Name: ניתוח ישיר של תאים בודדים באמצעות ספקטרומטריית מסה בלחץ אטמוספרי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: למד ניתוח תאים בודדים ישירים באמצעות ספקטרומטריית מסה LAESI בלחץ אטמוספרי. שיטה זו מאפשרת זיהוי מטבוליטים וליפידים בתאי צמחים ובעלי חיים ללא הכנה מקדימה נרחבת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים תמיכה כספית על ידי המוסדות הבאים: הקרן הלאומית למדע (מענק 0,719,232), מחלקת האנרגיה (גרנט DEFG02-01ER15129), קק WM Foundation (גרנט 041,904), ואת מאוניברסיטת ג&#39;ורג&#39; וושינגטון קרן מחקר שיפור. המחברים מודים עבור GeO2 מבוססי סיבים אופטיים שסופקו בנדיבות לדיון הראשוני על פרוטוקול בדבר תחריט סיבים ידי Mark E. ריבס ג&#39;ואן א הופמן של ג&#39;ורג&#39; וושינגטון על ידי מערכות סיבים אינפרא אדום (Silver Spring, MD), כמו גם האוניברסיטה. המחברים רוצה גם להודות ג&#39;סיקה א Stolee על עזרתה במהלך במצלמת וידיאו את הפרוטוקול.

