Name: ויזואליזציה של מערכת העצבים כולה עובריים-Mount תסיסנית עוברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: למד הכנת עוברי Drosophila לויזואליזציה של מערכת העצבים בשלמות באמצעות צביעת נוגדנים ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת חקר מבנה נוירונים ותפקוד גנים בהתפתחות העצבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

SG נתמכת על ידי קרנות מאוניברסיטת המדינה של ניו יורק ב באפלו ומ ג&#39;ון ר Oishei קרן.

1. הכנה של ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הצפת PEMFA באמצעות צינורות 100mm, 2mm EGTA, ו 1 mM MgSO 4. התאם את ה-pH של המאגר כדי 7.0. המאגר PEMFA מעוקר לסנן מאוחסנים 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן PBT ידי הוספת 1ml של טריטון X-100 ל 100 מ"ל 1x PBS (בופר פוספט) (pH 7.0). חנות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן BSA 5% (שור אלבומין) עם NaAcide 0.01% ב 1x PBS (pH 7.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תמיסת מלח באמצעות 0.7% NaCl ו - 0.03% Triton X-100 במים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מקבע על ידי שילוב של 4 חלקים חיץ PEMFA עם פורמלדהיד 1 חלק 37%. </li></ol> 2. אוסף של עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו כלוב עבור המתח תסיסנית הריבית על ידי הצבת&gt; 100 זבובים בבקבוק פלסטיק המכיל מתאם עם צלחת האכלה אגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו את הכלוב של זבובים בחושך בטמפרטורת החדר למשך 72 שעות, שינוי לוחות כל 8-12 שעות, כך זבובים יתרגלו הכלוב לא מחזיקים את ביציהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך הניסוי לאסוף עוברי למשך 12 שעות. הסר את צלחת פטרי מן המיכל ולהחליף אותו. קח את צלחת פטרי להסיר ולשטוף את העוברים מעל המנה בעזרת תמיסת מלח ומברשת צבע נקיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף עוברים מסננת דקה. לשטוף עם מי מלח כדי להסיר כל עודף שמרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מרית בעדינות להרים את העוברים ולמקם אותם בתוך בקבוק זכוכית קטן עם כובע. הוסף על 1ml של תמיסת מלח. </li></ol> 3. הסרת ממברנות סיסית ו Vitelline ו קיבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות האוסף של עוברים, להכין את הפתרון heptane-Fix על ידי שילוב של 50% ו heptane מקבע 50%. הפתרון יהיה שכבתית עם heptane על גבי ואת מקבע על התחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל בקבוקון הזכוכית לשטוף את העוברים על ידי דוגרים להם בפתרון מלח במשך 5 דקות. הסר מלוחים עודף באמצעות פיפטה פסטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את העוברים עם מים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dechorionate את העוברים על ידי דוגרים עליהם אקונומיקה 50% במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את העוברים ביסודיות במים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את העוברים על ידי דוגרים עליהם במשך 30 דקות בתמיסה heptane-Fix עם רעד עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה פסטר להחליף את (השכבה התחתונה) מקבע עם מתנול עוזב את heptane בצינור. Shake במרץ כדי להסיר את הקרום vitelline. עוברים devitellinized ישקעו לתחתית הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את העוברים בתוך צנצנת זכוכית חדשה באמצעות פיפטה פסטר. שוטפים את העוברים חמש פעמים עם מתנול, בכל פעם לדגור העוברים במשך 5 דקות. </li></ol> 4. מכתים נוגדן, הרכבה, וכן ויזואליזציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננותם העוברים בתערובת של פתרון PBT 50% מתנול 50% במשך 5 דקות. ואז רעננותם בפתרון PBT 100% במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את העוברים על ידי דוגרים אותם BSA 5% עם פתרון NaAcide 0.01% במשך שעה 1 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים מוכנים כעת עבור מכתים נוגדן. הכן את הנוגדן הראשוני על ידי דילול אותו ריכוז המתאימה באמצעות BSA 5% עם פתרון NaAcide 0.01%. אנו משתמשים נוגדן נגד החלבון ציסטאין מחרוזת (CSP), חלבון הסינפטי שלפוחי ו אנטי HRP או סוס peroxidase צנון נוגדנים, אשר מזהה מחצית עצבי ספציפי פחמימות נוכח גליקופרוטאינים על פני השטח כל התוויות נוירונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עוברים לילה בשעה 4 ° C בתמיסה הנוגדן הראשוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשטוף את העוברים 10 פעמים עם PBT במשך שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון נוגדנים משני על ידי דילול הריכוז המתאים. אנו משתמשים נוגדנים אלקסה משני בריכוז של 1:200. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עוברים במשך שעתיים ב 4 ° C בפתרון נוגדנים משני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את העוברים 10 פעמים עם PBT במשך שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עוברים לילה Vectashield הרכבה בינונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר עוברים בשקופית זכוכית לאטום את תלוש לכסות עם לק. דמיינו עוברים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol> 5. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1a.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> CSP <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1b.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> HRP-FITC <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1c.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> שמוזגו איור 1: תמונות נציג מראה את מערכת העצבים המרכזית עובריים בשלב 16-17, באמצעות נוגדנים נגד CSP (אדום) HRP (ירוק). שים לב מכתים נפרדים של השליכה. <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig2a.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> CSP <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig2b.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> HRP-FITC "/&gt; שמוזגו איור 2: תמונות נציג מראה את PNS עובריים בשלב 16-17 באמצעות נוגדנים נגד CSP (אדום) HRP (ירוק). הערה דפוסי חוזרות ונשנות של הנוירונים ההיקפיים.

