Name: הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo /em (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: למד הדמיית אינטראקציות חלבון-חלבון בתאי אנדותל בשיטת FRET מבוססת מיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו מאפשרת חקר אינטראקציות קולטנים במהלך אנגיוגנזה בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו רוצים להודות ד&quot;ר סקוט הנדרסון לעזרה עם מיקרוסקופיה confocal. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות 1RO1CA127501 כדי WAB, כמו גם מימון הפרויקט טייס ממרכז הסרטן מאסי ואת בית הספר לרפואה (VCU) כדי מיקרוסקופית WAB בוצע ב-VCU Dept. לנוירוביולוגיה &amp; אנטומיה מיקרוסקופית מתקן, נתמך, בין היתר, במימון מרכז NIHNINDS הליבה מענק 5P30NS047463.

פרוטוקול מורכב משלושה שלבים עיקריים. השיבוט הראשון, הצעד של הגן העניין שלך לתוך ביטוי יונקים וקטור אמינו סופני לגירסאות monomeric של CFP ו / או YFP יהיה רק ​​דנו בקצרה. השלבים השני והשלישי; transfection של דנ"א לתוך וקטור EA.hy926 לתאי אנדותל, הדמיה confocal עם סריג, המפורטות יותר לעומק בהמשך. 1. בנייה של קולטנים CFP ו YFP chimeric רצפטורים של עניין צריך להיות משובטים אמינו סופני כדי monomeric גרסאות משופרות של CFP ו YFP. קביעת סריג היא אמפירית תלויה באופן קריטי על אורך של והמקשר בין הטרנסממברני פורש האזור תחילת fluorophore 1. לכן, באורכים שונים של והמקשר חייב להיחקר עבור כל זוג קולטן חדש תחת חקירה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Into the pcDNA3.1 hygro R או ניאו וקטור המכיל C-R או monomeric YFP (זה וקטור ניתן לקבל במעבדה שלנו), שיבוט קולטן העניין שלך לתוך האתרים NheI / EcoRI. * הערה, אם יש צורך, NheI תואם אנזימים אחרים, כולל SpeI ו XbaI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרה התגובה קשירת שלך לתוך קו התא המתאים recA endA1 המוסמכת (אנו משתמשים באופן שגרתי Mach1). מושבות מסך נוכחות של הכנס ואחריו רצפי DNA כדי לוודא היעדר מוטציות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם קבלת קונפורמציה של שיבוט מולקולרי מוצלח, להכין transfection כיתה DNA וקטור במים מעוקרים או TE באמצעות Qiagen, או דומה, ערכות ה-DNA. הערכת הריכוז טוהר באמצעות ספקטרוסקופית UV. התשואות אופיינית של ה-DNA צריך להיות בטווח של 100-200 מיקרוגרם, שהוא מדולל באופן שגרתי למלאי עבודה של 1 מיקרוגרם / μL. </li></ol> 2. Transfection של 926 תאים EA.hy <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול EA.hy 926 תאים 4, גדל להשלים-DMEM (DMEM 10% בסרום שור עוברית + Pen. / דלקת.) לתוך MatTek coverslip (מס '0) 35 מ"מ עם מנות בינוני 2 מ"ל. אתה יכול להשיג שמרני ~ 15 מנות (~ 90% ומחוברות למחרת) מתוך קערה ומחוברות 15 ס"מ. הכינו צלחת אחת להעריך הביטוי של הקולטן בנפרד, כמו גם מנה אחת לכל זוג הקולטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר התאים כדי לדגור לילה באווירה 5% CO 2 ב 37 ° C. למחרת, תרבויות יש ~ ומחוברות 70-90%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום transfection, להכין את מתחמי nucleolipid ידי ערבוב 2 מיקרוגרם של ה-DNA וקטור chimeric קולטן (2 μL) עם 8 μL של Fugene6 ב 200 μL של OptiMEM מראש התחמם. עבור זוגות קולטן, transfect עם 1 מיקרוגרם של קולטן זה, עבור סכום כולל של מיקרוגרם 2 (ראה גם דיון בהמשך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות על ידי היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופת הדגירה, להכין את התאים transfection. לשאוב את התקשורת טרי לשטוף כל צלחת בעדינות בקצרה עם PBS חמים לפני תוספת של 2 מ"ל מראש חימם להשלים-DMEM ללא אנטיביוטיקה (DMEM + FBS). חשוב למנוע את נוכחותו של פניצילין וסטרפטומיצין, כפי שהם הרבה יותר רעיל לתאים במהלך הטיפול עם Fugene6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הירידה מורכב חכם תאים דגירה של 20-24 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס אווירה של 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, לשאוב היטב את התקשורת בין התאים פיפטה טרי שלם, DMEM עם אנטיביוטיקה. בעקבות transfection, כדאיות התא צריך להישאר גבוהה יחסית, כלומר לא מעט תאים צף יש לשים לב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התבטאות גנים היא מקסימאלית בדרך כלל לאחר 48-60 שעות נוספות שלאחר transfection. עם זאת, הדמיה אפשרית בדרך כלל קצר כמו 24 שעות. כמובן הזמן ניסויים על ביטוי גנים אופטימלי יש לבצע. </li></ol> 3. הדמיה