ויזואליזציה של מערכת העצבים כולה עובריים-Mount תסיסנית עוברים

המטרה הכללית של הליך זה היא להכין עוברים של oph ו-melanogaster לצורך הדמיה של מערכת העצבים בשיטת whole mount. הדבר מושג תחילה על ידי איסוף עוברים מזן הזבוב הרלוונטי. השלב השני של ההליך הוא הסרת הקוריון באמצעות תמיסת הבלכנה.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא יישום של heptane ו-methanol להסרת ממברנת ה-vilin. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא יישום נוגדנים על העוברים. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את מבנה מערכת העצבים של עובר ה-drosophila באמצעות מיקרוסקופיית immunofluorescence.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון התפקיד שמוטציות עשויות למלא במערכת העצבים המתפתחת. באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו עלולים להיתקל בקשיים, שכן הם עלולים להוציא בטעות עוברים מהמבחנה. התחילו את הפרוטוקול בהכנת הריאגנטים הדרושים, כולל P-E-M-F-A, תמיסת באפר PBC 5%BSA עם 0.01%sodium azide ותמיסת קיבוע של formaldehyde.

הכינו כלוב עבור זן ה-drosophila הרלוונטי על ידי הרדמת הזבובים באמצעות פחמן דו-חמצני, ולאחר מכן העבירו לפחות 100 זבובים לבקבוק פלסטיק המכיל מתאם עם פלטת הזנה של אגר במיץ תפוחים. הניחו את כלוב הזבובים בחושך בטמפרטורת החדר למשך 72 שעות. החליפו את פלטות ההזנה של אגר במיץ תפוחים בכל שמונה עד 12 שעות כדי שהזבובים יתרגלו לכלוב ולא יעכבו את הטלת הביצים לצורך הניסוי.

לאחר תקופת אקלימציה של 72 שעות, אספו את העובריים 12 שעות לאחר ההחלפה האחרונה של פלטת ההזנה עם אגר מיץ תפוחים. הוציאו את פלטת ההזנה עם אגר מיץ התפוחים מכלוב ההטלה והחליפו אותה בתמיסת סליין. שטפו את פלטת ההזנה עם אגר מיץ התפוחים.

אספו את העוברים באמצעות נפה עדינה. השתמשו במברשת צבע נקייה כדי לשחרר עוברים שנותרו דבוקים לפיתח. שטפו את העוברים בנפה בתמיסת סליין כדי להסיר שאריות שמרים. בעזרת שפכטל, אספו בעדינות את העוברים והעבירו אותם לבקבוק זכוכית קטן.

הוסיפו כמיליליטר אחד של תמיסת סליין. לאחר מכן, סגרו את הבקבוק והדגרו למשך חמש דקות לשטיפת העוברים. לאחר איסוף העוברים.

הכינו את תמיסת הקיבוע בהפטן על ידי ערבוב של 50% heptane ו-50% fixative. התמיסה תהיה בשכבות, כאשר ה-heptane למעלה וה-fixative למטה. לאחר חלוף חמש דקות, השתמשו בפיפטת פסטה כדי להסיר את תמיס הפיסל (saline) העודף מבקת המבחנה של העוברים.

שטפו אתו העוברים במים דה-יוניים על ידי הוספת כ-1 mL של מים דה-יוניים לבקבוק הזכוכית המכיל את העוברים. המתינו דקה אחת לפני שאיבת המים והחלפתם בתמיסת הלבנה בריכוז 50%. נערו את הבקבוק מספר פעמים ביד ולאחר מכן דגרו במשך שלוש דקות כדי לצפות את העוברים.

העובריים שאינם חיים ישקעו לתחתית המבחנה. שאריות של COR עובריים יצופו. יש להסיר את התמיסת הלבן ואת ה-CORs לאחר דקת ד contrairement של דקות של דגירה.

