Name: RNAi הקרנת עבור גורמים מארח מעורב Vaccinia וירוס זיהום באמצעות תסיסנית תאים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-25T17:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: למד סקרינג RNAi בקנה מידה גבוה לזיהוי גורמים מארחים המעורבים בהדבקה ויראלית באמצעות תאי Drosophila. שיטה זו מאפשרת גילוי גורמים תאיים חדשים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIAID (R01AI074951, U54AI057168) ו הגנום פן גבולות מכון SC, מ-NIH T32HG000046 ל TSM, מ-NIH T32GM07229 ו T32AI007324 כדי LRS.

חלק 1: RNAi ב 384 צלחות טוב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקינה של חומרים כימיים המשמשים ההקרנה היא חיונית. אנחנו בודקים הרבה הפרט התקשורת של שניידר, בסרום שור העובר, וכן חומרים כימיים מכתים. אז אנחנו aliquot ולהשתמש הרבה באותו המסך כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך כל assay, עדיף לבדוק כמה שורות תאים שונות כדי לקבוע אילו הוא נוח ביותר לקריאה מתוך הביולוגי שלך. אנו משתמשים בדרך כלל את קו-S2 DRSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים תסיסנית במהירות של 25 ° C בתקשורת שניידר להשלים. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שניידר התקשורת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חום FBS 10% מומת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1X-L-גלוטמין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1X פן / דלקת אנטיביוטיקה </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים תסיסנית הם חצי חסיד והם passaged ללא trypsinization כל ארבעה ימים על ידי pipetting התאים את צלוחיות ו דילול תאים 1:10 לתוך בקבוק טרי. תאים צריכים להיות בשלב יומן לניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט אל הצלחת יום יומית השתנות הן מזעריות באמצעות טיפול הנוזל אוטומטית כל התוספות נוזל רב גם הצלחות. אנו משתמשים WellMate (מטריקס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צינורות WellMate. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרסיס ברדס WellMate עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צינורות מהאריזה ולרסס עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס קלטת צינורות ב מחלק עמדה על WellMate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור ראש עם 25 מ"ל של אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר צינורות באתנול במשך 15 דקות, ולאחר מכן עם ראש הממשלה עוד 25 מ"ל של אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בצינור על ידי תחול עם 50 מ"ל של PBS סטרילית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסלק תאים מן הבקבוק ולספור. תאים גלולה, כך יש לך 25% יותר מאשר הצורך (300xg, 5 דקות). מספר תאים seeded לכל טוב חייב להיות מותאם על פי אורך assay. כאשר עורכים ניתוח התמונה אוטומטית, monolayer יחיד עם תא clumping לא אידיאלי פילוח התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים pelleted בסרום ללא מדיה של שניידר בבית 1.7x10 6 תאים / מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו מבצעים את המסך ב 384 צלחות היטב מראש aliquoted עם ספרייה זמינים מסחרית של dsRNA בריכוז של 250ng/well. בארות כמה כל צלחת נותרים ריקים עבור פקדים, אשר מתווספים באופן ידני. אנו משתמשים dsRNA כדי בלוציפראז כביקורת שלילית. אנו משתמשים dsRNA נגד אשכול (dIAP) כביקורת על החזקה RNAi. להפיל זה אנטי אפופטוטיים תוצאות גורם מוות של תאים דרמטית היא דרך ויזואלית מהירה להעריך את איכות לדפוק למטה. לבסוף, אנו משתמשים dsRNA נגד הכתב ויראלי, במקרה הזה בטא galacosidase, כביקורת חיובית כדי לאמת כי אנו יכולים למנוע זיהום ויראלי באמצעות assay שלנו לקריאה החוצה. אם אכון dsRNA לתוך צלחת בזמן זריעת תאים, 1 aliquot dsRNA μl לפינה הבאר על מנת לאפשר ראיה קל, אז צנטריפוגות dsRNA אל תחתית הבאר (300xg, 1 דקות) לפני הוספת תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש WellMate להוסיף 10 תאים μL מוכן היטב מעל כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין התאים לצלחות ידי centrifuging 300xg, 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 25 ° C בחממה במשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מדיה 