Name: לשעבר אובו העובר עוף התרבות מתאים ליישומים הדמיה microsurgery מערכת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: למד שיטת תרבות עוברי עוף לשעבר לחקר אמבריולוגיה וניסויים ביולוגיים מתקדמים. טכניקה זו מאפשרת נגישות אופטית מלאה ומניפולציות מיקרוכירורגיות על עוברי תרנגולת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Ex-אובו תרבות לפרוטוקול: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור ביצים עוף מופרית <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצי תרנגולת מופרות ניתן לאחסן 13 ° C עד 5 ימים לפני הדגירה ללא ייזום ופיתוח. מקרר יין אדום יכול לשמור על טמפרטורה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצי דגירה בצד הקהה את בלחות של 60% החממה מתמיד עם נדנדה רציפה 37.5 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ערסלים (איור 1 א) <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו ¾ של 9 כוסות גרם פלסטיק עם מים סטריליים חם. רגיל 9 גרם כוס יש קוטר החלק העליון של 8 ס"מ. מצאנו כי גודל זה היה הכי מתאים ליישום תרבות זמן רב המוצג כאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור על 20 ס"מ נצמד. Circumferentially להדביק על גבי כוס על ידי הנחת גומייה סביב. פלסטיק צריך להתפשט על גבי המים. חותכים את עודפי פלסטיק סביב הלהקה. מצאנו נצמד להיות המתאים ביותר עבור יישום זה מכיוון שהוא מונע הידבקות של חלמון, וכתוצאה מכך פיצול חלמון במהלך ההובלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגבו את הפלסטיק עם kimwipes (קימברלי קלארק, Inc) הרטובות עם אתנול 70%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ביצים באינקובטור לאחר 72 שעות של דגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר ביצים ידי ניגוב פני השטח עם kimwipes אתנול 70% הרטובות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הביצים אופקית עבור 1-2 דקות על מיקום תקין של העובר (איור 1b). קרטון ביצים יכול לשמש המטילה ביצי אופקית. עוברים יסתובב העליון אחרי 1-2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת העוברים על ערסלים בסביבה נקייה מחיידקים במנדף זרימה למינרית. <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת קצה חד (כמו קצה דלי מתכת או כוס זכוכית), הקש את הביצה בעדינות עד שלא שקע קטן על החלק התחתון של הביצה (איור 1 ג'). זכרו, העובר ממוקם על upperside. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את אגודליו משני צדי השקע ולשלוף את הקליפות בנפרד אופקית (איור 1d). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החלמון עם העובר וכן אלבומין על גבי ערסל (דמות 1e). אלבומין תספק סביבה לחה סביב החלמון לספוג זעזועים הנגרמת על ידי העברת מערכת וכן הוא מספק תזונה לעובר על נוהלי תרבות ארוכה. מים מתחת הערסל יבטיח העובר יישאר במקביל לקרקע במהלך התחבורה לשמש מוליך חום במהלך הדמיה אם תנור זרימת מים משמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העובר צריך להיות כבר ממוקמת על אם ההעברה נעשית כראוי. אם לא, להשתמש unsharp, חפץ סטרילי (טיפ בלאנט כלומר, מספריים מעוקל סגורה) ו ללטף directionally החלמון כזה העובר מסתובב למעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בקוטר 10 ס"מ צלחת פטרי על גבי הכוס לאטום את העובר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כוס תרבות לתוך להגדיר את החממה על 37.5 ° C. אם חממה נייד משמש, הצבת ספטמבר 1-2 כוסות גרם מלא מים מזוקקים שומר על לחות ב ~ 60% (איור 1f). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם עוברים culturing מעבר ליום עובריים 7, חתיכות קליפת כתוש צריך להיות מפוזרים ברחבי הפריפריה של העובר כמקור לסידן להתפתחות עצם התבגרות. </li></ol> אביזרים וציוד חממה מחוץ הדמיה / מניפולציה: אמבט מים במחזור נבנה בבית כדי לשמור על טמפרטורת הדגירה בעוד הדמיה או מניפולציה (איור 3). אמבט מים שיכולים להתאים את הגביע מחובר דרך צינורות בגודל המתאים למאגר מים. דוד התנגדות מחממת את המים במאגר אשר מוסדר באופן ידני על ידי ביצוע טמפרטורת המים. משאבת המים מזרימה את המים. ייצוג Pictoral מתאר להקל הדמיה באמצעות ultrasongraphy / מיקרוסקופיה florescent (איור 3). <img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. הכנת ערסל והעברת עוברים עוף ערסלים. <img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. תוצאות נציג -. שונה עוף בשלב עוברי גדל באמצעות טכניקה לשעבר תרבות אובו עוברים מבית HH 17 ואילך ניתן לגדל באמצעות טכניקה זו. <img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. תמונות סכמטי ונציג של מערכת מחזור מים הפועל בשיתוף עם מערכת לשעבר אובו התרבות לשמור עוברים בטמפרטורת פיתוח אידיאלי. 