחומים ספציפיים ברקמות ממוקדות בתוך somite או בצינור העצבי, ו-DNA מוזרק ישירות לתוך האפיתל של עניין, וכתוצאה מכך transfection סדירה של תאים בודדים. באמצעות כתבים, אוכלוסיות המשובטים וכתוצאה מכך עלול לייחס לתקופה של עד שלושה ימים, התנהגות של אוכלוסיות המשובטים מניפולציות גנטיות ניתן להשוות עם זה של הביקורת. שיטה זו מנצלת את הנגישות של העובר חומוס יחד עם כלים חדשים עבור מניפולציה גנטית. אנו משווים ולדון יתרונות על פני שיטת בשימוש נרחב electroporation, יישומים אפשריים לשימוש ב-vivo מודלים נוספים הציעו גם הם. אנחנו תומכים את השימוש בשיטה זו כתוספת משלימים משמעותי על השושלת התחקות קיימים כלי התערבות גנטית.

באמצעות קצה בסדר micropipettes אנו מזריקים פלסמיד דנ&quot;א לתוך תחומי משנה של somites עוף או צינורות עצביים. ריכוז של פלסמיד מותאם לייצר תאים transfected יחיד. לאחר מכן, אנו מאפשרים לתאים להתפתח אוכלוסיות משובט.