20 μL שלם של שניידר צנטריפוגות 300xg, 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות מקום humidified מיכלי פלסטיק מלאים מים ספוג מגבות נייר. נפח של 384 גם הוא קטן, ולכן אידוי יכולה להיות השפעה גדולה על הביולוגיה, אשר בתורו יכול להוביל שינויים artifactual ב-outs לקרוא את בארות קצה. כדי להתגבר על זה, צלחות צריך להישמר תחת לחות גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך שלושה ימים כדי לאפשר מציאה חזקים. אין צורך לשנות את התקשורת או לפתוח מכולות humidified בתקופה זו. </li></ol> חלק 2: הדבקה עם וירוס Vaccinia <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר מרובת ערוצים aspirator ב Quatricide במשך 15 דקות, ואז לשטוף באתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן WellMate כמתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן התקשורת של שניידר עם 2% FBS נגוע דילול מלא בתקשורת 01:05 בתקשורת חופשית בסרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניות סינון וירוסים גולמי באמצעות מזרק 0.8 אממ לסנן להסיר פסולת הסלולר או להשתמש וירוס מטוהרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל וירוס vaccinia בתקשורת 2% בסרום של שניידר להשיג ריבוי של זיהום (משרד הפנים) 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS מתוך צינורות WellMate, וראש בווירוס מדולל עד בצינור ללא בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מעוקרים מרובת ערוצים aspirator ו סעפת ואקום כדי להסיר בעדינות התקשורת מהצלחות של dsRNA שטופלו בתאים תסיסנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על 30 לכל וירוס μL גם על הצלחות באמצעות WellMate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צלחות 1 דקות ב 300xg. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר צינורות WellMate. ראש עם 25 מ"ל של blea 10%ch, להמתין 10 דקות, ממשלה עם אקונומיקה עוד 25 מ"ל 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור ראש עם 50 מ"ל מים ואחריו 50 מ"ל אתנול 70%. חזור אל צינורות האריזה שלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור צלחות קופסת פלסטיק humidified. דגירה של 25 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. </li></ol> חלק 3: פלטות מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן צלחות בפורמלין 15% μL 4 / PBS למשך 10 דקות. נוזלי מוסר באמצעות aspirator מרובת ערוצים ו סעפת ואקום בכל שלב. לאחר הצלחות תוקנו, ציוד סטרילי ריאגנטים אינם נחוצים עוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר לתקן ולהשתמש WellMate להוסיף 30 PBST μL (PBS + 0.1% Triton-X). דגירה 10 דקות וחזור. Operate WellMate כמתואר לעיל, למעט צינורות לא צריך לעבור עיקור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות זיהום vaccinia נשתמש כתב β-galactosidase מונע על ידי האמרגן vaccinia מוקדם / מאוחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאים נוזלי דגירה בבלוק (PBST עם BSA 2%) במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל הנוגדן העיקרי לחסום, להסיר נוזלי להוסיף 15 נוגדן μL כדי pipettor גם שימוש רב ערוצי כל לחזור (מטריקס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה צלחות (300xg, 1 דקות), לכסות עם מדבקה ברורה, דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר נוגדן ראשוני, ולהשתמש WellMate לשטוף בארות PBST 3 פעמים, 10 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל נוגדנים משני שכותרתו fluorescently (FITC) ו גרעיני כתם בבלוק, ולהוסיף 15 μL לבארות באמצעות Multi-channel לחזור pipettor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות דגירה 1 שעה בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בארות PBST 3 פעמים, 10 דקות כל אחד באמצעות WellMate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם צלחת עם מדבקה לכסות ברור, ולאחסן ב 4 ° C עד שלושה שבועות. </li></ol> חלק 4: הדמיה וניתוח תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במיקרוסקופ בהגדלה 20X אוטומטית אל צלחות התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלמו תמונות של גרעינים הכולל (DAPI) לבין תאים נגועים (FITC). מטב את זמן החשיפה לכל ערוץ בנפרד