2. יישומים נבחרים: I. Microinjection זו תרבות העובר מתאים ליישומים microinjection איפה הפתרונות צריכים להיות מוזרק אל vasculature הדמיה בניגוד מבוסס (כלומר, מיקרוסקופ פלואורסצנטי, מיקרו שחושב טופוגרפיה וכו ') (איור 4). להלן פרוטוקול microinjection: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את appara הזרקהTus <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופנה משך 0.75 כוס מזהה צינורות לתוך נימי microneedles קצה משופעים באמצעות microforge. גודל קצה הנדרשת תלויה בשיעור וריד קוטר / זרימה היעד הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חברו את המזרק 0.03 צינורות מזהה אינץ סיליקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את צינורות עם הפתרון להיות מוזרק ולחבר את microneedle אל הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את microneedle על micromanipulator לבין מזרק לבעל מזרק או משאבת מזרק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים מים סטריליים בגביע ובכך להעלות את העובר. חווינו כי חדירה נכונה של המחט לתוך כלי דם (כלומר, כלי vitelline), חדירה אופקית הכרחי. זה דורש העובר להיות על המטוס זהה את שולי הכוס. <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוציאו את הגומייה מחזיק את הפלסטיק מתחת העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם צד אחד של הפלסטיק בעדינות להוסיף קצת מים סטריליים כדי הגביע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Secure את הגומייה על הפלסטיק שוב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק הפתרון כלי עובריים. מניסיוננו, כאשר פתרון מוזרק לכלי vitelline, microneedles צריכה להיות ה כ 1 / 10 בגודל של קוטר כלי לשמור זלוף ויעיל מבלי לגרום לדימום. <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משאבה הפתרון microneedle הבטחת אין היווצרות של בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את קצה microneedle על כלי שנבחר. עבור כלי vitelline, בחירת אזור מזלג ייתן שטח מרבי לחדור אל הספינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחוף את המחט לכיוון הספינה. הכלי יהיה הראשון לחזור. לאחר המחט חודרת, להתחיל זלוף. צבעו של הדם הזורם צריך לשנות עם זלוף. אם משנים את צבעם אינו נראה, המחט עשוי חדרו מתוך הספינה. במקרה כזה, לאט לאט לחזור microneedle ובמקביל שאיבה פתרון עד לשנות צבע כלי נתפסת. לאחר זלוף תושלם, לסגת microneedle מתוך הספינה. </li></ol></li></ol><img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4: Microinjection של פלורסנט לצבוע לתוך כלי הדם של העובר לשעבר אובו חומוס מתורבת. השנייה. נוהל Microsurgical - קשירת פרוזדורים שמאלי זו ההגדרה לשעבר אובו תרבות אידיאלית עבור יישומי ביצוע הניתוח על עוברי אפרוח שכן הוא מספק נגישות מלאה העובר. להלן פרוטוקול טכניקה דוגמה, עזב קשירת פרוזדורים (LAL) (איור 5). ההליך מבוצע כ 24 שעות לתוך התקופה תרבות (HH24): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הבוהן קשרים ~ 0.5 מ"מ בקוטר 10-0 באמצעות תפר ניילון כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בסדר, מקומי להסיר את קרום כוריוני ו allantoic על העובר והרם את העובר מהחלק האחורי כדי לסובב את זה במאונך כזה כי הצד השמאלי של העובר גלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בסדר, להסיר את קרום הלב על אטריום שמאל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את הקשר על אטריום שמאל ולהדק אותו. הקשר צריך להיות קשור כדי לאסור ~ 75% של זרימת הדם המקורית בצד שמאל. חותכים את הקצוות של הקשר עם microscissors ובזהירות להסיר ולסלק תפר עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את העובר בחזרה לכיוון המקורי (צד ימין למעלה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שולטת שאם יהיה כרוך בפרוצדורה זהה אך תפר תהיה רק ​​עבר ולא קשור. טיפול אפקטיבי LAL (75 מועקה%) יאושר ב 24 שעות שלאחר הניתוח, עוברים נפסל ייכללו. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2154/2154fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5:. מלאה עובר שמאל פרוזדורים חומוס ligated החץ מראה את הפרוזדורים שמאל, שזה בערך 75% קטן יותר בעובר ligated.