confocal ו סריג ניתוח חיים הדמיה תא מבוצע על מיקרוסקופ TCS-SP2 לייקה confocal לייזר AOBS סריקה מצויד דיודה כחולה (405 ננומטר), ארגון (458, 476, 488, 514 ננומטר). HeNe ירוק (543 ננומטר), כתום HeNe (594 ננומטר), ו HeNe אדום (633 ננומטר) לייזרים, PI HCX Apo 63x/1.3 na-גליצרין טבילה העדשה אובייקטיבי, XY ממונע הבמה (Märzhäuser), וכן לשלוט לסביבה ( טמפרטורה, לחות, ו-CO 2) שלב החממה (Pecon). שולטת ניסויית הן קריטיות כדי לחסל fluorophore צולבות לדבר בין ערוצי פליטה כמו גם להעריך בעיות הביטוי הלא ספציפית multimerization fluorophore. ככזה, transfections fluorophore יחיד מנוצלים עבור הקמת כל מושב התמונה. שלילי סריג שולטת (באמצעות קולטנים noninteracting ידוע) יהיה צורך לבצע, על מנת לקבוע את הרקע סריג כי מתרחשת עקב הבעת פני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע crosstalk בין ערוצי הפליטה CFP ו YFP, במקום לשלוט ביטוי CFP לתוך החממה הבמה. בעזרת אור לבן, להתאים את Z-צלחת להתמקדאל התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת הגדרות SP חלון לגילוי פליטה של ​​CFP על 465-505 ננומטר ו YFP על 525-600 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד ניטור שני ערוצי הפליטה, להלהיב את CFP ב 458 ננומטר. שימוש AOTF, להגדיר את כוח לייזר לחסל לדמם ניכר של מעל CFP לתוך התעלה פליטת YFP. שמור הגדרה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעו את אותה שליטה על YFP crosstalk (באמצעות השלט ביטוי YFP) בערוץ CFP ידי התאמת כוח עירור ב 514 ננומטר עבור תאים להביע YFP בלבד. שמור הגדרה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים המקום הבא שיתוף להביע CFP ו YFP לתוך החממה הבמה. באמצעות קביעת רצף של התוכנה לייקה confocal, לאתר תאים להביע רמות דומות של CFP ו YFP עם לוקליזציה קרום תקין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש acceptor תוכנה לייקה צילום הלבנת התוכנית, קבע את הגדרות התורם acceptor כדי CFP הציל וההגדרות YFP, בצורה מכובדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקרבות אל התא, להדגיש את ההחזר על ההשקעה (אזור של אינטרס) שבו צילום הרס YFP היא מתרחשת על קרום התא ולהתחיל את התוכנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הרס תמונה של acceptor, להתאים את AOTF עד 100% ב 514 ננומטר ולאפשר לייזר הלבנת להימשך עד 70% מכלל הפליטה YFP כבר תיגמר. כדי להאיץ את הלבנה, ROIs נבחרים בדרך כלל הציר סריקה של הלייזר (ציר ה-X). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך צילום הלבנה, לנטר את התנועה הסלולר לדחות מדידות שהושג עם התנועה ניכר מטוס-XY, כמו מדידות אלו ניתן לדווח שקר סריג יעילות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות טרום ופוסט אקונומיקה נרשמות גם עבור התורם (CFP) ו acceptor (YFP) ו סריג יעילות מחושב: סריג EFF = (D-D הודעה מראש) / D הודעה לכל פוסט D&gt; ד מראש כאשר D מראש ו-D הוא לפרסם את עוצמת התורם לפני ואחרי photobleaching בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנת JMP (SAS) משמש כדי לקבוע את מידת ההשתנות ניסיוני. </li></ol> 4. נציג תוצאות יעילות transfection הם בדרך כלל בין 30% עד 40. למרות ממצאים קודמים על ידי אחרים, לא ראינו כי transfection וביטוי של וקטור אחד טובות של האחר. אכן, לעתים קרובות אנו רואים ביטוי הבלעדית של fluorophore one הכימרה או אחר. אופיינית סריג יעילות להשתנות בין מערכות הקולטן. עבור מערכת הקולטן עניבה, הערכים האופייניים הם 20-28% עבור תאים אפיתל 19-23% בתאי האנדותל. עבור פקדים שלילית, יעילות טיפוסית להלן 2-3%. מידת ההשתנות יקטן במידה ניכרת עם ניסיון. <img src="/files/ftp_upload/2149/2149fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. תמונות נציג transfected EA.hy 926 תאים. תמונה) DIC monolayer של 926 תא EA.hy. ב) תמונה פלואורסצנטי של תאים מוצג (A). ג) כיסוי של (א) ו - (ב) הוכחת יעילות ~ transfection 20-30%. <img src="/files/ftp_upload/2149/2149fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. Acceptor נציג צילום הלבנת ניתוח של סריג המתרחשים בין CFP ו YFP בתא EA.hy926. הפליטה CFP ערוץ (לוחות עליון) YFP פליטת ערוץ (למטה שני פאנלים) נוטרו בנפרד לפני ו acceptor הודעה photobleaching. ניסויים photobleaching הוגבלו, ועל סריג ערכים מחושבים מן, האזור בתוך הקופסה הירוקה. סריג יעילות מוצג מגוון מוחלט מ גבוה (אדום 1.0) לנמוך (סגול 0.0) על כיסוי מוגדל של CFP / YFP הממוזגת תמונה לצורך התמצאות בלבד.