<ol><li>Bodmer, R., Barbel, S., Sheperd, S., Jack, J. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+sensory+organs+by+mutations+of+the+cut+locus+of+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D. melanogaster.</a> Cell. 51, 293-307 (1987).</li>
<li>Bodmer, R., Carretto, R., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+of+the+peripheral+nervous+system+in+Drosophila+embryos%3A+DNA+replication+patterns+and+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis of the peripheral nervous system in Drosophila embryos: DNA replication patterns and cell lineages.</a> Neuron. 3, 21-32 (1989).</li>
<li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+JA+%22The+Embryonic+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Embryonic Development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer-Verlag. New York. (1985).</li>
<li>Carroll, S. B., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+fushi+tarazu+protein+during+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of the fushi tarazu protein during Drosophila embryogenesis.</a> Cell. 43, 47-57 (1985).</li>
<li>Dambly-Chaudière, C., Ghysen, A., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+connections+between+imaginal+discs+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Muscle connections between imaginal discs in Drosophila.</a> Developmental Biology. 113, 288-294 (1986).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

העובר תסיסנית היא מערכת רבת עוצמה על חקירת השינויים תאית ומולקולרית במהלך ההתפתחות העצבית. בפרוטוקול זה יש לנו הדגימו כיצד להכין עוברים הר שלם אימונוהיסטוכימיה. אנחנו צריכים להתאים את פרוטוקול מן הפרוטוקול המתואר קרול סקוט, 1985. פרוטוקול זה גם יכול להיות מותאם כדי לבדוק נוגדנים נוירונים אחרים, אבל אופטימיזציה של נוגדנים צריך להיעשות. יתר על כן, מומים התפתחותיים של PNS ו CNS עובריים ניתן דמיינו בקלות על ידי השוואת עוברים מקווי מוטנטים שונים. השתמשנו בהצלחה בפרוטוקול זה כד...

<table><tbody><tr><td>פורמאלדהיד 37%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-25</td><td></td></tr><tr><td>CSP</td><td>בנק ההיברידומות למחקרים התפתחותיים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HRP-FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>323-095-021</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>תוסף הרכבה Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