לאחר הקישוט, שטפו היטב את העוברים במים דה-יוניים על ידי הוספת כ-1 mL של מים דה-יוניים למבחנת הזכוכית המכילה את העוברים. המתינו דקה אחת לפני הסרת המים; שאריות של CORs יצופו ויש להסירן. הוסיפו את תמיסת הקיבוע של ההפטן לעוברים והדגירו אותם למשך 30 דקות עם ניעור עדין לצורך קיבוע. לאחר הקיבוע,

השתמשו בפיפטת פסטה כדי להסיר את חומר הקיבוע, המהווה את השכבה התחתונה, והשאירו את ההפטן בתוך המבנה. לאחר מכן, הוסיפו מנול רסולוטיבי לתחתית המבנה במקום חומר הקיבוע, סגרו את המבנה ונקנעו אותו בעוצמה ביד כדי להסיר את קרומי הוויטלין. לאחר שלב זה, העוברים שיש להם מעטפת ישקעו לתחתית המבנה.

בעזרת פסטור-פיפט, הסירו את המטנול והנוזלים מהמבחנה והשאירו מאחור את העוברים ששוטפו במים דא-יוניים. לאחר מכן, שטפו את העוברים חמש פעמים במטנול, והסירו את המטנול באמצעות פסטור-פיפט בין שטיפה לשטיפה. בכל שטיפה, דגרו את העוברים למשך חמש דקות.

הניחו את העוברי בתערובת של 50%PBT solution ו-50%methanol למשך חמש דקות כדי להחזיר להם את הלחות. לאחר מכן, המשיכו בתהליך ההשקיה על ידי העברתם ל-100%PBT solution למשך חמש דקות. לאחר מכן, בצעו חסימה (blocking) לעוברים על ידי דגירה שלם ב-5%BSA עם 0.01%sodium azide solution למשך שעה אחת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

בשלב הבא, הכין את הנוגדן הראשוני לצביעת העוברים על ידי דילולו לריכוז המתאים באמצעות תמיסת 5%BSA עם 0.01%Sodium azide. הנוגדים המשמשים כאן מכוונים נגד ה-vesicular cysteine string protein ונוגדן anti HRP. Anti HRP מזהה רכיב פחמימתי ספציפי למערכת העצבים הנמצא בחלבוני גליקו-שטח, אשר מסמן את כל הנוירונים.

דגרו את העוברים למשך לילה בטמפרטורה של four degrees Celsius בתמיסת הנוגדן הראשוני. שטפו את העוברים 10 פעמים עם PBT לאורך שעה. לאחר הוספת כ-one milliliter של PBT למבחנה הזכוכית המכילה את העוברים, המתינו שש דקות לפני הסרת ה-PBT.

חזור על תהליך יישום ה-PBT, האינקובציה והסרת ה-PBT 10 פעמים. הכן את תמיסת הנוגדן המשני בחושך כיוון שהוא רגיש לאור, על ידי דילול לריכוז המתאים. אנו משתמשים בנוגדי Alexa משניים בריכוז של 1:200.

דגרו את העוברים למשך שעתיים בטמפרטורה של 4 °C בתוך תמיסת הנוגדן המשני. עטפו את מבחנה הזכוכית המכילה את העוברים ואת תמיסת הנוגדן המשני בנייר אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור. שטפו את העוברים 10 פעמים עם PBT לאורך שעה.

הוסיפו למטריות (embryos) תסקילי הרכבה מסוג vector shield והדגירו אותן ללילה במטמפטורה של ארבעה מעלות צלזיוס (°C) לצורך ההרכבה. השתמשו בפיפטה פסטל כדי לשאוב את העובריים יחד עם כמות מסוימת של תסקילי ההרכבה. העבירו את העובריים ואת התסקיליים למסכיך זכוכית.

הנח זכוכית כיסוי מעל העובריים ואטום אותה באמצעות לק ציפורניים. הדמ את העובריים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה. מערכת העצבים המרכזית (CNS) העוברית מוצגת בשלבים 16 עד 17.

חלבון Cystine string מוצג באדום. נוירוני HRP מוצגים בירוק. שימו לב לצביעה המובחנת של הקומיסורה בתמונה נציגה זו.

מערכת העצבים הפריפרית (PNS) העוברית מוצגת בשלבים 16 עד 17. שוב, חלבון cystine string מוצג באדום, ונוירונים מוצגים בירוק. שימו לב לתבניות החוזרות של הנוירונים הפריפריים.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להישמר בטיפול בעוברים כדי למנוע את הוצאתם בטעות מהבקבוקון. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכיבו הבנה טובה לגבי אופן הכנת עוברי oph fla לצורך ויזואליזציה של מערכת העצבים בשיטת whole mount.