<ol><li>Zamir, E. A., Czirok, A., Cui, C., Little, C. D., Rongish, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesodermal+cell+displacements+during+avian+gastrulation+are+due+to+both+individual+cell-autonomous+and+convective+tissue+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mesodermal cell displacements during avian gastrulation are due to both individual cell-autonomous and convective tissue movements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19806-19811 (1980).</li>
<li>Ehrman, L. A., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+regulation+in+the+heart+forming+region+of+avian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Lack of regulation in the heart forming region of avian embryos.</a> Dev Biol. 207, 163-175 (1999).</li>
<li>Clark, E. B., Hu, N., Rosenquist, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+conotruncal+constriction+on+aortic-mitral+valve+continuity+in+the+stage+18%2C+21+and+24+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Effect of conotruncal constriction on aortic-mitral valve continuity in the stage 18, 21 and 24 chick embryo.</a> Am J Cardiol. 53, 324-327 (1984).</li>
<li>deAlmeida, A., McQuinn, T., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+ventricular+preload+is+compensated+by+myocyte+proliferation+in+normal+and+hypoplastic+fetal+chick+left+ventricle%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Increased ventricular preload is compensated by myocyte proliferation in normal and hypoplastic fetal chick left ventricle.</a> Circ Res. 100, 1363-1370 (2007).</li>
<li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Methods. 24, 43-48 (2001).</li>
<li>Butcher, J. T., McQuinn, T. C., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+in+early+embryonic+atrioventricular+valvular+function+correspond+with+changes+in+cushion+biomechanics+that+are+predictable+by+tissue+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition.</a> Circ Res. 100, 1503-1511 (2007).</li>
<li>McQuinn, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+ultrasonographic+imaging+of+avian+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">High-frequency ultrasonographic imaging of avian cardiovascular development.</a> Dev. Dyn. 236, 3503-3513 (2007).</li>
<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+procedure+for+the+long-term+cultivation+of+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos.</a> Dev Biol. 41, 391-394 (1974).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