ויזואליזציה של מערכת העצבים כולה עובריים-mount תסיסנית עוברים

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

העובר תסיסנית היא מערכת מודל אטרקטיבי עבור חוקרת את בסיס תאית ומולקולרית של התפתחות עצבית. כאן אנו מתארים את הליך להדמיה של מערכת העצבים העוברית תסיסנית באמצעות נוגדנים חלבונים עצביים. מאז כל המערכות עובריים העצבים ההיקפית העצבים המרכזית מאופיינים גם ברמה של תאים בודדים (Dambly-Chaudière et al, 1986;.. בודמר et al, 1987;. בודמר et al, 1989), כל סטיות למערכות אלו יכולים ניתן לזהות בקלות באמצעות נוגדנים חלבונים עצביים שונים. עוברים לפתח נאספות בזמנים מסוימים על מנת להבטיח כי העוברים נמצאים בשלבי ההתפתחות הנכון להדמיה. לאחר איסוף, שכבות החיצוני של העובר, הקרום סיסית ואת המעטפה vitelline העוטף את העובר, יוסרו לפני קיבעון. עוברים מודגרת אז עם נוגדנים עצב דמיינו באמצעות נוגדנים משני שכותרתו fluorescently. עוברים בשלבים 12-17 הם דמיינו לגשת את מערכת העצבים העוברית. בשלב 12 את הלהקה CNS נבט מתחיל קיצור שלב 15 דפוס סופי של השליכה הושגה. עד שלב 17 CNS החוזים ואת PNS היא מפותחת (קמפוס, אורטגה et al. 1985). לפיכך שינויים בדפוס של PNS ו CNS ניתן להבחין בקלות במהלך השלבים ההתפתחותיים.

אנו מתארים את הליך להכין מבוים<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים להדמיה של מערכת העצבים העוברית במהלך embryogenesis.

ויזואליזציה של מערכת העצבים כולה עובריים-Mount תסיסנית עוברים

העובר של ה-Drosophila הוא מערכת מודל מושכת לחקר הבסיס התאי והמולקולרי של ההתפתחות העצבית. כאן אנו מתארים את ה...

המטרה הכללית של נוהל זה היא להכין עוברים של oph ו-melanogaster להדמיה של מערכת העצבים בשיטת whole mount. דבר זה מושג תחילה על ידי איסוף עוברים מזן הזבוב הרלוונטי. השלב השני של הנוהל הוא הסרת ה-corium באמצעות תמיסת הלבנה.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא יישום של heptane ו-methanol להסרת ממברנת ה-vilin. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא יישום של נוגדנים על העוברים. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את מבנה מערכת העצבים של עובר drosophila באמצעות מיקרוסקופיית immunofluorescence.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום מדעי העצבים, כגון התפקיד שמוטציות עשויות למלא במערכת העצבים המתפתחת. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו עלולים להיתקל בקשיים, שכן הם עלולים להוציא בטעות עוברים מהמבחנה. התחילו את הפרוטוקול בהכנת הרכיבים הדרושים, הכוללים P-E-M-F-A, תמיסת באפר PBC 5%BSA עם 0.01%sodium azide saline וקיבוע של formaldehyde.הכינו כלוב עבור זן ה-drosophila הרלוונטי על ידי הרדמת הזבובים באמצעות פחמן דו-חמצני והעברת לפחות 100 זבובים לבקבוק פלסטיק המכיל מתאם עם מצע הזנה של אגר מיץ תפוחים. הניחו את כלוב הזבובים בחושך בטמפרטורת החדר למשך 72 שעות. החליפו את מצעי ההזנה של אגר מיץ התפוחים מדי שמונה עד 12 שעות כדי שהזבובים יסתגלו לכלוב ולא יעכבו את הטלת הביצים עבור הניסוי.לאחר תקופת אקלמיזציה של

visualization-embryonic-nervous-system-whole-mount-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הזחלים תסיסנית melanogaster לספק מערכת מודל אידיאלי לחקור את המנגנונים של תחבורה axonal בתוך העצבים סגמנטלי הזחל. באמצעות הליך זה, 3 rd הזחלים instar נושאת מוטציות שונות ניתן להשוות את הזחלים סוג בר.

ויזואליזציה של עצבים המגזרי הזחל ב 3 Rd Instar תסיסנית הכנות הזחל

כאן אנו מציגים פרוטוקול הרכבה...

הדמיה של זקופה תסיסנית עוברים

מקור: Jeong, S. הדמיה של דפוס ההקרנה האקסונלי של נוירונים מוטוריים עובריים ב-Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את ההדמיה של הקרנות אקסונליות בעוברים Drosophila. תיוג חיסוני של נוירונים מוטוריים, דיסקציה מדויקת לחשיפת מבנים עצביים ומיקרוסקופ ניגודיות של הפרעות דיפרנציאליות חושפים ביחד ארכיטקטורה עצבית מפורטת, תוך שימת דגש על דפוסי ההקרנה האקסונלית.