1. רכיבים אופטיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבלציה לייזר עבור יינון אבלציה electrospray לייזר (LAESI) ספקטרומטריית מסה (MS) מופק על ידי 5 ns הדופק לייזר באורך גל 2.94 מיקרומטר. מתנד אופטי מתכונן פרמטרית מונע על ידי Nd: YAG לייזר (Opolette 100, Opotek Inc, בקרלסבד, קליפורניה) משמש אבלציה במחקר זה. שיעור החזרה נבחר בין 5 ל 100 הרץ. זהו לייזר בכיתה ד 'כי בחשיפה ישירה עלולה לגרום לנזק בלתי הפיך חמור בעין או העור. השתקפות מפוזר של קרן לייזר יכולה להיות גם מסוכנת העור או העיניים. לבשי goggle לייזר מתאים להגנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיב אופטי עשוי זכוכית דו מבוססי גרמניום התקבל אינפרא מערכות סיבים, Inc (Silver Spring, MD). אם יש Hytrel ו polyimide ציפויים על הסיב בצע את ההוראות שלהלן כדי להסיר אותם מן הקצוות. מחממים 1-methyl-2-pyrrolidinone ל 130-150 מעלות צלזיוס במנדף קטר. טובלים את קצות הסיבים אתה רוצה להתפשט לתוך הנוזל הזה דקות או עד כ 1 ציפוי מתחיל להתרכך להתקלף. טובלים את ציפוי מרוככת לתוך מתאנול או isopropanol לרגע, ולנגב את כל ציפוי הנותרים עם מפית ונטולת מוך. לאחר הסרת ציפוי, לדבוק בשני הקצוות של סיבים עם להב ספיר (KITCO סיבים אופטיים, וירג'יניה ביץ', VA) כשקלע בעדינות מצלם אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג את חדות הרצוי כימית סוף לחרוט אחד קצה סיב ב -1% (v / v) חומצה חנקתית (כיתה מגיב) פתרון. אנכית לטבול את קצה נבחרים של סיבים לתוך התמיסה חומצה עד לעומק של 300-500 מיקרומטר לאחר המגע הראשוני. לאחר כ 15 דקות של תחריט, הטיפ יהיה ספונטני להתנתק מפני השטח חומצה. התוצאה היא קצה סיב חידד עם רדיוס 15 ~ מיקרומטר של עקמומיות. לשטוף עם מים deionized כדי להסיר שאריות חומצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר סוף חרוט של סיבים על micromanipulator (MN-151, Narishige, טוקיו, יפן) ולהביא אותו אל קרבה (~ 20 מיקרומטר) של תא השטח להפקדה לחיסכון באנרגיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את קצה שאינם חרוט של סיב אופטי באמצעות סיב צ'אק חשוף (BFC300, Siskiyou Corporation, Pass מענקים, OR). במשך יישור אופטי, צ'אק הסיבים הוא רכוב על המתרגם חמש ציר (BFT-5, Siskiyou Corporation, Pass מענקים, OR). אנרגיית הלייזר (0.5-1 mJ) הוא בשילוב לתוך סיב על ידי מיקוד אלומת ידי פלואוריד Plano-קמור סידן או ZnSe מצופה antireflection העדשה (מוצרים אופטיים אינפרא אדום, Farmingdale, ניו יורק) על סופו הלא חרוט. מראות זהב מוגן (PF10-03-M01, Thorlabs, ניוטון, NJ) משמשים כדי לכוון את אלומת האור אמצע IR לייזר על גבי העדשה מתמקדת. </li></ol> 2. Electrospray ההתקנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המערכת electrospray ניתן לבנות באמצעות הרכיבים הבאים: איגוד מתכת עם טבעת חזוק perfluoroelastomer, אביזרי מוליך, שרוול צינור, מחט הנמל (למשל, U-435, M215, F-331Nx, F-242x, 9013, בהתאמה IDEX בריאות למדעים, Oak Harbor, WA), כמו גם צינורות סיליקה התמזגו (למשל, CT360-100-50-5, ניו המטרה Inc, Woburn, MA). פולט המליצה עשוי נירוסטה בעל קצה קוני עם מזהה 50 מיקרומטר (למשל, MT320-50-5-5, ניו המטרה Inc, Woburn, MA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מתנול 50% עם חומצה אצטית 0.1% (v / v) עבור electrospray. הפתרון נשאבים בקצב של מינימום 200-300 / nl ידי משאבת מזרק (הרווארד Apparatus, Holliston, MA) באמצעות, למשל, מזרק 500 μl (81,222, חברת המילטון, רינו, NV). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מתח גבוה בין 2800 ו - 3000 V לאיגוד מתכת על ידי אספקת חשמל מוסדר (PS350, Stanford Research Systems Inc, Sunnyvale, CA) כדי ליצור electrospray יציב. ודא שכל חיבורי החשמל הם בטוחים מוגן עם סיכוך מוארקים כיאות. מגע ישיר עם מתח גבוה חשופה עלולה לגרום להתחשמלות. </li></ol> 3. לדוגמה טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את רקמת חיים או דגימת תאים ממקור המתאים ולשמור אותם מומלץ כמו לפני ניתוח. נורות Allium cepa להפגנה זו נרכשו בחנות המקומית. גזור נורה longitudinally ידי אזמל מנתחים. קטע סנטימטר כמה בקנה מידה נותח לרצועה. Monolayer שלם של רקמת אפידרמיס הפנימי הוא קילף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשטח הרטוב של האפידרמיס משמש הר רקמה על שקופית מראש לנקות מיקרוסקופ זכוכית. החזק את השקופית על ידי בעל לוחית בכלל מטרה (FP01, Thorlabs בע"מ, ניוטון, NJ) רכוב על הבמה שלוש ציר תרגום