נושא מרכזי בביולוגיה של ההתפתחות הוא הגיוון של שורות תאיים (lineages) והבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיסו. דבר זה כרוך ב...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להזריק לתאים בודדים של סומיטים או צינורות עצביים של אפרוחים פלסמיד המקודד לחלבון פלואורסצנטי ירוק. פעולה זו מבוצעת תחילה על ידי מתיחת פיפטות למיקרו-הזרקה בעלות קוטר פתח קצה מתאים. השלב השני של הפרוצדורה הוא הכנת תמיסת מלאי של פלסמיד להזרקות.השלב השלישי של הפרוטוקול הוא הכנת העוברים להזרקה. השלב הרביעי של הפרוטוקול הוא טעינת המיקרו-פיפטות ב-plasmid DNA. השלב הסופי של הפרוטוקול הוא הזרקה לרקמות הרצויות.בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את טווח הנגזרות במספר התאים המיוצרים על ידי תאי אב מסומנים בודדים בתתי-תחומים נבחרים של הסומייט והצינור העצבי באמצעות מיקרוסקופיה אימונופלורסצנטית. היי, אני רעל מהמעבדה של פרופסור היים במחלקה לנוירוביולוגיה רפואית באוניברסיטה העברית בירושלים. היום נראה לכם הליך להזרקת תאים בודדים של סומייטים וצינורות עצביים של עוף.אנו משתמשים בהליך זה במעבדה כדי לחקור הפרדה של שורות בתאי מייט (mite) ובתאי צינור העצבים. אז בואו נתחיל. כדי להפיק תאים בודדים שעברו טרנספקציה בעוברים של אפרוח, התחילו במשיכת מיקרו-פיפטות. אנו מושכים את הפיפטות שלנו באמצעות מכשיר משיכה סטנדרטי מסוג Naga PP 83 עם הגדרת חום של 13.5.יש לכייל את ההגדרה המדויקת כדי להגיע לקוטר חוד פיפטה שבין 8 ל-10 מיקרון. אנו משתמשים בסיבי צינורות זכוכית בוריסילקט בעלי קוטר חיצוני של 1 מילימטר וקוטר פנימי של 0.75 עד 0.78 מילימטר. ניתן להשתמש גם במיקרו-פיפטות זמינות מסחרית, ללא סיב בעל קוטר חיצוני של 1 מילימטר וקוטר פנימי של 0.75 מילימטר.הפיפטים המוכנים נשמרים בתוך צלחת פלסטיק, כאשר הטיפים מוגנים ממגע עם דפנות הצלחת. כדי להכין את ה-DNA להזרקה מיקרוסקופית (microinjection), הפלסמיד הרלוונטי מותמר לתוך DH5α E. coli. למחרת, באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים, הפלסמיד מטוהר באמצעות ערכת Maxi prep; עבור הזרקות שאינן קלונליות, אנו משתמשים בריכוז DNA של 1 µg/µL.עבור ניסויים שבהם נדרשים שיבטים בודדים, ריכוז הפלסמיד יהיה נמוך בהרבה ויש יהיה להתאימו. עבור P-C-A-G-G-F-P-A, ריכוז של 0.05 עד 0.1 microgram per microliter עובד היטב. ברגע שנקבע הריכוז האופטימלי, אנו ממליצים לדלל את כל מלאי הפלסמיד המטוהר לריכוז שנקבע מראש, במקום לדלל דגימות בודדות.האחרון עשוי להחדיר שונות מסוימת בשיעורי ההצלחה, ככל הנראה עקב הבדלים בדרגת הטוהר ובפרמטרים אחרים, כגון היחס של פלסמיד supercoil. כדי להכין ביצי תרנגולת להזרקה מיקרוסקופית, ביצים שדגרו כשהן מונחות על הציר האורכי שלהן עד לשלב ההתפתחות הרצוי, מנוגבות ב-70% ethanol ומושארות לייבוש. לאחר מכן, יש לנקב את הקצה המחודד של הביצה בעזרת מספריים כירורגיים. באמצעות מזרק של 10 milliliter ומחט במידה 19 gauge, שואבים שני milliliters של albumin מהביצה, ואוטמים את החורים בפרפין חם לפני ההזרקה.השתמשו במספריים כירורגיים כדי לפתוח חלון בחלקו העליון של קליפת הביצה כדי למנוע מחלקיקים לחדור דרכו. הדביקו פיסת סרט דביק מעל החלון וחתכו דרכה חור. כדי לסייע בויזואליזציה של העובר, השתמשו בנימה קפילרית שנמשחה באש ומותקנת על אספירטור כדי להזריק דיו לא רעיל, כגון pelican 17, מתחת לדרמיס שהוסר.