<ol><li>Kim, M., Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+transmembrane+signaling+by+cytoplasmic+domain+separation+in+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bidirectional transmembrane signaling by cytoplasmic domain separation in integrins.</a> Science. 301, 1720-1725 (2003).</li>
<li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+lipidmodified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Partitioning of lipidmodified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296, 913-916 (2002).</li>
<li>Seegar, T. C. M., Eller, B., Tzvetkova-Robev, D., Kolev, M., Henderson, S. C., Nikolov, D. B., Barton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tie1-Tie2+interactions+mediate+functional+differences+between+angiopoietin+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Tie1-Tie2 interactions mediate functional differences between angiopoietin ligands.</a> Molecular Cell. 37 (5), 643-655 (2010).</li>
<li>Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+cell+line+expressing+human+factor+VIII-related+antigen+established+by+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (12), 3734-3737 (1983).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

ישנם מספר צעדים אשר הם קריטיים להצלחה. הבולט ביניהם הוא קרוב משפחה של רמות ביטוי בין שני קולטנים chimeric. כדי לעקוף בעיה זו, ניתן להפוך את שורות תאים יציבות להביע הן חלבונים של עניין, או לזהות יחס אופטימלי של ה-DNA וקטור לאפשר ביטוי שווה. כמו כן, בשל transfection לא אחידה על פני צלחת, רמות החלבון יהיה לעתים רחוקות להיות שווה בין תאים. לכן, יש לשים לב כדי להבחין בין &quot;גבוה&quot; expressors מ &#39;נמוך&#39;. אלה כי רמות &quot;ממוצעים&quot; התצוגה של החלבון בדרך כלל תשואה אמין לשחזור סריג יעילות. שיטה אחת במעבדה שלנו קידמה כדי להקל על בעיה זו הוא השימוש adeno ו-lenti וירוסים ביטוי גנים &quot;אפילו&quot;. יתר על כן, שיטה חלופית כדי צילום הלבנת acceptor לקביעת סריג יעילות היא פליטה רגיש. אמנם, למרות הפוטנציאל של פליטת רגיש כדי לפקח על תאים בודדים בזמן אמת, מצאנו צילום הלבנת acceptor להיות רגישים יותר ואמין יותר. לבסוף, בעזרת סריג לפקח על אינטראקציות חלבון יכול להיות מאתגר, דורש בחירה זהירה של אורכי מקשר עבור קולטני קרום כבול. יתר על כן, תוספת של C / YFP לעתים קרובות מאוד משפיע על רמות ביטוי חלבון ותוצאות צבירה ב reticulum endoplasmic ומכשירים golgi. עם זאת, עבור אינטראקציות חולף או לא יציב, סריג הוא מתודולוגיה האידיאלי לנצל.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960-069</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומייסין</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי</td><td>Hyclone</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>FUGENE 6</td><td>Roche Group</td><td>11814443001</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות עם כיסוי זכוכית</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G014C</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1(+)</td><td>Invitrogen</td><td>V790&amp;#8208;20</td><td></td></tr><tr><td>תאים קומפטנטיים Mach 1</td><td>Invitrogen</td><td>C862003</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה חלבונים אינטראקציות in vivo</em