מיצוב. רוכשת את הספקטרום המונית מיד לאחר ההרכבה את המדגם כדי למנוע השפלה התא. </li></ol> 4. ויזואליזציה מערכת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני מיקרוסקופים למרחקים ארוכים משמשות כדי לבחור את התאים לניתוח כדי לשמור על המרחק בין קצה סיב חידד את שטח פני התא. האחרון הוא רכוב תחת זווית ° 15 ° -30 נמדד מפני השטח. מערכת זו מורכבת אלוידאו אונג מרחק מיקרוסקופ (זום אופטי 7x דיוק, אדמונד אופטיקה, ברינגטון, NJ) עם אינסוף 5x לתקן עדשה אובייקטיבי (Apo M תוכנית 5x, Mitutoyo ושות', קאנאגאווה, יפן) מצויד במצלמת CCD (מרלין F131, בעלות הברית ויז'ן טכנולוגיות , Stadtroda, גרמניה) לניטור לכידת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המיקרוסקופ וידאו השני הוא רכוב בזווית ישרה אל פני השטח מדגם לדמיין את התאים מלמעלה. מערכת זו מספקת משוב חזותי כדי ליישר את קצה סיב על התא הנבחר עבור אבלציה וניתוח. זה מורכב דיוק זום אופטי 7x (אדמונד אופטיקה, ברינגטון, NJ), מצויד באינסוף 10x תיקן עבודה ארוכות אובייקטיבי מרחק העדשה (M תוכנית Apo 10x, Mitutoyo ושות', קאנאגאווה, יפן) מצלמה CCD. </li></ol> 5. רכישת ספקטרה המוניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הלייזר, את electrospray ואת ספקטרומטר מסה, למשל, מערכת quadrupole הזמן של הטיסה (Q-TOF פרמייר, ווטרס, Milford, MA). מטב את הגיאומטריה של המקור יון LAESI ידי התאמת המיקום של המקום אבלציה ו פולט electrospray ביחס אחד לשני ואת פתח של ספקטרומטר מסה להשיג בעוצמות יון מקסימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את התא עניין לניתוח באמצעות מערכת העליונה להציג ראיה. לאחר הבחירה, להזיז את הבמה מדגם להביא את התא הנבחר ישירות מתחת קצה מחודד של סיב אופטי. באמצעות מיקרוסקופ צד להציג להתקין מחדש את קצה אל תא השטח המרחק ~ 20 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אש פעימות לייזר בתא הנבחר דרך קצה סיב חרוט. זו התוצאה ניקוב של קיר התא לבין פליטה של ​​בציטופלסמה בצורה של חומר חלקיקי. לאחר postionization ידי electrospray, היונים המיוצרים נאספים על ידי ספקטרומטר מסה ספקטרה מסה נרשמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר רכישת נתונים, לשים את לייזר, electrospray ואת ספקטרומטר מסה במצב המתנה או לכבות אותם. שמור את א ablated cepa דגימה להסתכלות אופציונלי על ידי מיקרוסקופ אור. </li></ol> 6. נציג תוצאות אבלציה מוצלחת של התוצאות תא בודד בתוך התפוצצות של התא הקיר ואת האוסף של הספקטרום מסה LAESI. ניסוי מוצלח בדרך כלל התוצאות לא אבלציה ו / או לא ספקטרום המונית. למטרות הדגמה, אנו מציגים את התוצאות מניתוח LAESI-MS של תא בודד אפידרמיס מוטבע א cepa הנורה. ציור 2a מראה תמונה נציג מיקרוסקופיה אופטית לאחר דגימה של תא. דופן התא הוא מחורר והיקף ניקוב הוא מוגבל על ידי גבולות עם תאים שכנים. תאים סמוכים נראה שלם. איור 2b מראה ספקטרום המונית נציג LAESI המופק התא. מגוון רחב של יונים מזוהים מ - א ' cepa סלולריים המבוססים על מסות מדויק שלהם, דפוסי איזוטופ הפצה, במקרים מסוימים, ספקטרה טנדם המונית, הם מוקצים בהיסוס אל מטבוליטים אנדוגני. יונים מזוהה מתא בודד היו דומים לאלה שנצפו בניתוח של רקמות זהה על ידי קונבנציונאלי LAESI-MS של תאים רבים. 13 <img src="/files/ftp_upload/2144/2144fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. ניתוח סכמטי של תא בודד על ידי LAESI-MS. הדופק אמצע IR לייזר בשילוב לתוך סיב אופטי ונמסרו המדגם להציב בשקופית זכוכית. קצה סיב חידד מתמקד האור לתוך התא היעד ואת האנרגיה שהופקדו התפרצויות התא. פלומת אבלציה המיוצר (נקודות אדומות) היא התמזגה עם פלומת electrospray (נקודות שחורות) הטיפות להתגבש (נקודות ירוקות) וכתוצאה מכך ייצור יון ספציפי המדגם. יונים אלה הם נותחו זוהה על ידי ספקטרומטר מסה (MS). שני ארוכות וידאו מרחק מיקרוסקופים, מיקרוסקופ מיקרוסקופ 1 ו 2, מנוצלים כדי לפקח על המרחק בין קצה סיבים על פני התא כדי לבחור תא לניתוח, בהתאמה. <img src="/files/ftp_upload/2144/2144fig2a.jpg" alt="איור 2א" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2a"> איור 2 א. אבלציה סימן על תא אפידרמיס בודד של א ' cepa הנורה. תאים סמוכים אינם מציגים נזק לעין, ולאחר מכן ניתן לנתח בנפרד. <img src="/files/ftp_upload/2144/2144fig2b.jpg" alt="איור 2ב" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2b"> איור 2b. המוניים המתאימים אבלציה של א 'אחד ספקטרום תא אפידרמיס cepa מראה נוכחות של מטבוליטים ראשוניים ומשניים.

