ניתוח ישיר של תאים בודדים באמצעות ספקטרומטריית מסה בלחץ אטמוספרי

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להוציא את תוכנו של תא חי בודד וליינן את הביומולקולות ששוחררו לצורך ניתוח באמצעות ספקטרומטר מסות בלחץ אטמוספרי. דבר זה מושג על ידי בחירת תא בודד באמצעות מיקרוסקופ למרחק רב ואבליציה של התא הנבחר באמצעות פולס לייזר באורך גל של 2.94 micrometer המועבר דרך סיב אופטי מחודד. האבליציה של תא בודד תוביל להיווצרות של ענן מיקרוסקופי של חומר חלקיקי ניטרלי ליינון ענן האבליציה.

הן נלכדות על ידי רסס אלקטרוסטטי (electro spray). טיפות הטעונה מהרסס מתאחות עם החלקיקים של עננת האבלאציה (ablation plume) שמקורה בתא. הטיפות שנוצרות מזורעות במולקולות מהתא ומייצרות את היונים הרלוונטיים.

התוצאות שהתקבלו מראות ספקטרום מס מתא בודד. הספקטרום מכיל שיאים רבים הקשורים למטבוליטים ולליפידים של התא. שלום, אני ד"ר Bin Drester ממעבדת Verese במחלקה לכימיה באוניברסיטת ג'ורג' וושינגטון.

היום נראה לכם את הפרוצדורה לניתוח ישיר של תאי חיים בודדים באמצעות ספקטרומטריית מסות בלחץ אטמוספרי. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור מטבוליטים וליפידים מתאי צמח ובעל חיים בודדים. אז בואו נתחיל.

אבלאציה בלייזר עבור אבלאציה בלייזר, יינון בהתזה חשמלית, ספקטרומטריית מסות, או LAZI-MS, מופקת על ידי פולס לייזר של חמישה ננו-שניות באורך גל של 2.94 מיקרומטר. במחקר זה, עבור האבלאציה, נעשה שימוש באוסצילטור פרמטרי אופטי כיוון (Tunable optical parametric oscillator) המונע על ידי לייזר Neodymium YAG.

כדי להתחיל, הרכבו את הקצה החרוט של סיב אופטי על מיקרו-מניפולטור וקרבו אותו אל פני השטח של התא. להשקעת אנרגיה יעילה, החזיקו את הקצה הבלתי חרוט של הסיב האופטי באמצעות תפס סיב חשוף לצורך כיוון אופטי. תפס הסיב מורכב על מתרגם בעל חמישה צירים.

השביחו את אנרגיית הלייזר אל תוך הסיב על ידי מיקוד הקורה באמצעות עדשה קמורה-מישורית העשויה מפלוריד סידן או עדשת סלניום-אבץ בעלת ציפוי אנטי-רפלקציה אל קצהו הלא-חרוט של הסיב; השתמשו במראות זהב מוגנות כדי לכוון את קורת הלייזר בטווח האינפרא-אדום הרחוק אל עדשת המיקוד. כדי לשמור על המרחק בין קצה הסיב המחודד לפני השטח של התא, השתמשו במיקרוסקופ וידאו למרחקים ארוכים המותקן בזווית של 15 עד 30 מעלות ביחס לפני השטח. מערכת זו כוללת גם עדשת אובייקטיב עם תיקון אינסוף בפי 5, המצוידת במצלמת CCD לצורך ניטור ולכידת תמונה.

מיקרוסקופ וידאו שני מותקן בזווית ישרה למשטח הדגימה כדי להדמין את התאים מלמעלה ולבחור אותם לאנליזה. מערכת זו מספקת משוב חזותי לצורך יישור קצה הסיב מעל התא הנבחר לצורך אבלציה ואנליזה. היא מורכבת מאופטיקת זום מדויקת בעלת הגברה של שבע פעמים, עם עדשת אובייקטיב בעלת מרחק עבודה ארוך המתוקנת לאינסוף והגברה של 10 פעמים, ומצלמת CCD.

מערכת התזת האלקטרוספריי הוקמה באמצעות מחבר מתכת עם אביזרים מוליכים של per fluoro, elastomer, feral, צינוריות, שרוול ליציאת מחט, וכן צינוריות FU silica. הפולט המומלץ עשוי פלדת אל חלודה ובעל קצה קוני בקוטר 50 micrometer. הכינו תמיסת 50% methanol עם 0.1% acetic acid עבור האלקטרוספריי. דחפו את התמיסה בקצב של 200 עד 300 nanoliters לדקה באמצעות משאבת מזרק.