על מנת למקסם טווח דינמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכוונן את פונקציית המיקוד האוטומטי על ידי לקיחת Z ערימה של תמונות, 1um ברווח מזה, כי ההיקף המטוסים מעל ומתחת למישור הצפוי של המוקד. ברגע שהמטוס נמצא מוקד אופטימלי, פוקוס אוטומטי להתאים את ההגדרות בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה את הצלחת כולה, לכידת לפחות שלוש תמונות לכל היטב הן את ערוץ Hoechst (DAPI) ואת ערוץ וירוס (FITC). בחירת האתרים מאזורים שונים בתוך שנה אחת גם כדי ללכוד תמונות שמייצגות את גם כולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש MetaXpress תוכנה לכתוב יומן לפלח את התמונה והשתמש גרעינים מודולים הרוזן כדי לחשב את המספר הכולל של תאים חיובית מכתים גרעיני (תאים סה"כ) וזיהום (FITC) עבור כל צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב זיהום אחוז (100 תאים * FITC חיובי / סה"כ) והיכנס לשנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות מועמדים אנו משתמשים ציון חזקים Z מבוסס על טווח חציון interquartile של כל צלחת. שיטה זו היא רגישות חריגים ונתונים nonsymmetric, ולכן מספק כוח גדול יותר בזיהוי אפילו מכה חלשה או בינונית 10. במשך כל צלחת, החציון הוא ונוכו מנתוני log-טרנספורמציה. ואז הערכים שהתקבל מחולקים לפי 0.74 פעמים את טווח interquartile (ההפרש בין הערכים של האחוזון ה 75 לבין אחוזון 25 ה). גורם 0.74 משמש הפצה משוער נורמלית סטנדרטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הציון חזקים Z הוא מדד של מרחק סטיות תקן מן הממוצע של הצלחת. לדוגמה, החזקה Z-ציון של 2% מצביע על זיהום של הבאר הוא ~ 2 סטיות תקן מן החציון צלחת או p &lt;0.05. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח מספר תאים כדי לזהות המועמדים ציטוטוקסיות. חישוב הציון חזקים Z של ספירת גרעיני. מועמדים בעלי החזקה Z &lt;ב -2 מסכי לשכפל נחשבים ציטוטוקסיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וולס כי יש ציון חזקים Z לזיהום אחוז&gt; 2 או &lt;ב -2 מסכי כפולות (p &lt;0.0025) ללא cytotoxicity נחשבים מועמדים פוטנציאליים מהמסך הראשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מועמדים חיובית מאומתים באמצעות ריאגנטים עצמאית. dsRNAs נוצרות נגד גנים עניין מאזור אחר של mRNA ונבדק לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גנים אלה עבור שבו שני dsRNAs עצמאית יש פנוטיפ זהה יכול להיחשב למחקר נוסף. </li></ol> חלק 5: תמונות נציג ופרשנות של בשיעורי הזיהום <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. בארות נגוע לא מראים מכתים עבור חלבונים vaccinia וירוס, בעוד נציג נגועים גם מכיל תאים מכתים חיובית vaccinia, הביע חלבון (βgal) בטא galactosidase, כפי שנמדד על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence.וירוס = ירוק, כחול = גרעיני. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. תוכנה אוטומטיות ניתוח התמונה מכמת זיהום כל תמונה באמצעות פרמטרים הנקבעים על ידי המשתמש. בתמונה נציג, המספר הכולל של גרעין התא ואת מספר התאים לבטא אנטיגן נגיפי נספרים בהתבסס על גודל ועוצמת מכתים מעל מכתים את הרקע המקומי. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. מציאה של חוט (dIAP) משמש כביקורת חיובית דלדול RNAi החזקה של גני מטרה. מציאה של גורם אנטי אפופטוטיים זה מוביל מוות של תאים דרמטי. גרעינים = כחול. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. מציאה של בלוציפראז משמש בקרה שלילית ההשפעה של טיפול RNA פעמיים תקועים על זיהום. דלדול בלוציפראז אין כל השפעה על זיהום ביחס לתאים אינה מטופלת כראוי. וירוס = ירוק, כחול = גרעיני. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5. מציאה של חלבון βgal משמש שליטה חיובית לצמצום הזיהום, שכן assay משתמשת רמות החלבון βgal כמו לקרוא בקול של זיהום. דלדול של תוצאות βgal לירידה באחוז התאים הנגועים. וירוס = ירוק, כחול = גרעיני. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig6.jpg" alt="איור 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 6"> איור 6. מציאה של הסלולר Rab5 תוצאות גורם לירידה באחוז התאים הנגועים. מאז Rab5 ידוע להשתתף אנדוציטוזה, גורם זה עשוי תורם כניסה וירוס vaccinia. זה מייצג outlier דוגמה מן המסך. וירוס = ירוק, כחול = גרעיני.