<ol><li>Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ambient Mass Spectrometry.</a> Science. 311, 1566-1570 (2006).</li>
<li>Chen, Z. Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+plume+expansion+in+atmospheric+pressure+midinfrared+laser+ablation+of+water-rich+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Early plume expansion in atmospheric pressure midinfrared laser ablation of water-rich targets.</a> Physical Review E. E77, 036316-036316 (2008).</li>
<li>Li, Y., Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+Pressure+Molecular+Imaging+by+Infrared+MALDI%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry.+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Atmospheric Pressure Molecular Imaging by Infrared MALDI.</a> Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 79, 523-532 (2006).</li>
<li>Li, Y., Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+Pressure+Infrared+MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry+for+Plant+Metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Atmospheric Pressure Infrared MALDI Imaging Mass Spectrometry for Plant Metabolomics.</a> Analytical Chemistry. 80, 407-420 (2007).</li>
<li>Nemes, P., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+for+Atmospheric+Pressure+in+Vivo%2C+and+Imaging+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Laser Ablation Electrospray Ionization for Atmospheric Pressure in Vivo, and Imaging Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 79, 8098-8106 (2007).</li>
<li>Shrestha, B., Li, Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+pharmaceuticals+and+excreted+xenobiotic+and+endogenous+metabolites+with+atmospheric+pressure+infrared+MALDI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of pharmaceuticals and excreted xenobiotic and endogenous metabolites with atmospheric pressure infrared MALDI mass spectrometry.</a> Metabolomics. 4, 297-311 (2008).</li>
<li>Nemes, P., Barton, A. A., Li, Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient+Molecular+Imaging+and+Depth+Profiling+of+Live+Tissue+by+Infrared+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ambient Molecular Imaging and Depth Profiling of Live Tissue by Infrared Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 80, 4575-4582 (2008).</li>
<li>Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Imaging+of+Metabolites+in+Tissues+under+Ambient+Conditions+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Imaging of Metabolites in Tissues under Ambient Conditions by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81, 6668-6675 (2009).</li>
<li>Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Imaging+of+Small+Metabolites+and+Lipids+in+Rat+Brain+Tissues+at+Atmospheric+Pressure+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Imaging of Small Metabolites and Lipids in Rat Brain Tissues at Atmospheric Pressure by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 82, 982-988 (2010).</li>
<li>Shrestha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+analysis+of+lipids+and+small+metabolites+in+mouse+brain+tissue+by+AP+IR-MALDI+and+reactive+LAESI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Direct analysis of lipids and small metabolites in mouse brain tissue by AP IR-MALDI and reactive LAESI mass spectrometry.</a> Analyst. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Sripadi, P., Nazarian, J., Hathout, Y., Hoffman, E., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+analysis+of+metabolites+from+the+untreated+tissue+of+Torpedo+californica+electric+organ+by+mid-infrared+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">In vitro analysis of metabolites from the untreated tissue of Torpedo californica electric organ by mid-infrared laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Metabolomics. 5, 263-276 (2009).</li>
<li>Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Metabolic+Profiling+of+Single+Cells+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In Situ Metabolic Profiling of Single Cells by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81, 8265-8271 (2009).</li>
<li>Shrestha, B., Nemes, P., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+and+Analysis+of+a+Single+Cell+by+Consecutive+Laser+Pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+A%22%5BJournal%5D)">Ablation and Analysis of a Single Cell by Consecutive Laser Pulses.</a> Applied Physics A. , (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תכולת המים של הציטופלסמה של התא ואת חוזק מתיחה של קיר התא או הממברנה הם גורמים קריטיים הקובעים את אבלציה של תאים בודדים במהלך ניתוח LAESI-MS. השטף הלייזר חייב להיות מותאם כדי להגיע אל סף אבלציה של סוגי תאים שונים. השטף לייזר נמסר תלוי באנרגיה של הדופק לייזר על המרחק בין קצה סיבים על פני התא. צמצום ההפרעות של תאים שכנים במהלך הניתוח תא בודד הוא קריטי. שמירה על אנרגיית הלייזר על סף אבלציה מגביל את ההשפעה של הניתוח על תאים סמוכים. אחד היישומים האפשריים הוא באמצעות תאים בודדים כמו פיקסלים נפח טבעי (voxels) עבור דימות כימי על ידי MS. לעומת איסוף נתונים על רשת מלבני לעתים קרובות מלאכותי, דימות כימי של תא רקמת אחד בכל פעם, סביר יותר כדי לשמר את הארגון המרחבי של יחסי הגומלין הביוכימיים בין תאים.

