הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להעריך את נוכחותן של אינטראקציות בין חלבונים על פני השטח של התא. דבר זה מושג על ידי שיבוט של שני רספטורים רלוונטיים, כאשר כל אחד מהם מקושר לקצה של שני פלואורופורים בעלי ספקטרומי פליטה חופפים כשלב שני. שני הווקטורים מוחדרים בו-זמנית (transfected) לתאי אנדותל לצורך ביטוי של הרספטורים.

בשלב זה, הפלואורופורים מסייעים בהערכת היקף הביטוי הכולל וכן במיקום הרצפטור. לאחר מכן, נקבעים פרמטרי הדמיות באמצעות תעתוק בודד כביקורת במיקרוסקופ קונפוקאלי. תאים שעברו תעתוק נבחרים באופן פרטני על סמך רמות הביטוי היחסיות של הרצפטור ומיקומו.

לאחר מכן מדמיינים אזורים בתוך תאים אלו כדי להעריך את היקף תוצאות ה-fret המתקבלות. תוצאות אלו מראות אינטראקציות בין tie one ל-tie two על פני התא האנדותליאלי, בהתבסס על fre ומיקרוסקופיה קונפוקאלית. שלום, אני טום סגר מהמעבדה של ד"ר ויליאם בארטון במחלקה לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית באוניברסיטת וירג'יניה COMMONWEALTH.

היום נדגים לכם פרוצדורה להערכת אינטראקציות בין חלבונים בתאי אנדותל באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית מבוססת FRET. במעבדה שלנו, אנו משתמשים בשיטה זו כדי לחקור אינטראקציות בין רצפטורים במהלך אנגיוגנזה. אז בואו נתחיל.

כדי לדמיין אינטראקציות בין חלבונים באמצעות בדיקת קרבה המבוססת על FRET, התחילו בשיבוט הקולטנים הרלוונטיים לאתרי NHE one eco R one של וקטור pcd, a 3.1 hydro או neo המכיל CFP או YFP מונומרי. קביעת ה-FRET היא אמפירית ותלויה באופן קריטי באורך המקשר (linker) בין האזור החוצה-ממברנלי לתחילת הפלואורופור. לכן, יש לבחון מספר אורכים שונים של מקשר עבור כל זוג קולטנים חדש הנבדק. טרנספורמציה והגברה של הווקטורים יבוצעו בהתאם לפרוטוקול המצורף.

לאחר מכן הכין DNA בדרגת טרנספקציה, בצע טרנספורמציה והגבר את הווקטורים בהתאם לפרוטוקול המצורף. לאחר מכן הכין DNA בדרגת טרנספקציה ודללו אותו לריכוז עבודה של 1 µg/µL. כדי להכין את התאים לטרנספקציה תחת מנדף תרביות רקמה, פצל תאי EAHY 92 6 הגדלים ב-DMEM מלא לתוך צלחות של 35 millimeter עם לבישת זכוכית (cover slip) המכילות 2 mL של מצע. הכן צלחת אחת להערכת הביטוי של כל רצפטור בנפרד, וכן צלחת אחת עבור כל זוג רצפטורים.

יש להדגיר את התאים באטמוספירה של 95% carbon dioxide בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עד למחרת. התרבית צריכה להגיע לרמה של 70 עד 90% confluence ביום הטרנספקציה. הכינו קומפלקסים של נוקלאו-ליפידים על ידי ערבוב של two micrograms של DNA של וקטור הרצפטור הכימרי עם eight microliters של Fuji N HD ב-200 microliters של optimum שחומם מראש; עבור זוגות רצפטורים, בצעו טרנספקציה עם one microgram מכל רצפטור, לסך הכל two micrograms. ערבבו בעדינות על ידי היפוך והדגיר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

במהלך תקופת האינקובציה, הכין את התאים לטרנספקציה: שאב את המצע הטרי ושטוף כל צלחת בעדינות ובקיצור ב-PBS חמים לפני הוספה של שני מיליליטר של DMEM מלא שחומם מראש וללא אנטיביוטיקה. חשוב למנוע נוכחות של פניצילין וסטריפטומייצין, שכן הם רעילים הרבה יותר לתאים במהלך הטיפול. טפטף את קומפלקס ה-FU gene HD על התאים והדגרה למשך 20 עד 24 שעות נוספות. לאחר 24 שעות, שאב בזהירות את המצע מהתאים והעבר באמצעות פפיטה DMEM מלא וטרי עם אנטיביוטיקה לאחר הטרנספקציה.

חיוניות התאים צריכה להישאר גבוהה יחסית. יש לצפות למספר קטן של תאים צפים או לאף תא צף. לביצוע דימיון של תאים חיים, אנו משתמשים במיקרוסקופ קונפוקאלי מסוג A-T-C-S-P two A OBS המצויד בלייזרים של דיודה כחולה, ארגון, וכן לייזרי הליום-ניאון בירוק, כתום ואדום, עדשת H-C-X-P-I-A-O 63 x 1.3 NA בטבילת גליצרין, במה XY ממוטורית ואינקובטור לבמה עם בקרה על טמפרטורה, לחות ופחמן דו-חמצני.

בקרות ניסיוניות הן חיוניות כדי למנוע crosstalk של פלואורסצנציה בין ערוצי הפליטה, וכן כדי להעריך בעיות ביטוי וסממן פלואורסצנציה לא ספציפי. לפיכך, נעשה שימוש בטרנספקציות של פלואורופור בודד לצורך כיול של כל סשן דימוי, כדי למנוע crosstalk בין ערוצי הפליטה של CFP ו-YFP. מקם את בקרת הביטוי של CFP בתוך אינקובטור הבמה באמצעות אור לבן.