גישה אופטית ניסויים בעוברים העופות הוא מאתגר בשל אילוצים של קליפת ביצה. Windowing משמעותי מגבילה את מספר microvessels נגיש גישות הזרקת microsurgical 8. כתוצאה מכך רק עוברי מוקדם ניתן להשפיע תצפית רציפה אינו אפשרי. מוקדם לשעבר אובו תרבויות באמצעות צלחות פטרי היו של שימוש מוגבל בשל שליטה מספקת מתח הפנים על העובר מנעו תרבות ארוך טווח 9. אנחנו לאחרונה שיפור הטכניקה הזו באמצעות סירה משושה לשקול המקיימת tenstion משטח מקובלת 7, אבל אלה היו תרבויו...

<table><tbody><tr><td>ביצי תרנגולת לבנות מזן Leghorn פוריות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>דגם GB1, Avery Incubators, Hugo CO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ניילון נצמד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>גומיות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מים סטריליים חמימים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>כוס פלסטיק בנפח 9 oz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלח פטרי בקוטר 100 מ"מ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אוויר תרמי 1602N</td><td>ייצור GQF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>דקסטראן מצומד לפלואורסצאין (2 MDa, 1% משקל/נפח בתוסף פוספט (PBS))</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרופורג' (Microforge)</td><td>Glassworx, Inc, סנט לואיס, מיזורי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינורות קפילריה מזכוכית (קוטר פנימי 0.75 מ"מ)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מניפולטור</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>דגם M3301L</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופיה פלואורסצנטית</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Z20</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה עדינה 55</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חוט תפירה כירורגי ניילון 10-0</td><td>Ethicon Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינוריות</td><td>VWR international</td><td></td><td>קוטר חיצוני של 1 מ"מ</td></tr><tr><td>מזרק של 3 מ"ל</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;פיפטור L וטיפי פיפטה</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

לשעבר אובו העובר עוף התרבות מתאים ליישומים הדמיה microsurgery מערכת

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

הבנת יחסי הגומלין בין גורמים גנטיים microenvironmental כי ההתפתחות העוברית כונן רגיל פגום מהותית על גילוי אסטרטגיות טיפוליות חדשות. התקדמויות טכנולוגיית הדמיה אפשרו חקירה כמותית של הארגון והתבגרות של התוכנית הגוף, אבל המורפוגנזה עובריים בשלב מאוחר יותר הוא פחות ברור. עוברי עוף הם בעלי חיים בעלי חוליות אטרקטיבי מודל המערכת עבור יישום זה בגלל קלות של תרבות מניפולציה כירורגית. עוברי מוקדם יכול להיות מתורבת לזמן קצר על טבעות נייר סינון, המאפשר גישה אופטיים המלא ל דפוסים התא מחקרים 1,2 הגורל. לימוד תהליכים התפתחותיים מתקדמות כגון המורפוגנזה לב מבוצעים באופן מסורתי דרך חלון של קליפת 3-5, אבל הטכניקה הזו מגבילה גישה אופטית בשל גודל חלון. אנחנו קודם לכן פיתחו שיטה פשוטה לתרבות עוברים כל לשעבר אובו על סירות לשקול משושה עד 10 ימים, מה שאיפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה באמצעות אולטרסאונד 6,7. תרבויות אלו היו קשים בתחבורה, להגביל את סוגי כלי הדמיה עבור ניסויים לחיות. כאן אנו מציגים שיפור מערכת קרב פחות תרבות עם תא, חסכונית סביבתי נייד. ביצים סדוקות על ערסל נוצר על ידי קרום פוליאוריטן (נצמד) מודבקת circumferentially על כוס פלסטיק מלאה חלקית עם מים סטריליים. מידות ההיקף והעומק של הערסל שניהם קריטי לשמור על מתח הפנים, בעוד המכניקה של הערסל מים מתחת עזר לשכך ויברציות המושרה על ידי התחבורה. טביעת רגל קטנה במחזור אמבט מים פותחה גם כדי לאפשר בקרת טמפרטורה רציף במהלך הניסויים. אנו מדגימים את היכולת עוברי התרבות בדרך זו לפחות במשך 14 ימים ללא פגם morphogenic או עיכוב להעסיק זו מערכת microsurgical מספר יישומי הדמיה.

במאמר זה, אנו מציגים מתודולוגיה פשוטה כדי לאפשר לטווח ארוך<em&gt; לשעבר אובו</em&gt; העובר העופות תרבות. טכניקה זו היא אידיאלית עבור ניסויים האורך הדורשים נגישות אופטי מלא ו / או תחבורה סטרילי בעוברים העופות.