בשלב הבא, השג את הגישה לעובר על ידי חיתוך והרחקה של קרומי השליה ו/או קרומי השרירית (amniotic membranes) באמצעות סיכות חרקים בקוטר 0.14 millimeter המורכבות על מחזיק מחטים, כדי להטעין את ה-DNA לתוך פיפטת ה-Eloqua המשוכה, והוסף כמות קטנה של אבקת fast green באמצעות קפילרה. שאב כמות מינימלית של פלסמיד לתוך קפילרה בקוטר מתאים המחוברת לשואב (aspirator). לאחר מכן, הכנס אותה לקצה הפיפטה שנגדי לקצה המחודד, והטען את ה-DNA קרוב ככל האפשר לקצה המחודד.בשלב הבא, חברו את הפיפטה למזרק לחץ אוויר ידני המותקן על מיקרו-מניפולטור. הפילו כמות מינימלית של לחץ במידת הצורך כדי לאפשר לתמיסת הפלסמיד להגיע לקצה הפיפטה. תמנו את הפיפטה אל תוך התווך הנוזלי של הביצה תוך הפעלת לחץ אוויר כדי למנוע סתימה של קצה הפיפטה.ברגע שנוקב התחום הרלוונטי ברקמה, השינוי בלחץ לרוב מספיק כדי לשחרר את הפלסמיד עם ה-fast green הנראה לעין. אם הדבר אינו קורה, הפעל לחץ קל על המזרק עד שהתערובת של הפלסמיד וה-fast green נדחפת החוצה. חזור על הליך זה לאורך ציר העובר; לאחר ההזרקה ניתן להוסיף PBS.לבסוף, אטמו את החלון בעזרת סרט דביק והחזירו את הביצים לדגירה. הימנעו מאוורור והניחו מיכלים קטנים של מים בתוך האינקובטור כדי לסייע בשמירה על הלחות ולהגדיל את התוצאות. אם אתר ההזרקה המיועד היה שטחי מספיק כדי להיות גלוי בקלות, כגון בתוך ה-dorsal somites, ה-neural tube או ה-ectoderm, ניתן למדוד את שיעור ההצלחה של הניסוי באמצעות תצפית whole mount בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בינוקולרי.שלב זה מועיל במיוחד להערכה אם תויכו תאים רבים מדי או מעט מדי. אם רצוי לבצע דגירה נוספת, יש להוסיף לביצה תמיסת PBS המכילה אנטיביוטיקה לאחר הצפייה ולהחליף את סרט האיטום העליון. בנוסף, ניתן להעריך את שיעור ההצלחה של ההזרקה באמצעות חיתוך סדרתי של העוברים וביצוע אימונוהיסטוכימיה.לאחר ארבע שעות או יותר מההזרקה, מקבעים את העוברים ומעבדים אותם לחתכים בפראפין. לאחר מכן, מסירים את הפראפין מחתכים המורכבים על זכוכית ומבצעים צביעה אימונוהיסטוכימית לוויזואליזציה של החלבון המדווח; ייתכן ששיטות הגברה כגון biotin streptavidin יהיו רצויות. לבסוף, סורקים את החתכים הסדרתיים כדי לזהות תאים מסומנים במקטעים שהוזרקו.אם בניסיונות הראשוניים מתקבלים תאים מרובים במקום תאים בודדים, יש לדלל את מלאי הפלסמיד ולחזור על התהליך עד להשגת תוצאות מספקות. בדרך כלל אנו מבצעים הזרקה אחת של P-C-A-G-G-F-P לכל סומיט (somite), כאשר המטרה היא שישה עד 12 סגמנטים לכל עובר. בתנאים אלו, ניתן לזהות אות ברור בתצפית של whole mount, שמונה שעות לאחר ההזרקה, בלפחות סגמנט אחד בעובר אחד מתוך 10.בדוגמה זו, הוזרק פלסמיד המקודד ל-GFP לתוך so mite, וחמש שעות לאחר מכן נצפתה תא פלואורסצנטי בודד במבט whole mount של העובר המוצג כאן. כאשר נצפה העובר 24 שעות לאחר ההזרקה ל-so mite המרכזי, נצפה שםב של תאים פלואורסצנטיים בעובר בשיטת whole mount יומיים לאחר ההזרקה הקלונלית. חיתוך של סגמנט זה חושף נוכחות של צאצאים קלונליים הן בדרמיס והן בשריר, מה שמוכיח שתאי פרוגניטור בודדים מייצרים את שני הנגזרות.בדומה לסומיטים, ניתן להחדיר מחטים גם לתאי אב נוירו-אפיתליאליים בודדים בצינור העצבי הגבי (dorsal neural tube), כפי שמוצג בחתך הרוחב זה, שצולם כאן חמש שעות לאחר ההזרקה. ניתוח של חתכים סדרתיים גילה כי השגה של טרנספקציות קלונליות התרחשה כאשר שיעור ההצלחה היה כ-10%. המשמעות היא שכדי להשיג קלונליות, הטכניקה היא מעצם הגדרתה לא יעילה ביותר. מאידך, בתנאים אלה, נמצא כי יותר מ-93% מאירועי הסימון החיוביים היו קלונליים.הרגע הדגמנו כיצד להזריק תאים בודדים של עוברי תרנגולת בעת ביצוע פרוצדורה זו. חשוב לזכור לדלל כמות גדולה של פלסמיד מלאי לריכוז אידיאלי להדבקות של תאים בודדים, ולהשתמש בו לאורך כל הניסויים שלכם. וזהו זה.תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.