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

חלבונים אינטראקציות הם סימן ההיכר של כל תהליכים תאיים חיוניים. עם זאת, רבים של אינטראקציות אלה חולף, או חלש אנרגטית, מניעת הזיהוי שלהם באמצעות ניתוח בשיטות ביוכימיות מסורתיים כגון immunoprecipitation שיתוף. בהקשר זה, את החלבונים פלורסנט encodable גנטית (GFP, RFP, וכו &#39;) שלהם קשורה חופפים ספקטרום הקרינה חוללו מהפכה ביכולת שלנו לפקח על אינטראקציות חלשות in vivo באמצעות תהודה פורסטר העברת אנרגיה (סריג) 1-3. כאן, אנו בפירוט השימוש שלנו assay סריג מבוסס הקרבה לניטור קולטן קולטן אינטראקציות על פני תא האנדותל.

פרוטוקול זה מתאר כיצד חלבונים תמונה אינטראקציות באמצעות assay סריג מבוססי הקרבה.

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo</em

אינטראקציות בין חלבונים הן סימן היכר של כל התהליכים התאיים החיוניים. עם זאת, רבות מאינטראקציות אלו הן חולפות, או חלשות מבחינה אנרגטית, ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להעריך את נוכחותן של אינטראקציות בין חלבונים על פני השטח של התא. דבר זה מושג על ידי שיבוט של שני רספטורים רלוונטיים, כאשר כל אחד מהם מקושר לקצה של שני פלואורופורים בעלי ספקטרומי פליטה חופפים כשלב שני. שני הווקטורים מוחדרים בו-זמנית (transfected) לתאי אנדותל לצורך ביטוי של הרספטורים.בשלב זה, הפלואורופורים מסייעים בהערכת היקף הביטוי הכולל וכן במיקום הרצפטור. לאחר מכן, נקבעים פרמטרי הדמיות באמצעות תעתוק בודד כביקורת במיקרוסקופ קונפוקאלי. תאים שעברו תעתוק נבחרים באופן פרטני על סמך רמות הביטוי היחסיות של הרצפטור ומיקומו.לאחר מכן מדמיינים אזורים בתוך תאים אלו כדי להעריך את היקף תוצאות ה-fret המתקבלות. תוצאות אלו מראות אינטראקציות בין tie one ל-tie two על פני התא האנדותליאלי, בהתבסס על fre ומיקרוסקופיה קונפוקאלית. שלום, אני טום סגר מהמעבדה של ד"ר ויליאם בארטון במחלקה לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית באוניברסיטת וירג'יניה COMMONWEALTH.היום נדגים לכם פרוצדורה להערכת אינטראקציות בין חלבונים בתאי אנדותל באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית מבוססת FRET. במעבדה שלנו, אנו משתמשים בשיטה זו כדי לחקור אינטראקציות בין רצפטורים במהלך אנגיוגנזה. אז בואו נתחיל.כדי לדמיין אינטראקציות בין חלבונים באמצעות בדיקת קרבה המבוססת על FRET, התחילו בשיבוט הקולטנים הרלוונטיים לאתרי NHE one eco R one של וקטור pcd, a 3.1 hydro או neo המכיל CFP או YFP מונומרי. קביעת ה-FRET היא אמפירית ותלויה באופן קריטי באורך המקשר (linker) בין האזור החוצה-ממברנלי לתחילת הפלואורופור. לכן, יש לבחון מספר אורכים שונים של מקשר עבור כל זוג קולטנים חדש הנבדק. טרנספורמציה והגברה של הווקטורים יבוצעו בהתאם לפרוטוקול המצורף.