<table><tbody><tr><td>חומצה אצטית</td><td>Fluka</td><td>45727</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>Fluka</td><td>65548</td><td></td></tr><tr><td>1-methyl-2-pyrrolidinon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M79603</td><td></td></tr><tr><td>מים</td><td>Fluka</td><td>39259</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח ישיר של תאים בודדים באמצעות ספקטרומטריית מסה בלחץ אטמוספרי

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

ניתוח ביוכימיים בתאים אחד חשוב להבנת מטבוליזם התא, מחזור התא, הסתגלות, מצבי מחלה, וכו &#39;גם סוגי תאים באותה תערוכה איפור ביוכימיים הטרוגניות בהתאם לתנאי פיזיולוגיים שלהם ואת האינטראקציות עם הסביבה. בשיטות המקובלות של ספקטרומטריית מסה (MS) המשמשים לניתוח של ביומולקולות בתא בודד להסתמך על הכנה מדגם נרחב. הסרת תאים בסביבתם הטבעית ועיבוד מדגם נרחב יכול להוביל שינויים בהרכב הסלולר. שיטות יינון אמביינט לאפשר ניתוח של דגימות בסביבה המקורית שלהם, ללא הכנה מדגם נרחב. 1 הטכניקות המבוסס על אבלציה אמצע לייזר אינפרא אדום (אמצע IR) של חומרים ביולוגיים באורך גל 2.94 מיקרומטר לנצל את עירור פתאומית של מים כי תוצאות שלב הפיצוץ. 2 שיטות יינון אמביינט מבוסס על קרינה אמצע IR לייזר, כגון יינון אבלציה electrospray לייזר (LAESI) ובלחץ אטמוספרי אינפרא אדום מטריצה ​​בעזרת לייזר יינון desorption (AP IR-MALDI), הוכיחו בהצלחה את היכולת לנתח ישירות מים רקמות עשירות biofluids בלחץ אטמוספרי. 3-11 ב LAESI אמצע IR אבלציה לייזר פלומת כי בעיקר מורכב של חומר חלקיקי ניטרלי מן המדגם מתמזגת עם טיפות electrospray טעון לייצר יונים. לאחרונה, אמצע IR אבלציה של תאים בודדים בוצעה על ידי מתן קרינה אמצע IR באמצעות סיב חרוט. פלומת שנוצר אבלציה זה היה postionized ידי electrospray המאפשר ניתוח של מטבוליטים שונים בתאי יחיד על ידי LAESI-MS. 12 מאמר זה מתאר את פרוטוקול מפורט לניתוח תא בודד באמצעות LAESI-MS. הסרטון הציג מדגים את הניתוח של תא אפידרמיס בודד מן העור של הנורה Allium cepa. סכמטי של המערכת מוצג באיור 1. למשל נציג אבלציה תא יחיד קשת מסה LAESI מהתא ניתנים באיור 2.

ניתוח תא יחיד מבוצע על ידי ספקטרומטריית מסה בתאי צמחים ובעלי חיים בלחץ אטמוספרי באמצעות סיב אופטי מחודד המדגם תאים יינון אבלציה electrospray לייזר (LAESI) ספקטרומטריית מסה.