<ol><li>Ramadan, N., Flockhart, I., Booker, M., Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+high-throughput+RNAi+screens+in+cultured+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of high-throughput RNAi screens in cultured Drosophila cells.</a> Nat Protoc. 2, 2245-2264 (2007).</li>
<li>Chotkowski, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((West+Nile+virus+infection+of+Drosophila+melanogaster+induces+a+protective+RNAi+response%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response.</a> Virology. 377, 197-206 (2008).</li>
<li>Blondel, D., Petitjean, A. M., Dezelee, S., Wyers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+stomatitis+virus+in+Drosophila+melanogaster+cells%3A+regulation+of+viral+transcription+and+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Vesicular stomatitis virus in Drosophila melanogaster cells: regulation of viral transcription and replication.</a> J Virol. 62, 277-284 (1988).</li>
<li>Sessions, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+insect+and+human+dengue+virus+host+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Discovery of insect and human dengue virus host factors.</a> Nature. 458, 1047-1050 (2009).</li>
<li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+RNAi+screening+in+Drosophila+S2+cells%3A+what+have+we+learned+about+host-pathogen+interactions%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genomic RNAi screening in Drosophila S2 cells: what have we learned about host-pathogen interactions?</a> Curr Opin Microbiol. 11, 262-270 (2008).</li>
<li>Hao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+RNAi+screen+identifies+host+genes+important+for+influenza+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication.</a> Nature. 454, 890-893 (2008).</li>
<li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPI+activity+coupled+with+fatty+acid+biosynthesis+is+required+for+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">COPI activity coupled with fatty acid biosynthesis is required for viral replication.</a> PLoS Pathog. 2, e102-e102 (2006).</li>
<li>Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+reveals+a+specific+sensitivity+of+IRES-containing+RNA+viruses+to+host+translation+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen reveals a specific sensitivity of IRES-containing RNA viruses to host translation inhibition.</a> Genes Dev. 19, 445-452 (2005).</li>
<li>Moser, T. S., Jones, R. G., Thompson, C. B., Coyne, C. B., Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Kinome+RNAi+Screen+Identified+AMPK+as+Promoting+Poxvirus+Entry+through+the+Control+of+Actin+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A Kinome RNAi Screen Identified AMPK as Promoting Poxvirus Entry through the Control of Actin Dynamics.</a> PLoS Pathog. 6, e1000954-e1000954 (2010).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Echeverri, C. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+RNAi+screening+in+cultured+cells%3A+a+user%27s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide.</a> Nat Rev Genet. 7, 373-384 (2006).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הגנום כולו ההקרנה RNAi ב תסיסנית מספק שיטה חזקה ויעילה לבחינת רכיב הסלולר של זיהום ויראלי. מספר וירוסים להדביק תאים יונקים תסיסנית, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לזהות את המרכיבים של התגובה החיסונית המארח מהותי, וחלבון מארח הגורמים הנדרשים שכפול נגיפי זה עשוי לייצג מטרה טיפולית חדשנית. לפני ביצוע מסך, assay חייב להיות מותאם בקפידה את סוג התא, מספר התאים, רמת זיהום, חייבים להיות מבוקרים היטב, כולל חיוביים ושליליים נגיפיים 11 יעדים סלולריים. חשוב להבטיח הפרדה מספקת בין בקרות חיוביות ושליליות לפני ההקרנה על מנת למקסם את הטווח הדינמי של assay. לאחר מסך שבוצעה, המועמדים יכולים להיות מחולקים לקטגוריות תפקודית כדי לקבוע אילו מנגנוני מארח לתרום לזיהום. עבור וירוסים יונקים כגון vaccinia, התרומה של homologs יונקים ידי RNAi צריך להיקבע במסגרת ניתוח משני. יחדיו, אלה שיטות ההקרנה החזקה תאפשר לנו לקבל תובנות לגבי מנגנונים מורכבים על ידי וירוסים אשר אינטראקציה עם תאים המארח שלהם.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;תרבית תאים&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדיום Schneider&amp;rsquo;</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11720</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 100X</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומייצין (pen/strep)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עובי (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6178</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;סריקה&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספריית dsRNA רחבת גנום</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלטות 384 בארות, שחורות עם תחתית שקופה</td><td>Corning</td><td>3712</td><td></td></tr><tr><td>אטמי אלומיניום</td><td>Corning</td><td>6569</td><td></td></tr><tr><td>אטמים שקופים</td><td>Denville Scientific</td><td>B1212-4</td><td></td></tr><tr><td>Well Mate</td><td>Matlab</td><td>201-10001</td><td></td></tr><tr><td>מניפולד 24 פינים</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-101</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים שניים מסומנים פלואורסצנטית</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אוטומטי ImageXpressMicro</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח תמונות MetaXpress</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rnai הקרנת עבור גורמים מארח מעורב vaccinia וירוס זיהום באמצעות תסיסנית תאים