לאחר מכן הכין DNA בדרגת טרנספקציה, בצע טרנספורמציה והגבר את הווקטורים בהתאם לפרוטוקול המצורף. לאחר מכן הכין DNA בדרגת טרנספקציה ודללו אותו לריכוז עבודה של 1 µg/µL. כדי להכין את התאים לטרנספקציה תחת מנדף תרביות רקמה, פצל תאי EAHY 92 6 הגדלים ב-DMEM מלא לתוך צלחות של 35 millimeter עם לבישת זכוכית (cover slip) המכילות 2 mL של מצע. הכן צלחת אחת להערכת הביטוי של כל רצפטור בנפרד, וכן צלחת אחת עבור כל זוג רצפטורים.יש להדגיר את התאים באטמוספירה של 95% carbon dioxide בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עד למחרת. התרבית צריכה להגיע לרמה של 70 עד 90% confluence ביום הטרנספקציה. הכינו קומפלקסים של נוקלאו-ליפידים על ידי ערבוב של two micrograms של DNA של וקטור הרצפטור הכימרי עם eight microliters של Fuji N HD ב-200 microliters של optimum שחומם מראש; עבור זוגות רצפטורים, בצעו טרנספקציה עם one microgram מכל רצפטור, לסך הכל two micrograms. ערבבו בעדינות על ידי היפוך והדגיר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.במהלך תקופת האינקובציה, הכין את התאים לטרנספקציה: שאב את המצע הטרי ושטוף כל צלחת בעדינות ובקיצור ב-PBS חמים לפני הוספה של שני מיליליטר של DMEM מלא שחומם מראש וללא אנטיביוטיקה. חשוב למנוע נוכחות של פניצילין וסטריפטומייצין, שכן הם רעילים הרבה יותר לתאים במהלך הטיפול. טפטף את קומפלקס ה-FU gene HD על התאים והדגרה למשך 20 עד 24 שעות נוספות. לאחר 24 שעות, שאב בזהירות את המצע מהתאים והעבר באמצעות פפיטה DMEM מלא וטרי עם אנטיביוטיקה לאחר הטרנספקציה.חיוניות התאים צריכה להישאר גבוהה יחסית. יש לצפות למספר קטן של תאים צפים או לאף תא צף. לביצוע דימיון של תאים חיים, אנו משתמשים במיקרוסקופ קונפוקאלי מסוג A-T-C-S-P two A OBS המצויד בלייזרים של דיודה כחולה, ארגון, וכן לייזרי הליום-ניאון בירוק, כתום ואדום, עדשת H-C-X-P-I-A-O 63 x 1.3 NA בטבילת גליצרין, במה XY ממוטורית ואינקובטור לבמה עם בקרה על טמפרטורה, לחות ופחמן דו-חמצני.בקרות ניסיוניות הן חיוניות כדי למנוע crosstalk של פלואורסצנציה בין ערוצי הפליטה, וכן כדי להעריך בעיות ביטוי וסממן פלואורסצנציה לא ספציפי. לפיכך, נעשה שימוש בטרנספקציות של פלואורופור בודד לצורך כיול של כל סשן דימוי, כדי למנוע crosstalk בין ערוצי הפליטה של CFP ו-YFP. מקם את בקרת הביטוי של CFP בתוך אינקובטור הבמה באמצעות אור לבן.כוון את לוח ה-Z כדי להתמקד בתאים. הגדר את הגדרות חלון ה-SP לגילוי פליטה של CFP ל-465 עד 505 ננומטר ושל YFP ל-525 עד 600 ננומטר, ובזמן ניטור של שני ערוצי הפליטה, עורר את ה-CFP ב-458 ננומטר. באמצעות ה-A OTF, הגדר את הספק הלייזר כדי לבטל bleed over משמעותי של CFP אל תוך ערוץ הפליטה של YFP.שמרו הגדרה זו. בצעו את אותה בקרת crosstalk של YFP בערוץ ה-CFP על ידי כיוונון הספק העירור ב-514 nanometers. שמרו הגדרה זו עבור התאים המבטאים YFP בלבד.בשלב הבא, העבירו את התאים המבטאים CFP ו-YFP אל תוך אינקובטור הבמה. באמצעות הגדרות הרצף של תוכנת ה-LICO confocal, אתרו תאים המבטאים רמות דומות של CFP ו-YFP עם לוקליזציה תקינה לממברנה באמצעות תוכנת ה-LICO, למעט תוכנית ה-photo bleaching המקובלת בתוכנה.