ניתוח של חומרים ביוכימיים בתאים בודדים הוא חשוב להבנת מטבוליזם של תאים, מחזור התא, הסתגלות, מצבי מחלה וכדומה. אפילו אותו תא...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להוציא את תוכנו של תא חי בודד וליינן את הביומולקולות ששוחררו לצורך ניתוח באמצעות ספקטרומטר מסות בלחץ אטמוספרי. דבר זה מושג על ידי בחירת תא בודד באמצעות מיקרוסקופ למרחק רב ואבליציה של התא הנבחר באמצעות פולס לייזר באורך גל של 2.94 micrometer המועבר דרך סיב אופטי מחודד. האבליציה של תא בודד תוביל להיווצרות של ענן מיקרוסקופי של חומר חלקיקי ניטרלי ליינון ענן האבליציה.הן נלכדות על ידי רסס אלקטרוסטטי (electro spray). טיפות הטעונה מהרסס מתאחות עם החלקיקים של עננת האבלאציה (ablation plume) שמקורה בתא. הטיפות שנוצרות מזורעות במולקולות מהתא ומייצרות את היונים הרלוונטיים.התוצאות שהתקבלו מראות ספקטרום מס מתא בודד. הספקטרום מכיל שיאים רבים הקשורים למטבוליטים ולליפידים של התא. שלום, אני ד"ר Bin Drester ממעבדת Verese במחלקה לכימיה באוניברסיטת ג'ורג' וושינגטון.היום נראה לכם את הפרוצדורה לניתוח ישיר של תאי חיים בודדים באמצעות ספקטרומטריית מסות בלחץ אטמוספרי. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור מטבוליטים וליפידים מתאי צמח ובעל חיים בודדים. אז בואו נתחיל.אבלאציה בלייזר עבור אבלאציה בלייזר, יינון בהתזה חשמלית, ספקטרומטריית מסות, או LAZI-MS, מופקת על ידי פולס לייזר של חמישה ננו-שניות באורך גל של 2.94 מיקרומטר. במחקר זה, עבור האבלאציה, נעשה שימוש באוסצילטור פרמטרי אופטי כיוון (Tunable optical parametric oscillator) המונע על ידי לייזר Neodymium YAG.כדי להתחיל, הרכבו את הקצה החרוט של סיב אופטי על מיקרו-מניפולטור וקרבו אותו אל פני השטח של התא. להשקעת אנרגיה יעילה, החזיקו את הקצה הבלתי חרוט של הסיב האופטי באמצעות תפס סיב חשוף לצורך כיוון אופטי. תפס הסיב מורכב על מתרגם בעל חמישה צירים.השביחו את אנרגיית הלייזר אל תוך הסיב על ידי מיקוד הקורה באמצעות עדשה קמורה-מישורית העשויה מפלוריד סידן או עדשת סלניום-אבץ בעלת ציפוי אנטי-רפלקציה אל קצהו הלא-חרוט של הסיב; השתמשו במראות זהב מוגנות כדי לכוון את קורת הלייזר בטווח האינפרא-אדום הרחוק אל עדשת המיקוד. כדי לשמור על המרחק בין קצה הסיב המחודד לפני השטח של התא, השתמשו במיקרוסקופ וידאו למרחקים ארוכים המותקן בזווית של 15 עד 30 מעלות ביחס לפני השטח. מערכת זו כוללת גם עדשת אובייקטיב עם תיקון אינסוף בפי 5, המצוידת במצלמת CCD לצורך ניטור ולכידת תמונה.מיקרוסקופ וידאו שני מותקן בזווית ישרה למשטח הדגימה כדי להדמין את התאים מלמעלה ולבחור אותם לאנליזה. מערכת זו מספקת משוב חזותי לצורך יישור קצה הסיב מעל התא הנבחר לצורך אבלציה ואנליזה. היא מורכבת מאופטיקת זום מדויקת בעלת הגברה של שבע פעמים, עם עדשת אובייקטיב בעלת מרחק עבודה ארוך המתוקנת לאינסוף והגברה של 10 פעמים, ומצלמת CCD.מערכת התזת האלקטרוספריי הוקמה באמצעות מחבר מתכת עם אביזרים מוליכים של per fluoro, elastomer, feral, צינוריות, שרוול ליציאת מחט, וכן צינוריות FU silica. הפולט המומלץ עשוי פלדת אל חלודה ובעל קצה קוני בקוטר 50 micrometer. הכינו תמיסת 50% methanol עם 0.1% acetic acid עבור האלקטרוספריי. דחפו את התמיסה בקצב של 200 עד 300 nanoliters לדקה באמצעות משאבת מזרק.