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

פתוגנים ויראליים מהווים איום משמעותי על בריאות הציבור, לא רק וירוסים יכולים לגרום מגיפות טבעי של מחלות אנושיות, אך השימוש הפוטנציאלי שלהם טרור ביולוגי היא גם דאגה. הבנה טובה יותר של הגורמים הסלולר כי השפעת זיהום יקל על פיתוח נחוצה הרפוי. התפתחויות אחרונות בתחום הטכנולוגיה RNA (RNAi) הפרעה יחד עם רצף הגנום המלא של אורגניזמים אחדים הובילה אופטימיזציה של הגנום כולו, מבוססי תאים הפסד של פונקציה המסכים. תאים תסיסנית הנוחות במיוחד הגנום בקנה מידה מסכי בגלל הקלות והיעילות של RNAi במערכת זו 1. חשוב לציין, מגוון רחב של וירוסים יכולים להדביק תאים תסיסנית, כולל מספר וירוסים יונקים בעלי חשיבות רפואית חקלאי 2,3,4. הקודם מסכי RNAi ב תסיסנית זיהו גורמים מארח הנדרשים בפעולות שונות על זיהום בנגיף כולל כניסה, תרגום, שכפול רנ&quot;א 5. יתר על כן, רבים מן הגורמים הסלולר נדרש שכפול נגיפי בתרבות התא תסיסנית גם הגבלת בתאים אנושיים נגועים אלו וירוסים 4,6,7,8, 9. לכן, זיהוי של גורמים מארח לאייש במהלך זיהום ויראלי מציג מטרות הרומן ותרופות אנטי. כאן אנו מציגים פרוטוקול כללית עבור מסך RNAi תפוקה גבוהה לזהות גורמים הסלולר מעורב זיהום ויראלי, באמצעות וירוס vaccinia כדוגמה.

המארח רומן הגורמים המעורבים זיהום ויראלי ניתן לזהות דרך אובדן גנום רחב מבוססי תאים של ההקרנה RNAi לתפקד.<em&gt; תסיסנית</em&gt; תרבות מודל התא הוא נוח במיוחד גישה זו בשל הקלות והיעילות של RNAi. כאן אנו מדגימים את הטכניקה הזו באמצעות<em&gt; Vaccinia</em&gt; וירוס כדוגמה.