הגדירו את הגדרות התורם והמקבל להגדרות ה-CFP וה-YFP השמורות שלכם, בהתאמה. הגדילו את התצוגה אל התא, סמנו אזור עניין (Region of interest או ROI) שבו יתרחש ההרס הפוטואופטי של ה-YFP על ממברנת התא, והפעילו את התוכנית להרס הפוטואופטי של המקבל. כווןנו את ה-AOTF ל-100% של 514 nanometers והמתינו עד לסיום הלבנת הלייזר, עד ש-70% מפליטת ה-YFP תדלדל.כדי להאיץ את ההלבנה, נבחרים בדרך כלל ROI-ים בציר הסריקה (raster axis) של הלייזר במהלך הפוטו-הלבנה. יש לנטר את התנועה התאית ולפסול מדידות שהתקבלו כאשר הייתה תנועה ניכרת במישור XY. מכיוון שמדידות אלו עלולות להעיד על יעילות FRET שגויה, תמונות לפני ואחרי ההלבנה מוקלטות הן עבור התורם והן עבור המקבל, ויעילות ה-FRET מחושבת כפי שמוגדר: יעילות FRET שווה לסוגריים פתוחים post פחות DLO סוגריים סגורים חלקי depost עבור כל depost הגדול מ-D pre, כאשר D, pre ו-D post הם עוצמות התורם לפני ואחרי הפוטו-הלבנה, בהתאמה.משתמשים ב-JMP כדי לקבוע את מידת השונות הניסויית. יש להבקיע רצפטורים בודדים הן ל-CFP והן ל-YFP עם אורכים משתנים של רצף juxta membrane. כדי לזהות את הזוג המיטבי ביותר של שותפי FRET לרצפטור, יעילויות הטרנספקציה הן בדרך כלל בין 30 ל-40%, למרות ממצאים קודמים של חוקרים אחרים.לא ראינו שטרנספקציה ואקספרסיה של וקטור אחד מעדיפות את אלו של השני. למעשה, אנו מבחינים לעיתים קרובות באקספרסיה בלעדית של פלואור אחד או השני. תמונות מייצגות אלו מראות ניתוח acceptor photobleaching של FRET המתרחש בין CFP ל-YFP בתא EAHY 9 26.ערוצי הפליטה של CFP ו-YFP נוטרו בנפרד לפני ואחרי פוטו-ביליץ' (photobleaching), והחישובים הוגבלו לאזור זה. בתוך המלבן האדום מוצגת יעילות ה-FRET כטווח מוחלט, מגבוה (מסומן באדום) ב-1.0 לנמוך (מסומן בסגול) באפס, על גבי תמונה מוגדלת וממוזגת של CFP ו-YFP לצורכי התמצאות בלבד עבור מערכת T receptor. ערכי יעילות FRET טיפוסיים הם 20% עד 28% עבור תאי אפיתל ו-19% עד 23% עבור תאי אנדותל, כפי שמוצג כאן.לאחר השליטה בטכניקה, ביצוע נכון של הפרוצדורה יארך בדרך כלל שלושה עד ארבעה ימים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי אורך המקשר (linker) בין החלבון המטרה לחלבון הפלואורסצנטי המחובר, כמו גם רמות הביטוי שלהם ותנועתם התאית, משפיעים ישירות על מדידת ה-fret לאחר ביצוע הפרוצדורה. יתרה מכך, ניתן לבצע בדיקות ביוכימיות בנוגע להפעלת אותות כדי להשיג תובנות על מסלולי העברת אותות לאחר פיתוחו.טכניקה זו מספקת בדיקה שבה ניתן לחקור אינטראקציות בין חלבונים שהן חלשות או חולפות. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ביצוע בדיקות קרבה מבוססות FRET בתאים חיים. וזכרו כי בעת עבודה עם תאים בתרבית רקמה, יש להקפיד תמיד על אמצעי בטיחות מתאימים.תודה שצפיתם בה, ובהצלחה בניסויי ה-fret העתידיים שלכם.