באמצעות מזרק של 500 µL, יחיל ספק כוח מנויס מתח גבוה של בין 2,803,000 V על החיבור המתכתי. כדי להפיק תרסוס חשמלי (electrospray) יציב, ודאו שכל החיבורים החשמליים מאובטחים ומגוננים באמצעות מיגון, ומקורקים כראוי, שכן מגע ישיר עם מתח גבוה חשוף עלול לגרום להלם חשמלי. השג את דגימת הרקמה החיה או התאים ממקור מתאים ושמור אותם לפי ההמלצות לפני הניתוח.נשקי Allium cepa להדגמה זו נרכשו מחנות מקומית. להכנת דגימות של נשקי Allium cepa, חתכו את הנשק לאורכו באמצעות סכין מנתחים וגזרו מקטע של כ-2 סמ"ר מהקשקש של נשק הבצל. לאחר מכן, קלפו שכבה אחת שלמה של רקמת האפידרמיס הפנימית. השתמשו במשטח הרטוב של האפידרמיס כדי להניח את הרקמה על זכוכית של תיתרה מיקרוסקופית שננקתה מראש.החזיקו את העגילה באמצעות מחזיק פלטות רב-תכליתי, המורכב על במה העברה בעלת שלושה צירים לצורך מיקום. מיד לאחר קיבוע הדגימה, רכשו את ספקטראות המסות כדי למנוע התפרקות של התאים. התחילו בהפעלה של הלייזר, התזת האלקטרונים (electrospray) וספקטרומטר המסות.בצע אופטימיזציה של גיאומטריית מקור היונים העצל (lazy ion source) על ידי כיוונון מיקום נקודת האבלציה ופולט הרסס החשמלי (electro spray emitter) ביחס זה לזה וביחס לנחיר (orifice) של ספקטרומטר המסות. כדי להשיג עוצמת יונים מקסימלית, בחר את התא הרלוונטי לניתוח באמצעות מערכת הוויזואליזציה של התצוגה העליונה. לאחר הבחירה, הזז את במה של הדגימה כדי להביא את התא שנבחר ישירות מתחת לקצה המושחז של הסיב האופטי.באמצעות מיקרוסקופ עם מבט צדי, כווננו מחדש את המרחק בין הקצה לפני השטח של התא לכ-20 מיקרון. כאשר הקצה נמצא במיקום הנכון, שלחו פולסי לייזר אל התא הנבחר דרך קצה הסיב החרוט. פעולה זו תוביל לניקוב של דופן התא ולהזרקה של הציטופלזמה בצורת חומר חלקיקי.לאחר יינון פוסט-יינוני על ידי התזת האלקטרונים, האיונים שנוצרו נאספים על ידי ספקטרומטר המסה וספקטרומי מסה נרשמים. לאחר רכישת הנתונים, העבירו את הלייזר, את התזת האלקטרונים ואת ספקטרומטר המסה למצב המתנה או כבו אותם. שמרו את דגימת רקמת ה-allium cper שעברה אבלציה לצורך תצפית אופציונלית במיקרוסקופ אור; אבלציה מוצלחת של תא בודד מובילה לפריצת דופן התא ולאיסוף של ספקטרום מסה עמום.להלן התוצאות של ניתוח ה-lazy MS של תא אפידרמי בודד המוטמע בבצל של allium SEPA, המלווה בתמונת מיקרוסקופיה אופטית מייצגת. לאחר דגימת התא, דופן התא ננקבת, והיקף הנקברה מוגבל על ידי הגבולות עם התאים השכנים. נראה כי התאים הסמוכים נותרו שלמים.כאן מוצג ספקטרום מסות לייזר מייצג שהופק מהתא. מגוון רחב של יונים מזוהים מהתא של ה-allium sea, ובהתבסס על המסות המדויקות שלהם, דפוסי התפלגות האיזוטופים וספקטראות מסות טנדם, היונים משויכים בקפידה למטבוליטים אנדוגניים. היונים שזוהו בתא בודד היו דומים לאלו שנצפו בניתוח של אותו רקמה באמצעות MS לייזר קונבנציונלי של תאים מרובים.הראינו לכם כעת כיצד לנתח תאי חיים בודדים באמצעות ספקטרומטריית מסה בלחץ אטמוספרי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להרכיב משקפי מגן כדי למנוע חשיפה מקרית ללייזרים באינפרה-אדום מסוג class four. זה הכל.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