הבנת הקשרים בין גורמים גנטיים וסביבתיים-מיקרוסקופיים המניעים התפתחות עוברית תקינה או פגומה היא חיונית ל...

במערכת תרבית עוברי עוף מסוג X ovo, הכנת תרביות עוברי אפרוח ללא קליפה מאפשרת חקירה של תהליכי האמבריוגנזה. הפרוצדורה מתחילה בהשגת ביצי תרנגולת מופרות ודגירה שלהן בטמפרטורה של 37.5 °C למשך 72 שעות. לאחר מכן מוכנים "המmocks" להחזקת חלמוני הביצים שבהם גדלים העוברים.לאחר מכן, ניתן להעביר את חלבוני הביצה אל "ערסלים", והבריוגנזה ממשיכה מחוץ לקליפה. ניתן ליישם טכניקה זו להזרקה מיקרוסקופית אל תוך כלי הדם, לאולטרסונוגרפיה ולמיקרו-כירורגיה, והתוצאות יכולות להראות כיצד עוברים מתפתחים בתנאים נורמליים ובתנאים משובשים. שלום, שמי Akshay Shaker ואני סטודנט לתואר שני במעבדה להנדסה ביו-התפתחותית קרדיווסקולרית המנוהלת על ידי Jonathan Butcher במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת Cornell.היתרון המרכזי של הטכניקה שלנו על פני שיטות קודמות, כגון תרבית ביצים in ovo, הוא שהיא מספקת גישה אופטית מלאה לעובר וכן קלות שינוע ללא נזק. שלום, שמי צ'אר הין. אני חוקר פוסט-דוקטורט במעבדה לביהנדוס ביולוגי של התפתחות קרדיווסקולרית, מעבדתו של ג'ונתן צ'ו במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת קורנל.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית, כגון האופן שבו פגמים בלב מתפתחים במהלך העוברולוגיה. לפני תחילת הפרוצדורה, יש לעקר את כל החומרים על ידי ניגוב ב-70% ethanol. כדי להתחיל בפרוצדורה, מלאו שלושה רבעים מכוס פלסטיק של תשעה אונקיות במים סטריליים חמימים.חזרו על הפעולה עבור מספר הכוסות הדרוש. לכוס רגילה של תשעה אונקיות יש קוטר עליון של שמונה סנטימטרים, שהוא הגודל המתאים ביותר ליישום התרבית הממושכת המוצג כאן. לאחר מכן, גזרו חתיכה של 20 סנטימטרים של ניילון נצמד.כסו את חלקו העליון של כוס הפלסטיק בנפח תשעה אונקיות המלאה במים סטריליים חמימים באמצעות פיסת ניילון נצמד, והשתמשו בגומייה כדי להחזיק את הניילון במקומו. ניילון נצמד הוא החומר המתאים ביותר ליישום זה כיוון שהוא מונע הידבקות של החלמון, דבר שעלול להוביל לפיצולו. במהלך ההובלה, יש למתוח את הפלסטיק כך שייגע בחלק העליון של המים.גזרו את עודפי הפלסטיק מסביב לרצועה ונגבו את הפלסטיק. באמצעות מגבוני Kim ספוגים ב-70% ethanol, ה"המקים" (hammocks) מוכנים כעת לתמוך בעוברים. ביצי תרנגולת מופיות ניתנות לאחסון בטמפרטורה של 13 degrees Celsius עד חמישה ימים לפני הדגירה.ללא הפעלת הפיתוח, ניתן להשתמש במקרר יין אדום כדי לשמור על טמפרטורה זו על מנת להכין את הביצים לתרבית. הפעילו את התפתחות העובר על ידי דגירה של הביצים בזווית של צד אחד למעלה באינקובטור בעל לחות קבועה של 60% עם ניעור רציף בטמפרטורה של 37.5 degrees Celsius למשך 72 שעות. כאשר הביצים מוכנות, הוציאו אותן מהאינקובטור.