ויזואליזציה של מערכת העצבים כולה עובריים-Mount תסיסנית עוברים

המטרה הכללית של נוהל זה היא להכין עוברים של oph ו-melanogaster להדמיה של מערכת העצבים בשיטת whole mount. דבר זה מושג תחילה על ידי איסוף עוברים מזן הזבוב הרלוונטי. השלב השני של הנוהל הוא הסרת ה-corium באמצעות תמיסת הלבנה.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא יישום של heptane ו-methanol להסרת ממברנת ה-vilin. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא יישום של נוגדנים על העוברים. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את מבנה מערכת העצבים של עובר drosophila באמצעות מיקרוסקופיית immunofluorescence.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום מדעי העצבים, כגון התפקיד שמוטציות עשויות למלא במערכת העצבים המתפתחת. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו עלולים להיתקל בקשיים, שכן הם עלולים להוציא בטעות עוברים מהמבחנה. התחילו את הפרוטוקול בהכנת הרכיבים הדרושים, הכוללים P-E-M-F-A, תמיסת באפר PBC 5%BSA עם 0.01%sodium azide saline וקיבוע של formaldehyde.

הכינו כלוב עבור זן ה-drosophila הרלוונטי על ידי הרדמת הזבובים באמצעות פחמן דו-חמצני והעברת לפחות 100 זבובים לבקבוק פלסטיק המכיל מתאם עם מצע הזנה של אגר מיץ תפוחים. הניחו את כלוב הזבובים בחושך בטמפרטורת החדר למשך 72 שעות. החליפו את מצעי ההזנה של אגר מיץ התפוחים מדי שמונה עד 12 שעות כדי שהזבובים יסתגלו לכלוב ולא יעכבו את הטלת הביצים עבור הניסוי.

לאחר תקופת אקלמיזציה של 72 שעות, אספו עוברים 12 שעות לאחר ההחלפה האחרונה של פלטת ההזנה עם אגר מיץ תפוחים. הוציאו את פלטת ההזנה עם אגר מיץ התפוחים מכלוב ההטלה והחליפו אותה בתמיסת סלין. שטפו את פלטת ההזנה עם אגר מיץ התפוחים.

אספו את העובריים במסננת דקה. השתמשו במברשת צבע נקייה כדי לשחרר עובריים שנותרו דבוקים לצלחת. שטפו את העובריים שבמסננת בתמיסת סלין כדי להסיר עודפי שמרים; בעזרת שפכטל, אספו בעדינות את העובריים והעבירו אותם לבקבוק זכוכית קטן.

הוסיפו כ-1 ml של תמיסת סלין. לאחר מכן, סגרו את המבחנה והדגירו למשך חמש דקות כדי לשטוף את העובריים. לאחר איסוף העובריים.

הכינו את תמיסת הקיבוע בהפטן על ידי ערבוב של 50% heptane ו-50% fixative. התמיסה תהיה בשכבות, כאשר ה-heptane יהיה למעלה וה-fixative למטה. לאחר חלוף חמש דקות, השתמשו בפיפטת פסטה כדי להסיר את תמיסת הסלין העודפת מבקבוק הזכוכית המכיל את העוברים.

שטפו את העוברים במים דה-יוניים על ידי הוספת כ-1 ml של מים דה-יוניים לאבוב הזכוכית המכיל את העוברים. המתינו דקה אחת לפני הסרת המים באמצעות תמיסת bleach בריכוז 50%. נערה את האבוב מספר פעמים ביד ולאחר מכן הדגירו למשך שלוש דקות כדי לצפות את העוברים.

העוברים המטופלים ישקעו לתחתית המבחנה. ה-CORs העובריים יצופו. יש להסיר את מלבן הכלור ואת ה-CORs לאחר ד incubaton של שלוש דקות.