direct-analysis-single-cells-mass-spectrometry-at-atmospheric

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Electrospray לייזר אבלציה יינון (LAESI) הוא מקור של לחץ אטמוספרי יון עבור ספקטרומטריית מסה. במצב הדמיה, אמצע אינפרא אדום בדיקות הלייזר הפצות של מולקולות על פני קטע רקמה או biofilm. טכניקה זו מציגה גישה חדשה ללימודי bioanalytical מגוונים שבוצעו תחת תנאים ניסויים הילידים.

בלחץ אטמוספרי מולקולרית והדמיה של רקמות ביולוגיות באמצעות Biofilms LAESI המוניים ספקטרומטריית

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לביצוע הדמיית ספקטרומטריית מסה סביבתית (MSI) של רקמות וניתוח MS של תא יחיד (SCMS) באתרו באמצעות בדיקה יחידה, שהיא מכשיר רב תכליתי ממוזער לניתוח טרשת נפוצה.

יישומים של-הבדיקה הבודדה: הדמיה ספקטרומטריית מסה וניתוח תא יחיד בתנאי הסביבה

שיטה לזיהוי מינים של חומר בוטני על ידי ניתוח ישיר ב ספקטרומטריית מסה ברזולוציה זמן-גבוה אמיתי ניתוח סטטיסטי רב משתני מוצג.

ראפיד תפוקה גבוהה זיהוי מינים של חומר הבוטני באמצעות ניתוח ישיר בזמן אמת רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה

אנו מתארים צעדים המאפשרים דיגום מהיר בתוך באתרו של חלק קטן של תא יחיד עם דיוק גבוהה, הפלישה מינימלי באמצעות נימי מיקרו-דגימה, כדי להקל על אפיון כימי של תמונת מצב של פעילות מטבולית חיים העוברים באמצעות אלקטרופורזה נימי תא בודד לפי הזמנה ספקטרומטר מסה פלטפורמה.

Microprobe נימי אלקטרופורזה ספקטרומטריית עבור מטבולומיקס תא בודד ב- Live צפרדע (צפרדע רפואית זריזה) העוברים

פלטפורמת מניפולציה משולבת תא מפותחת לשימוש בשילוב עם התקנה בודדת המסה בדיקה מאסיבית עבור ניתוח מקוון של תאים ההשעיה בודדים תחת תנאי הסביבה.

משולב תאים מניפולציה פלטפורמה ביחד עם יחיד-בדיקה עבור ניתוח ספקטרומטר המסה של תרופות מטבוליטים בתאים ההשעיה יחיד

פרוטוקול זה מציג את פלטפורמת משולבת ראמאן ספקטרוסקופית (MS) של המסה המסוגלת להשיג רזולוציה של תא בודד. ספקטרוסקופית ראמאן ניתן להשתמש כדי ללמוד תגובה תאית לסמים, בעוד MS יכול לשמש ניתוח ממוקד וכמותי של ספיגת התרופה ואת חילוף החומרים.

ספקטרוסקופיית ראמאן משולבת ופלטפורמת ספקטרומטר המסה ללימוד תא יחיד קליטת סמים, מטבוליזם, ואפקטים

בפרוטוקול זה אנו מתארים כיצד להכין תאי יונקים לניתוח פרוטאומיקה חד-תאית באמצעות ספקטרומטריית מסה באמצעות ריאגנטים וציוד זמינים מסחרית, עם אפשרויות לפיפטציה ידנית ואוטומטית כאחד.

הכנה לפרוטאומיקה חד-תאית לניתוח ספקטרומטריית מסה באמצעות ליזיס הקפאת חום ונשא איזוברי

פרוטוקול זה נועד לשמר מטבוליטים של תאים עבור ספקטרומטריית מסה של תא בודד (SCMS) על ידי שילוב של שטיפת תמיסת מלח נדיפה, מרווה חנקן נוזלי מהיר, ייבוש בהקפאה ואחסון של -8 מעלות צלזיוס. הוא מדגים כי כיבוי חנקן נוזלי חיוני לשמירה על פרופילי מטבוליטים, בעוד שיש למזער אחסון קר ממושך כדי למנוע שינויים מטבוליים.

הכנת מדגם למחקרי מטבולומיקה של ספקטרומטריית מסה של תא בודד: שטיפת תאים משולבת, מרווה, ייבוש ואחסון

פרוטוקול זה מתאר הדמיית ספקטרומטריית מסה חד-תאית של תאי OVCAR-8 באמצעות יינון אלקטרוספריי דספורפציה המחובר לספקטרומטרי מסה Orbitrap לניתוח מטבולומי ברזולוציה מרחבית גבוהה.

הדמיית ספקטרומטריית מסה חד-תאית באמצעות יינון אלקטרוספריי בדסורפציה המשולבת לספקטרומטרי מסה של Orbitrap

וידאו זה מדגים את הכנת שכבת מטריצה ​​/ אנליטי דקים לניתוח פפטידים וחלבונים על ידי מטריקס בסיוע לייזר desorption Ionization המוניים ספקטרומטריית (MALDI-MS).

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

למד ניתוח תאים בודדים ישירים באמצעות ספקטרומטריית מסה LAESI בלחץ אטמוספרי. שיטה זו מאפשרת זיהוי מטבוליטים וליפידים בתאי צמחים ובעלי חיים ללא הכנה מקדימה נרחבת.

ניתוח ישיר של תאים בודדים באמצעות ספקטרומטריית מסה בלחץ אטמוספרי

גלה סרטונים נוספים