סטריליזציה של הביצים תתבצע על ידי ניגוב עם מגבוני Kim wipes טבולים ב-70% ethanol. יש להניח את הביצים בצורה אופקית על דפנותיהן בתבנית ביצים למשך דקה עד שתי דקות כדי להבטיח מיקום נכון של העובר. יש לעבוד עם שישה ביצים לכל היותר בכל פעם, שכן ניסיון לסדוק יותר משישה ביצים בבת אחת עלול להקשות על התהליך.עלול להוביל לשהייה ממושכת מדי בטמפרטורת החדר, דבר שעלול להשפיע על החיוניות. בתום דקה עד שתי דקות, העובר מחליק לחלקו העליון של הביצה. כדי להעביר כל עובר להמקה (hammock), יש לעבוד בצורה אספטית בתוך מנדף זרימה למינרית.ראשית, סדקו בעדינות את החלק התחתון של הביצה באמצעות קצה חד, כגון קצה של דלי מתכת או ביקר זכוכית. זכרו כי העובר נמצא בחלק העליון. הפרידו בעדינות בין שני חצאי קליפת הביצה על ידי משיכה לצדדים באמצעות שני אגודלים.לאחר מכן, הניחו את העובר, החלמון והאלבומין על ערסל התמיכה. האלבומין מספק סביבה בולמת זעזועים סביב החלמון, הסופגת זעזועים הנגרמים מהזזת המערכת. כמו כן, האלבומין מספק תזונה לעובר במהלך תקופת התרבית הממושכת.אם העברת העובר בוצעה כראוי, העובר אמור להיות ממוקם כבר בחלק העליון. אם העובר נמצא בתחתית, השתמשו בלולאה סגורה, במספריים קטנים או בכלי קהה דומה כדי לשפשף את החלמון כך שיסתובב סביב עצמו והעובר יעלה למעלה. אם אתם מתרבים עוברים מעבר ליום השביעי של השלב העוברי, פזרו חלקי קליפת ביצה גרוסה מסביב להיקף העובר כמקור לסידן לצורך התפתחות ובשלות של העצמות.לאחר השלמת העברת העובר, הנח על גבי הכוס צלחת פטרי בקוטר 10 סנטימטר כדי לאטום את העובר. הנח את ערסול העוברים באינקובטור המכוון ל-37.5 °C. במידה ונעשה שימוש באינקובטור נייד, הנח בתוכו גם כוס אחת עד שתיים בנפח תשעה אונקיות המלאות במים.על מנת לשמור על לחות של כ-60% העוברים ממשיכים להתפתח וניתן להשתמש בהם להזרקה מיקרוסקופית ביישומים של מיקרו-כירורגיה. תרבית עוברים זו מתאימה ליישומי הזרקה מיקרוסקופית שבהם יש להזריק תמיסות למערכת כלי הדם. ראשית, הכינו את מכשיר ההזרקה החל מהמחטים, תוך שימוש במיקרו-פורג' (micro forge) לעיצוב צינורות קפילריים מזכוכית למחטי מיקרו בעלות קצה משופע.גודל הראש תלוי בקצב הזרימה הרצוי. חבר את מזרק המיקרו-מחט לצינור סיליקון בעל קוטר פנימי של 0.03 inch. מלא את צינור המזרק בתמיסה להזרקה וחבר את מיקרו-המחט של המזרק לצינור.מקם את המחט המיקרוסקופית (microneedle) על המיקרו-מניפולטור ואת המזרק על תומך המזרקים או על משאבת מזרקים. לאחר שמכלול ההזרקה מוכן, הוצא את העוברים. חדירה אופקית של המחט נדרשת כדי להבטיח כניסה נכונה של המחט לכלי דם, כגון כלי דם חיוני.לפיכך, יש לוודא שהעובר נמצא באותו גובה של דפנות הכוס המכילה אותו. כדי להעלות את העובר, הסירו את גומיית הגומי המחזיקה את ניילון הנמעך שתומך בעובר. הרימו בעדינות צד אחד של הניילון והוסיפו מים לכוס מבלי להזיז את העובר יתר על המידה.