לאחר הקישוט, שטפו את העוברים ביסודיות במים דה-יוניזציה על ידי הוספת כ-1 ml של מים דה-יוניזציה למבחנת הזכוכית המכילה את העוברים. המתינו דקה לפני סילוק המים; שאריות של CORs יצוף ויש להסירו. הוסיפו את תמיסת הקיבוע של heptane לעוברים והדגירו אותם למשך 30 דקות עם ניעור עדין לצורך קיבוע. לאחר הקיבוע,

השתמשו בפיפטת פסטה כדי להסיר את חומר הקיבוע, המהווה את השכבה התחתונה, והשאירו את ההפטן בתוך המבחנה. לאחר מכן, הוסיפו מזורנול לתחתית המבחנה במקום חומר הקיבוע, סגרו את המבחנה ונערו אותה בעוצמה ביד כדי להסיר את קרום הוויטלין. לאחר שלב זה, העוברים המפויזרים ישקעו לתחתית המבחנה.

בעזרת פסטת-פיפט, הסר את המטנול והביצים מהמבחנה, והשאר מאחור את העוברים שדה-יוניזציה. לאחר מכן, שטוף את העוברים חמש פעמים במטנול, תוך הסרת המטנול בעזרת פסטת-פיפט בין שטיפה לשטיפה. עבור כל שטיפה, הדגר את העוברים למשך חמש דקות.

הניחו את העוברים בתערובת של 50% PBT ו-50% methanol למשך חמש דקות כדי להחזיר להם את הלחות (rehydrate). לאחר מכן, המשיכו בתהליך ההידרטציה על ידי העברתם לפתרון 100% PBT למשך חמש דקות. בשלב הבא, בצעו חסימה (block) של העוברים על ידי דגירה בפתרון 5% BSA עם 0.01% sodium azide למשך שעה אחת בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius.

בשלב הבא, הכין את הנוגדן הראשוני לצביעת העוברים על ידי דילולו לריכוז המתאים באמצעות תמיסת 5%BSA עם 0.01%Sodium azide. הנוגדים המשמשים כאן מכוונים נגד ה-vesicular cysteine string protein ונוגדן anti HRP. Anti HRP מזהה רכיב פחמימתי ספציפי-עצבי הנמצא בחלבוני פנים-השטח (glycoproteins), אשר מסמן את כל הנוירונים.

דגרו את העובריים למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס בתמיסת הנוגדן הראשוני. שטפו את העובריים 10 פעמים עם PBT לאורך שעה. על ידי הוספת כ-1 ml של PBT למבחנת הזכוכית המכילה את העובריים, המתינו שש דקות לפני הסרת ה-PBT.

חזור על תהליך זה של הנחת PBT, דגירה והסרת PBT 10 פעמים. הכן את תמיסת הנוגדן המשני בחושך מכיוון שהוא רגיש לאור, על ידי דילול לריכוז המתאים. אנו משתמשים בנוגדנים משניים מסוג Alexa בריכוז של 1:200.

דגרו את העוברים במשך שעתיים בטמפרטורה של 4°C בתמיסת הנוגדן המשני. עטפו את מבחנת הזכוכית עם העוברים ותמיסת הנוגדן המשני בנייר אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור. שטפו את העוברים 10 פעמים עם PBT לאורך שעה.

הוסיפו תוך המהרקה Vector Shield לעוברים והדגירו אותם למשך הלילה בטמפרטורה של 4 °C לצורך קיבוע. השתמשו בפיפט פסטל כדי לשאוב את העוברים יחד עם מעט מתוך הההרקה. העבירו את העוברים ואת התוך לעל slides של זכוכית.

הנח זכוכית כיסוי מעל העוברים ואטום אותה באמצעות לק ציפורניים. ביצוע הדמיה של העוברים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה. מערכת העצבים המרכזית (CNS) העוברית מוצגת בשלב 16 עד 17.

חלבון Cystine string מוצג באדום. נוירונים של HRP מוצגים בירוק. שים לב לצביעה המובחנת של הקומיסורה (commissure) בתמונה מייצגת זו.

מערכת העצבים ההיקפית (PNS) העוברית מוצגת בשלב 16 עד 17. שוב, חלבון cystine string מוצג באדום, ונוירונים מוצגים בירוק. שימו לב לדפוסי החזרה של נוירונים היקפיים.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להקפיד על העוברים כדי לא להוציאם בטעות מהמבחנה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן הכנת עוברים של oph fla לצורך ויזואליזציה של מערכת העצבים בשיטת whole mount.