RNAi הקרנת עבור גורמים מארח מעורב Vaccinia וירוס זיהום באמצעות תסיסנית תאים

פתוגנים נגיפיים מהווים איום משמעותי על בריאות הציבור; נגיפים אינם רק מסוגלים לגרום למגפות טבעיות של מחלות בבני אדם, אלא שפוטנציאל השימוש בהם ב...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להשתמש בסריקת RNAi בתפוקה גבוהה כדי לזהות גורמי מאכסן המעורבים בזיהום נגיפי. דבר זה מושג תחילה על ידי דלל של גנים רלוונטיים באמצעות RNAi בלוחות של 384 בארות. לאחר מכן, התאים נחשפים לנגיף הרלוונטי, נצבעים עבור חלבונים נגיפיים, ומדדי הזיהום הנגיפי נמדדים באמצעות מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה.לבסוף, מבוצע ניתוח תמונה אוטומטי כדי לזהות גנים מועמדים לתיקוף ולמחקר נוסף. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות שינויים בזיהום באמצעות כימות אחוז התאים המזוהים כנגועים באמצעות מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה. דבר זה מאפשר גילוי של גורמים תאיים חדשים המעורבים בזיהום ויראלי.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי אינטראקציות בין וירוסים למאבחים, ניתן להחיל אותה גם על חקר של כל מערכת שתוכל להפיק תועלת משימוש בקריאה ויזואלית של התהליך התאי הנבדק. אנשים שאינם מכירים את השיטה צריכים לצפות לעקומת למידה תלולה, כיוון שהשגת זיהומים הניתנים לשחזור תוך מזעור השונות דורשת אופטימיזציה ניכרת. כדי להבטיח את שחזור התוצאות, חיוני להשתמש במספר אצווה בודד עבור כל ריאגנט המשמש במהלך סריקה שלמה. גדלו תאי drosophila מסוג S 2D RSC במצע Schneider's complete בטמפרטורה של 25 °C; התאים צריכים להיות בשלב לוגריתמי.עבור ניסויים במנדף זרימה למינרית, שחררו את התאים החלקית-נדבקים מהבקבוק באמצעות פיפוט נמרץ. ספרו את התאים באמצעות המוסימטר (hemocytometer) והעבירו 125% מכמות התאים הדרושה לניסוי לשפופרת קונית של 50 מיליליטר; רספו ב-300 G למשך חמש דקות. שאבו את הנוזל העליון (supernatant) ותלו את המשקע בריכוז סופי של 1.7 × 10⁶ תאים למיליליטר במצע Schneider's ללא סרום.השתמש במערכת אוטומטית לטיפול בנוזלים שעברה סטריליזציה והכנה (priming). כאן נעשה שימוש ב-matrix well mate כדי למזער שונות בין הלוחיות. הוסף 10 µL של תרחיף תאים לכל באער בלוחית של 384 באערים שנערכה לה להם מראש (pre-eluted) עם 250 ng לכל באער של RNA דו-גדילי. סבב (Spin) את התאים על הלוחיות ב-300 ×g למשך דקה אחת.דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 25 °C למשך 45 דקות. הוסיפו 20 µL של מצע Schneider's מלא לכל באר. סובבו (spin down) את המצע ב-300 G למשך דקה אחת כדי למזער את השפעות האידוי.יש לאחסן את הצלחות ומכלי האטימה הלחים המרופדים בנייר סופג ספוג במים. יש להדגיר בטמפרטורה של 25 degrees Celsius למשך שלושה ימים בתוך קבينة ביולוגית ברמת בטיחות BSL 2 כדי לאפשר השגות knockdown חזקות. לפני הדבקת התאים, יש לסנן את מלאי נגיפי ה-vaccinia הגולמי באמצעות מסנן מזרק של 0.8 micron.להסרת פסולת תאית. יש לדלל את הווירוס במצע שנידר (Schneider's medium) עם 2% סרום כדי להשיג ריבוי זיהום (multiplicity of infection), המקוצר כ-MOI, של שני פריים.ממלאים את המבחנה הסטרילית בנגיף מדולל עד שהצינורות נקיים מבועות אוויר. באמצעות שואב רב-ערוצי סטרילי עם סעפת ואקום, מסירים בעדינות את המצע מלוחיות של תאי דרוזופילה שטופלו ב-double stranded RNA. מחלקים 30 microliters של נגיף מדולל לכל לוחית.