לאחר מכן, הנח שוב את גומיית הגומי על הפלסטיק. כעת, כאשר העובר מורם, ניתן להזריק את התמיסה לכלי דם עוברי. שים לב שכאשר מזריקים לכלי דם חיוני, גודל המיקרו-מחט צריך להיות בערך עשירית מקוטר כלי הדם.כדי לשמור על פרפוזיה יעילה מבלי לגרום לדימום, ראשית, הזרים את התמיסה לתוך המחט המיקרוסקופית כך שלא יישאר אוויר כלוא בתוכה. לאחר מכן, יישר את קצה המחט המיקרוסקופית עם כלי דם נבחר עבור כלי דם חיוניים. בחירת אזור רחב תעניק את השטח המקסימלי למיקוד בכלי הדם.לאחר הגדרת אזור ההזרקה, דחפו את המחט לעבר כלי הדם. כלי הדם נסוג תחילה. ברגע שהמחט חודרת, התחילו בפרפוזיה; צבע הדם הזורם משתנה עם תחילת הפרפוזיה.אם לא נצפית שינוי בצבע, ייתכן שהמחט נדחפה דרך כלי הדם. במקרה זה, משוך לאט את המיקרו-מחט תוך כדי הזרקה סימולטנית של התמיסה, עד ששינוי בצבע יהיה גלוי בכלי הדם. כאשר הפרופזיה מסתיימת, משוך בעדינות את המיקרו-מחט אל מחוץ לכלי הדם. תרבית עובר זו מתאימה גם ליישומים של מיקרו-כירורגיה כגון קשירה של העלייה השמאלית, המתבצעת ביום הרביעי של האינקובציה.ראשית, הכין קשרים בקוטר 0.5 millimeter מחוטי תפירה כירורגיים מסוג nylon 0. באמצעות פינצטה עדינה, הסר את קרומי השליה (chorionic) וה-LAN toic מהעובר. הרם את העובר מהגב וסובב אותו אנכית כך שהצד השמאלי של העובר יהיה כעת למעלה ונגיש.לאחר מכן, הסר את הפריקרדיום מעל העליה השמאלית. יישר את הקשר מעל העליה השמאלית והדק אותו על ידי אחזקה ומשיכה מצדדיו בעזרת פינצטה; יש לקשור את הקשר כך שיחסום כ-75% מזרימת הדם המקורית לצד השמאלי. גזור את קצות הקשר בעזרת מיקרו-מספריים והסר בזהירות את שארית התפר המיותרת והשלך אותה.לבסוף, סובבו את העובר חזרה לאוריינטציה המקורית שלו, כך שהצד הימני נמצא למעלה. מוצגים כאן עוברים בשלבים שונים שגודלו X ovo כפי שהודגם זה עתה; מחמם עם סירקולציית מים יכול לשמור על התנאים הסביבתיים למשך פרקי זמן ממושכים, שעשויים להידרש במהלך דימות ויישומים של מיקרו-כירורגיה.עוברי אפרוחים שגודלו בשיטת X ovo מתאימים להזרקה מיקרוסקופית. בניסוי זה, צבע פלואורסצנטי הוזרק למערכת כלי הדם של עוברי אפרוחים שגודלו בשיטת X ovo. עוברי אפרוחים שגודלו בשיטת X ovo מתאימים לניתוחים מיקרוסקופיים.בניסוי זה, בוצע הליך של קשירה של העלייה השמאלית בעובר אפרוח שגודל בשיטת X ovo. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע תרבית של עוברים של אפרוחים בשיטת X ovo בכ-5 דקות לכל עובר. לאחר צפייה בסרטון זה, תיווצר הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן ליצור תרביות עוברים של אפרוחים בשיטת XO המתאימות ליישומי דימוי ומיקרו-כירורגיה, ובמקרים בהם נדרש שינוע של התרביות.