imaging-protein-protein-interactions-in-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מראה ניסויים עם ניתוח בדיעבד של חלבונים אינטראקציות על ידי שימוש במיקרו בדוגמת משטחים. הגישה מציעה את האפשרות לזהות אינטראקציות חלבון בתאים חיים, והוא משלב יכולות התפוקה גבוהה עם אפשרות לחלץ מידע כמותי.

In-vivo גילוי של חלבונים אינטראקציות על מיקרו-בדוגמת משטחים

על ידי שימוש לפתור spectrally שני הפוטונים מערכת הדמיה מיקרוסקופית, פיקסל ברמה מפות של העברת אנרגיה תהודה פורסטר (סריג) יעילות מתקבלים עבור תאים להביע את קולטני קרום השערה כדי ליצור הומו-oligomeric קומפלקסים. מן סריג מפות יעילות, אנו מסוגלים להעריך מידע stoichiometric על המתחם oligomer תחת מחקר.

ב כימות vivo של G מצמידים חלבון קולטן אינטראקציות באמצעות נפתר Spectrally שני פוטון מיקרוסקופית

חלבונים אינטראקציה בדיקה הכרחית לנתיחה של פונקציונליות חלבון. הנה, אנחנו...

חלבון ממברנה Assay Overlay: פרוטוקול בדיקת אינטראקציה בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים במבחנה</em

היווצרות של קומפלקסי חלבוני in vivo ניתן דמיינו ידי שלמת הקרינה bimolecular. שותפי אינטראקציה הם התמזגו לחלקי משלימים של תגי ניאון והביעו transiently בי טבק, וכתוצאה מכך אות ניאון מחדש על סמיכות של שני חלבונים.

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

אינטראקציות חלבון-חלבון יכולות להתרחש הן בגרעין והן בציטופלזמה של התא. כדי לחקור אינטראקציות אלה, מיושמים קו-אימונו-משקעים מסורתיים ובדיקת קשירת קרבה מודרנית. במחקר זה, אנו משווים את שתי השיטות הללו כדי לדמיין את התפלגות האינטראקציות של NF90-RBM3 בגרעין ובציטופלזמה.

ויזואליזציה של אינטראקציה בין חלבונים ב גרעיני cytoplasmic שברים על ידי Co-immunoprecipitation ו<em&gt; באתרו</em&gt; Assay קשירת הסמיכות

כתב יד זה מתאר תהליך ניסוי קלה ומהירה לקביעת אינטראקציות חלבון-חלבון מבוסס על מדידת פעילות לוציפראז.

לוציפראז קומפלמנטציה הדמיה Assay העלים טבק benthamiana עבור Transiently קביעת חלבון אינטראקציה דינמיקה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור טכניקת העיכול על הקרום להכנת דגימות עבור ספקטרומטר מסה. טכניקה זו מקלה על ניתוח נוח של אינטראקציות חלבון-חלבון.

הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה

כמותית מולטיפלקס Immunoprecipitation (QMI) משתמשת cy, לנסות לגילוי רגיש של הבדלים בשפע של אינטראקציות חלבונים בחלבון ממוקדות בין שתי דגימות. QMI ניתן לבצע באמצעות כמות קטנה של ביומטריה, אינו דורש תגים מהונדסים גנטית, והוא יכול להיות מותאם עבור כל רשת בעבר הגדרת חלבון אינטראקציה.

קוונפיקציה של אינטראקציה חלבון ברשת דינמיקה באמצעות ריבוב ושות-Immunoprecipitation

הצורך בגישות חדשות לחקר אתרי מגע עם ממברנות (MCS) גדל עקב העניין הגובר בחקר מבנים תאיים אלה ומרכיביהם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלב טכנולוגיות מיקרוסקופיה שהיו זמינות בעבר כדי לזהות ולכמת קומפלקסים של חלבונים תוך-אברונים ובין אברונים השוכנים ב-MCS.

ויזואליזציה וכימות של אינטראקציות חלבון תוך-אברוני אנדוגניות באתרי קשר של ER-מיטוכונדריה על ידי מבחני קשירת קרבה

הפרוטוקול מציג שיטה להצמדה קוולנטית in vivo של ביוטין לחלבונים על סמך קרבתם לביוטין ליגאז המותך לחלבון מעניין. שינוי זה מאפשר העשרה סלקטיבית של החלבונים באמצעות חרוזי סטרפטווידין לפי הצורך במחקרי אינטראקציה עם חלבונים.

ב Vivo ביוטינילציה של קרבה למחקרי אינטראקציה בין חלבונים ב-Paramecium tetraurelia

למד הדמיית אינטראקציות חלבון-חלבון בתאי אנדותל בשיטת FRET מבוססת מיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו מאפשרת חקר אינטראקציות קולטנים במהלך אנגיוגנזה בזמן אמת.

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo

גלה סרטונים נוספים