באמצעות מזרק של 500 µL, יחיל ספק כוח מנויס מתח גבוה של בין 2,803,000 V על החיבור המתכתי. כדי להפיק תרסוס חשמלי (electrospray) יציב, ודאו שכל החיבורים החשמליים מאובטחים ומגוננים באמצעות מיגון, ומקורקים כראוי, שכן מגע ישיר עם מתח גבוה חשוף עלול לגרום להלם חשמלי. השג את דגימת הרקמה החיה או התאים ממקור מתאים ושמור אותם לפי ההמלצות לפני הניתוח.

נשקי Allium cepa להדגמה זו נרכשו מחנות מקומית. להכנת דגימות של נשקי Allium cepa, חתכו את הנשק לאורכו באמצעות סכין מנתחים וגזרו מקטע של כ-2 סמ"ר מהקשקש של נשק הבצל. לאחר מכן, קלפו שכבה אחת שלמה של רקמת האפידרמיס הפנימית. השתמשו במשטח הרטוב של האפידרמיס כדי להניח את הרקמה על זכוכית של תיתרה מיקרוסקופית שננקתה מראש.

החזיקו את העגילה באמצעות מחזיק פלטות רב-תכליתי, המורכב על במה העברה בעלת שלושה צירים לצורך מיקום. מיד לאחר קיבוע הדגימה, רכשו את ספקטראות המסות כדי למנוע התפרקות של התאים. התחילו בהפעלה של הלייזר, התזת האלקטרונים (electrospray) וספקטרומטר המסות.

בצע אופטימיזציה של גיאומטריית מקור היונים העצל (lazy ion source) על ידי כיוונון מיקום נקודת האבלציה ופולט הרסס החשמלי (electro spray emitter) ביחס זה לזה וביחס לנחיר (orifice) של ספקטרומטר המסות. כדי להשיג עוצמת יונים מקסימלית, בחר את התא הרלוונטי לניתוח באמצעות מערכת הוויזואליזציה של התצוגה העליונה. לאחר הבחירה, הזז את במה של הדגימה כדי להביא את התא שנבחר ישירות מתחת לקצה המושחז של הסיב האופטי.

באמצעות מיקרוסקופ עם מבט צדי, כווננו מחדש את המרחק בין הקצה לפני השטח של התא לכ-20 מיקרון. כאשר הקצה נמצא במיקום הנכון, שלחו פולסי לייזר אל התא הנבחר דרך קצה הסיב החרוט. פעולה זו תוביל לניקוב של דופן התא ולהזרקה של הציטופלזמה בצורת חומר חלקיקי.

לאחר יינון פוסט-יינוני על ידי התזת האלקטרונים, האיונים שנוצרו נאספים על ידי ספקטרומטר המסה וספקטרומי מסה נרשמים. לאחר רכישת הנתונים, העבירו את הלייזר, את התזת האלקטרונים ואת ספקטרומטר המסה למצב המתנה או כבו אותם. שמרו את דגימת רקמת ה-allium cper שעברה אבלציה לצורך תצפית אופציונלית במיקרוסקופ אור; אבלציה מוצלחת של תא בודד מובילה לפריצת דופן התא ולאיסוף של ספקטרום מסה עמום.

להלן התוצאות של ניתוח ה-lazy MS של תא אפידרמי בודד המוטמע בבצל של allium SEPA, המלווה בתמונת מיקרוסקופיה אופטית מייצגת. לאחר דגימת התא, דופן התא ננקבת, והיקף הנקברה מוגבל על ידי הגבולות עם התאים השכנים. נראה כי התאים הסמוכים נותרו שלמים.

כאן מוצג ספקטרום מסות לייזר מייצג שהופק מהתא. מגוון רחב של יונים מזוהים מהתא של ה-allium sea, ובהתבסס על המסות המדויקות שלהם, דפוסי התפלגות האיזוטופים וספקטראות מסות טנדם, היונים משויכים בקפידה למטבוליטים אנדוגניים. היונים שזוהו בתא בודד היו דומים לאלו שנצפו בניתוח של אותו רקמה באמצעות MS לייזר קונבנציונלי של תאים מרובים.

הראינו לכם כעת כיצד לנתח תאי חיים בודדים באמצעות ספקטרומטריית מסה בלחץ אטמוספרי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להרכיב משקפי מגן כדי למנוע חשיפה מקרית ללייזרים באינפרה-אדום מסוג class four. זה הכל.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.