כוון את לוח ה-Z כדי להתמקד בתאים. הגדר את הגדרות חלון ה-SP לגילוי פליטה של CFP ל-465 עד 505 ננומטר ושל YFP ל-525 עד 600 ננומטר, ובזמן ניטור של שני ערוצי הפליטה, עורר את ה-CFP ב-458 ננומטר. באמצעות ה-A OTF, הגדר את הספק הלייזר כדי לבטל bleed over משמעותי של CFP אל תוך ערוץ הפליטה של YFP.

שמרו הגדרה זו. בצעו את אותה בקרת crosstalk של YFP בערוץ ה-CFP על ידי כיוונון הספק העירור ב-514 nanometers. שמרו הגדרה זו עבור התאים המבטאים YFP בלבד.

בשלב הבא, העבירו את התאים המבטאים CFP ו-YFP אל תוך אינקובטור הבמה. באמצעות הגדרות הרצף של תוכנת ה-LICO confocal, אתרו תאים המבטאים רמות דומות של CFP ו-YFP עם לוקליזציה תקינה לממברנה באמצעות תוכנת ה-LICO, למעט תוכנית ה-photo bleaching המקובלת בתוכנה.

הגדירו את הגדרות התורם והמקבל להגדרות ה-CFP וה-YFP השמורות שלכם, בהתאמה. הגדילו את התצוגה אל התא, סמנו אזור עניין (Region of interest או ROI) שבו יתרחש ההרס הפוטואופטי של ה-YFP על ממברנת התא, והפעילו את התוכנית להרס הפוטואופטי של המקבל. כווןנו את ה-AOTF ל-100% של 514 nanometers והמתינו עד לסיום הלבנת הלייזר, עד ש-70% מפליטת ה-YFP תדלדל.

כדי להאיץ את ההלבנה, נבחרים בדרך כלל ROI-ים בציר הסריקה (raster axis) של הלייזר במהלך הפוטו-הלבנה. יש לנטר את התנועה התאית ולפסול מדידות שהתקבלו כאשר הייתה תנועה ניכרת במישור XY. מכיוון שמדידות אלו עלולות להעיד על יעילות FRET שגויה, תמונות לפני ואחרי ההלבנה מוקלטות הן עבור התורם והן עבור המקבל, ויעילות ה-FRET מחושבת כפי שמוגדר: יעילות FRET שווה לסוגריים פתוחים post פחות DLO סוגריים סגורים חלקי depost עבור כל depost הגדול מ-D pre, כאשר D, pre ו-D post הם עוצמות התורם לפני ואחרי הפוטו-הלבנה, בהתאמה.

משתמשים ב-JMP כדי לקבוע את מידת השונות הניסויית. יש להבקיע רצפטורים בודדים הן ל-CFP והן ל-YFP עם אורכים משתנים של רצף juxta membrane. כדי לזהות את הזוג המיטבי ביותר של שותפי FRET לרצפטור, יעילויות הטרנספקציה הן בדרך כלל בין 30 ל-40%, למרות ממצאים קודמים של חוקרים אחרים.

לא ראינו שטרנספקציה ואקספרסיה של וקטור אחד מעדיפות את אלו של השני. למעשה, אנו מבחינים לעיתים קרובות באקספרסיה בלעדית של פלואור אחד או השני. תמונות מייצגות אלו מראות ניתוח acceptor photobleaching של FRET המתרחש בין CFP ל-YFP בתא EAHY 9 26.

ערוצי הפליטה של CFP ו-YFP נוטרו בנפרד לפני ואחרי פוטו-ביליץ' (photobleaching), והחישובים הוגבלו לאזור זה. בתוך המלבן האדום מוצגת יעילות ה-FRET כטווח מוחלט, מגבוה (מסומן באדום) ב-1.0 לנמוך (מסומן בסגול) באפס, על גבי תמונה מוגדלת וממוזגת של CFP ו-YFP לצורכי התמצאות בלבד עבור מערכת T receptor. ערכי יעילות FRET טיפוסיים הם 20% עד 28% עבור תאי אפיתל ו-19% עד 23% עבור תאי אנדותל, כפי שמוצג כאן.

לאחר השליטה בטכניקה, ביצוע נכון של הפרוצדורה יארך בדרך כלל שלושה עד ארבעה ימים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי אורך המקשר (linker) בין החלבון המטרה לחלבון הפלואורסצנטי המחובר, כמו גם רמות הביטוי שלהם ותנועתם התאית, משפיעים ישירות על מדידת ה-fret לאחר ביצוע הפרוצדורה. יתרה מכך, ניתן לבצע בדיקות ביוכימיות בנוגע להפעלת אותות כדי להשיג תובנות על מסלולי העברת אותות לאחר פיתוחו.

טכניקה זו מספקת בדיקה שבה ניתן לחקור אינטראקציות בין חלבונים שהן חלשות או חולפות. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ביצוע בדיקות קרבה מבוססות FRET בתאים חיים. וזכרו כי בעת עבודה עם תאים בתרבית רקמה, יש להקפיד תמיד על אמצעי בטיחות מתאימים.

תודה שצפיתם בה, ובהצלחה בניסויי ה-fret העתידיים שלכם.