סבבו את הפלטות בצנטריפוגה ב-300 G למשך דקה אחת. החזירו את הפלטות למכל הלחות והדגירו בטמפרטורה של 25 degrees Celsius למשך 48 שעות. בתוך מabilis בטיחות ביולוגית ברמה BSL 2, שאבו את המצע מהפלטה.לאחר מכן, השתמשו בפיפט רב-ערוצי כדי להוסיף 15 µL של תמיסת קיבוע פורמאלדהיד 4% לכל לוחית. הדגרו את הבארות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. הסירו את הנוזל באמצעות שואב רב-ערוצי.השתמש ב-WELLMADE כדי להוסיף 30 µL של PBST לכל באער. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. בצעו שטיפה שנייה עם PBST למשך 10 דקות באותו אופן.יש להסיר את הנוזל לאחר שלב הדגירה ולעקוב ב-30 µL של תמיסת חסימה PBST עם 2% VSA. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. השתמשו בפיפט רב-ערוצי חוזר כדי להוסיף לכל באער 15 µL של נוגדן ראשוני המדולל בתמיסת החסימה.סבב את הפלטות ב-300 G למשך דקה אחת. אטום כל פלטה באמצעות סרט איטום שקוף והדגר בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. השתמש ב-well mate ובשואב רב-ערוצי כדי לשטוף את התאים ב-PBST שלוש פעמים, למשך 10 דקות בכל שטיפה.השתמשו בפיפט רב-ערוצי כדי להוסיף 15 µL של נוגדן שני מסומן פלואורסצנטית עם צבע גרעיני לכל באר. כסו את הפלטות בנייר אלומיניום להגנה מאור והדגירו אותן בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. שטפו את התאים עם PBST שלוש פעמים כפי שבוצע קודם לכן, למשך 10 דקות בכל שטיפה.הוסיפו 30 µL של PBST לתאים ואטמו באמצעות כיסוי שקוף. כסו בנייר אלומיניום. אחסנו את הפלטות האטומות בטמפרטורה של 4 °C למשך עד שלושה שבועות לפני הדמיה במיקרוסקופ אוטומטי.בבארים שאינן נגועות לא נראה כל צביעה לחלבונים של נגיף הוואקסיניה, בעוד שבבאר נגועה מייצגת קיימים תאים עם צביעה חיובית לחלבון beta GCSEs המבוטא על ידי הוואקסיניה, כפי שנמדד במיקרוסקופיה של אימונופלורסנציה. תוכנה לניתוח תמונות אוטומטי מכמתת את ההדבקה בכל תמונה באמצעות פרמטרים שנקבעו על ידי המשתמש.בתמונה מייצגת, המספר הכולל של גרעיני תאים ומספר התאים המבטאים אנטיגן ויראלי נספרים על בסיס הגודל ועוצמת הצביעה מעל הרקע המקומי. השתקה (knockdown) של צביעת thread משמשת כביקורת חיובית להדרה חזקה של גנים מטרה באמצעות RNAi. השתקה של פקטור אנטי-אפופטוטי זה מובילה למות תאים דרמטי.השהאת ביטוי (Knockdown) של לוציפראז משמשת כביקורת שלילית להשפעת הטיפול ב-RNA דו-גדילי על הזיהום. להפחתת ביטוי הלוציפראז אין השפעה על הזיהום ביחס לתאים שלא טופלו. השהאת ביטוי של חלבון בטא-גלקטוסidase משמשת כביקורת חיובית להפחתה בזיהום.מכיוון שהבדיקה משתמשת ברמות חלבון beta galacto כמדד לזיהום, התרוקנות של beta galacto גורמת לירידה באחוז התאים המזוהמים. השתקת הגורם התאי RAB five גורמת לירידה באחוז התאים המזוהמים. מכיוון ש-RAB five ידוע כמשתתף באנדוציטוזיס, סביר שגורם זה תורם לכניסת נגיף הוואקסיניה.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי השימוש בסריקת RNAi ב-drosophila לזיהוי גורמי מאכסן התורמים לזיהום נגיפי, כולל ביצוע RNAi, הדבקה בנגיף vaccinia, צביעה, דימוי וניתוח של פלטות 384 בארות. זכרו כי עבודה עם נגיפי DNA עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת חלוקי מעבדה ומשקפי מגן בעת ביצוע הליך זה. יש לפתוח נגיף חי אך ורק בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית ברמה של BSL 2, וכל חומר שהיה במגע עם נגיף חי חייב לעבור סטריליזציה ב-10% bleach לפני השלכתו.