הדמיה של דפוסי הקרנה אקסונליים של נוירונים מוטוריים עובריים בדרוזופילה

צביעה חיסונית היא טכניקה יעילה להמחשת סוגי תאים וחלבונים ספציפיים בתוך רקמות. על ידי שימוש בסוניקציה, הפרוטוקול המתואר כאן מקל על הצורך לנתח רקמות Drosophila melanogaster מעוברים וזחלים בשלב מאוחר לפני צביעה חיסונית. אנו מספקים מתודולוגיה יעילה לצביעה חיסונית של זחלי הר שלמים קבועים בפורמלדהיד.

הקל Sonication Immunofluorescence הכתמה של שלב מאוחר עוברי וזחל<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות<em&gt; באתר</em

פרוטוקול זה מפרט שיטה יעילה המשמשת לביצוע הדמיה תא חי בהקשר של מוח זחל בשלמותה. גישות הדמיה תא חי הן לא יסולא בפז לחקר חלוקות תא גזע עצביים סימטריות כמו גם תהליכים עצביים והתפתחותיות אחרים, לחשוף באופן עקבי מנגנונים שהתעלמו בעבר.

הדמיה חיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuroblasts

אנו מתארים פרוטוקול לנתיחה, קיבעון, ו immunostaining של איברי steroidogenic אצל נשי זחלים בוגרים דרוזופילה ללמוד ביוסינתזה הורמון סטרואידים ואת מנגנון הרגולציה שלה. בנוסף לאיברים steroidogenic, אנו לדמיין את העצבוב של איברים steroidogenic כמו גם תאי היעד steroidogenic כגון תאי גזע germline.

הפרוטוקולים המאפשר הדמיה איברים Steroidogenic ואורגנים אינטראקטיבית שלהם עם Immunostaining ב זבוב הפירות<em&gt; תסיסנית</em

עבודה זו מפרטת שיטת אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית כדי לדמיין תחזיות נוירונים מוטוריים של שלב מאוחר 16 תסיסנית עוברי melanogaster . הכנת הפילה של עוברי קבוע מוכתמים נוגדן FasII מספק כלי רב עוצמה לאפיין את הגנים הנדרשים עבור pathoninding האקסון המנוע ואת ההכרה היעד במהלך התפתחות עצבית.

ויזואליזציה של דפוס היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים ב<em&gt; תסיסנית</em

פרוטוקול זה מתאר את הקרע של immunostaining של המבוגרים דרוזופילה melanogaster רקמות המוח. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מדגיש את השימוש נוירונים הגוף, קולט אור פטריות דרוזופילה בתור דוגמה עצביים קבוצות משנה יכול לשמש באופן מדויק לחשוף את עקרונות כלליים שבבסיס היבטים רבים של ההתפתחות העצבית.

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

אנו מתארים שיטה עבור מעקב נסיגה של הנוירונים המנוע העובריים מוטוריים באמצעות צבעי פלורסנט ליפופילית.

מעקב רטרוגרדי של דרוזופילה ממונע נוירונים מוטוריים שימוש בצבעי פלורסנט

פרוטוקול זה מתאר שלושה שלבים להכנת אונות אופטיות דרוזופילה בוגרות של זחלים ובוגרים להדמיה: 1) דיסקציות מוחיות, 2) אימונוהיסטוכימיה ו-3) הרכבה. דגש מושם על שלב 3, שכן נדרשים כיווני הרכבה ברורים כדי לדמיין מבנים ספציפיים של האונה האופטית.

דיסקציה, אימונוהיסטוכימיה והרכבה של מוחות זחלים ודרוזופילה בוגרים להדמיית האונה האופטית

כאן, אנו מספקים פרוטוקול דיסקציה הנדרש כדי לצלם בשידור חי את הגונד הזכר העוברי המנוח של דרוזופילה . פרוטוקול זה יאפשר תצפית על תהליכים תאיים דינמיים בתנאים רגילים או לאחר מניפולציה מהונדסת או פרמקולוגית.

דיסקציה והדמיה חיה של דרוזופילה גונד העוברית המאוחרת

למד הכנת עוברי Drosophila לויזואליזציה של מערכת העצבים בשלמות באמצעות צביעת נוגדנים ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת חקר מבנה נוירונים ותפקוד גנים בהתפתחות העצבית.

ויזואליזציה של מערכת העצבים כולה עובריים-Mount תסיסנית עוברים

גלה סרטונים נוספים