single-cell-transfection-in-chick-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

צ'יק ב electroporation אובו היא טכניקה המאפשרת מניפולציה גנטית של העובר העופות. יישומים נפוצים של טכניקה זו כוללות אנליזה פונקציונלית של גנים המשוערת אלמנטים משפר. וידאו זה מדגים electroporation neural tube אצל ה"ה 10 עוברי אפרוח. טכניקת הזרקת וטיפול נאות ביצה הם דנו.

ב Electroporations אובו של HH 10 עוברים שלב עוף

במאמר זה אנו מציגים שיטה השתלת בתאי גזע האדם לאזורים שונים של מערכת העצבים המרכזית של העובר עוף. זה...

Xenotransplantation בתאי גזע אנושיים לתוך העובר עוף

המטרה הכללית של סרט זה היא להראות כיצד לבצע הזרקת רשתית...

ב electroporation לג&#39;ימי ברשתית צ&#39;יק עובריים

כדי להעריך את תפקוד רגולציה של גנים במהלך ההתפתחות של נוירונים המוח התיכון דופאמין, אנו מתארים שיטה...

ב electroporation לג&#39;ימי של המוח התיכון צ&#39;יק לחקר תפקוד הגן בהתפתחות Neuron דופאמין

ביטוי מחוץ לרחם הוא טכניקה אחת על מנת להבהיר את תפקיד רנ"א בהתפתחות המוח. עם זאת, מיקוד באזורים מסוימים באמצעות ב electroporation אובו הוא מאתגר. כאן, אנו מציגים דרך יעילה לאזורי המוח התיכון הגחון ועל גב באופן סלקטיבי electroporate.

בביטוי אוב של microRNA בגחון צ&#39;יק מוח התיכון

תרביות תאים עובריים חומוס רשתית מהוות כלים חשובים למחקר של ביולוגיה קולטי האור. פיתחנו טכניקת העברה יעילה של גנים המבוססת על לשעבר אוב electroporation פלסמיד של הרשתית לפני התרבות. טכניקה זו במידה ניכרת מגבירה את יעילות transfection על פרוטוקולים זמינים כרגע, מה שהופך את המניפולציה גנטית אפשרית למערכת זו.

העברה יעילה ג'ין בצ'יק הרשתיות לסלולריים יסודי לימודי תרבות: אקס-אוב גישת Electroporation

אנו מתארים את פעולות השירות עבור תיוג פלורסנט tangentially גידול תאים על-ידי אלקטרופורציה ולאחר עבור הדמיה בצילום מואץ של התנועה תאים עם תוויות בתרבות שטוח-הר כדי להמחיש נודדות תא התנהגות tectum אופטיים לפתח הבחורה .

ויזואליזציה של נדידת תאים העוסקות ב Tectum אופטיים לפתח הבחורה

פיתחנו גישה חדשנית של אובדן תפקוד הכוללת החדרה ואינטגרציה גנומית של רצפי מיקרו-רנ"א מלאכותיים לעוברי אפרוחים באמצעות אלקטרופורציה ומערכת טרנספוזון Tol2. טכניקה זו מספקת מתודולוגיית פירוק גנים חזקה ויציבה לחקר תפקוד גנים במהלך ההתפתחות.

גישת אובדן תפקוד ברשתית הגוזל העוברי באמצעות ביטוי טרנסגני בתיווך Tol2 של מיקרו-רנ"א מלאכותי

המטרה הכוללת של מאמר זה היא לתאר כיצד לבצע בהזרקה תוך תאית של אובו של חומרים אקסוגניים לעוברי עוף. גישה זו שימושית מאוד כדי לחקור את הביולוגיה ההתפתחותית של עוברי תרנגולות.

באובו הזרקה תוך-וסקולרית בעוברי עוף

הגוזל הוא אורגניזם מודל חסכוני, נגיש וזמין באופן נרחב למגוון מחקרים. כאן מפורטת סדרה של פרוטוקולים להבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההתפתחות וההתחדשות של האוזן הפנימית של העופות.

בשיטות אובו ואקס אובו לחקר התפתחות האוזן הפנימית של העופות

למד שיטת מיקרו-הזרקה לתא יחיד בעוברי תרנגולת ליצירת אוכלוסיות קלוניות המבטאות חלבון פלואורסצנטי ירוק. שיטה זו מאפשרת חקר תפקוד גנים בביולוגיה התפתחותית.

תא יחיד transfection בעוברים צ'יק

גלה סרטונים נוספים