rnai-screening-for-host-factors-involved-vaccinia-virus-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

התערבות RNA הוכח יעיל מאוד כדי לנתח את תפקוד...

RNAi הפרעה על ידי הזרקה לתוך dsRNA תסיסנית עוברים

אנו מתארים שיטה רגיש לזהות הרגולטורים postembryonic של ביטוי חלבונים לוקליזציה...

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

בסרטון זה, אנו מתארים הליך לביצוע ננו-הזרקה של נגיף RNA חד-גדילי בעל חוש חיובי לזבובי דרוזופילה זכרים בוגרים ולאחר מכן חוקרים את התגובות האנטי-ויראליות שיזמו עקב הזיהום. ניתוח תגובת שרשרת פולימראז מזהה את הרגולציה של גנים ספציפיים בזבובים הנגועים המצביעים על הפעלת מסלולי תגובה חיסונית, כולל הפרעות RNA ואיתות JAK/STAT.

ננו-הזרקה נגיפית תוך-חזה לחקר אינטראקציות בין וירוס מארח בזבובים בוגרים

מטרתו של פרסום זה היא לדמיין ולדון בצעדים האופרטיביים של פרוטוקול צפון כתם משופר על RNA שחולץ מתסיסנית עוברים, תאים ורקמות. פרוטוקול זה שימושי במיוחד לאיתור יעיל של מיני RNA קטנים.

Enhanced צפון כתם איתור של RNA קטן מינים ב תסיסנית

כאן נתאר פרוטוקול להעסקת תפוקה גבוהה ההקרנה RNAi לחשוף את מטרות המארח יכול להיות מניפולציות כדי לשפר את הטיפול וירוס oncolytic, במיוחד rhabodvirus וטיפול וירוס vaccinia, אבל ניתן בקלות להתאים oncolytic אחרים וירוס פלטפורמות או לגילוי גנים המארח לווסת את שכפול וירוס בדרך כלל.

ברמת הגנום RNAi ההקרנה כדי לזהות גורמים מארח לווסת את הטיפול Oncolytic וירוס

שיטה זו מדגימה כיצד להמחיש הפתוגן הפלישה לתוך תאים חרקים עם דגמים תלת ממדיים (3D). Hemocytes של הזחלים דרוזופילה נדבקו בנגיף פתוגנים נגיפי או חיידקי, או vivo לשעבר או ויוו. Hemocytes נגוע היו לאחר מכן קבועה, צבעונית עבור הדמיה עם מיקרוסקופ קונפוקלי, עוקבות שיחזור תאי תלת-ממד.

החילוץ של Hemocytes של הזחלים דרוזופילה melanogaster זיהום מיקרוביאלי וניתוח

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים כדי לזהות immunomodulators 1) וירוס מקודד המקדמים arbovirus השכפול וגורמים מארח 2) האיקריוטים שמגבילות את שכפול arbovirus. שיטות אלה פלורסצנטיות הפריה חוץ גופית מבוססות מאפשרים להשיג במהירות את המפרט כמותית של שכפול arbovirus ב מבחני פשטני עם יחס אות לרעש נמוך.

זיהומים arbovirus כמו כלים ההקרנה לצורך זיהוי גורמים אנטי ויראלי Immunomodulators ומנחה

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה microinjection לנו יש סטנדרטית, ומשמש מזה מספר שנים כדי לספק כמויות מסוימות של חומצות גרעין ישירות hemolymph של יתושים וזבובים הבית. פרוטוקול זה תוצאות בתמותה הזרקת מינימלית ומאפשר במינון בקורלציה מדידות של פוריות.

DsRNA לשחזור Microinjection, ההטלה Bioassay של יתושים וזבובים הבית

פרוטוקול זה מתאר כיצד להקים זיהום ויראלי ויוו דרוזופילה melanogaster באמצעות שיטת ננו-הזרקת טכניקות בסיסיות כדי לנתח וירוס-פונדקאי אינטראקציה.

הקמתה של זיהום נגיפי וניתוח של התערבות מארח-וירוס דרוזופילה Melanogaster

פרוטוקול זה מתאר וזמינותו של phagocytosis ויוו ב מבוגרים דרוזופילה melanogaster לכמת פגוציט הכרה ואישור של זיהומים חיידקים.

הערכת התגובה החיסונית הסלולר של זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, שימוש ב Vivo Phagocytosis Assay

אנו מציגים פרוטוקול באמצעות גישה גנטית הקדמי למסך עבור מוטציות המציגות ניוון נוירוזוסופילה מלאנוגסטר. היא משלבת שיטת טיפוס, ניתוח היסטולוגיה, מיפוי גנים ורצפי דנ א בסופו של דבר לזהות גנים חדשניים הקשורים לתהליך של הגנה עצבית.

ב Vivo Forward המסך הגנטי כדי לזהות גנים נוירוגינים הרומן ב Drosophila ילה melanogaster

למד סקרינג RNAi בקנה מידה גבוה לזיהוי גורמים מארחים המעורבים בהדבקה ויראלית באמצעות תאי Drosophila. שיטה זו מאפשרת גילוי גורמים תאיים חדשים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה.

RNAi הקרנת עבור גורמים מארח מעורב Vaccinia וירוס זיהום באמצעות תסיסנית תאים

גלה סרטונים נוספים