an-ex-ovo-chicken-embryo-culture-system-suitable-for-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מדגים תרבות חדש, שיטה שבאמצעותה הם עוברים חומוס בתרבית מחוץ הביצה עד 24 שעות. שיטה זו מאפשרת ללמוד פיתוח מוקדם (פס פרימיטיביים עד 14 סום.), תקופה המקבילה E7-9 בעכבר. יישומים של טכניקה זו כוללים electroporation, ב הכלאה אימונוהיסטוכימיה באתרו.

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

Chorioallantoic חומוס קרום (רמ"א) הוא ייחודי, immunodeficient באופן טבעי בסביבה תומכת תרבות ללמוד אנגיוגנזה tumorigenesis. מאמר זה וידאו מדגים את השלבים השונים...

אפרוח אובו לשעבר תרבות אובו לשעבר CAM Assay: איך זה באמת עובד

סרטון זה מדגים את תרבית ex vivo והדמיה של פרוסות אוקולומוטוריות מעוברי עכברים טרנסגניים. העוברים מבודדים ומוטבעים באגרוז. באמצעות ויברטום, פרוסות המכילות את גרעיני oculomotor ואת העיניים מתקבלים. הפרוסות נשמרות בתרבית ומצולמות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תרבית Ex Vivo והדמיה של פרוסות אוקולומוטוריות מעוברי עכברים טרנסגניים

תרבויות פרוסות להקל על המניפולציה של התפתחות עובר על ידי גן והפרעות תרופתיות. עם זאת, תנאי התרבות חייבים להבטיח שהתפתחות תקינה יכולה להמשיך בסביבה המופחתת של הפרוסה. אנו מדגימים פרוטוקול המאפשר פיתוח חוט שדרה רגיל להמשיך לפחות 24 שעות.

פרוטוקול עוף עובר חוט שדרת Slice תרבות

מיטוזה העצבית היא פרמטר קריטי הנוירוגנזה. חלק גדול מההבנה של מיטוזה העצבית שלנו מבוסס על ניתוח של רקמה קבועה. הדמיה בשידור חי בפרוסות מוח עובריים היא טכניקה צדדי כדי להעריך מיטוזה עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה בסביבה מבוקרת.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

צפייה וגישה לעובר התרנגולת במהלך ההתפתחות יכולה להיות מאתגרת. פיתחנו שיטת ex ovo שהיא פשוטה, חסכונית וניתן להשתמש בה בקלות בכיתה או במסגרת מחקר. שיטה זו מספקת גישה לעובר בשלבים מאוחרים של התפתחות עוברית (HH 40).

מותאם באופן מיטבי Ex-אובו Culturing של Chick עוברים לשלבים מתקדמים של פיתוח

כאן, אנו מציגים טכניקה חדשה לתרבית עוברי אפרוחים ex ovo להדמיית זמן-lapse באמצעות אור מועבר ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית. כריך נייר הסינון השקוע הוא גרסה של טכניקת נושא נייר הסינוןהמבוססת 1 המאפשרת גידול של עוברי אפרוחים שקועים במלואם במדיום תרבית נוזלי.

כריך נייר מסנן מתחת למים במשך לטווח ארוך אקס אובו זמן לשגות הדמיה של מוקדם צ'יק עובר

פרוטוקול זה מתאר שלוש שיטות כיצד להשיג ולהשתמש בעוברי עוף בני 5 עד 8 ימים ובממברנה הכוריאואלנטואית שלהם (CAM) כמודל in vivo לחקר הדמיית אולטרסאונד משופרת ניגודיות ואספקת תרופות בתיווך מיקרו-בועות.

הכנת עוברי עוף אקס אובו וכלי קרום כוריואלנטואיים כמודל In Vivo להדמיית אולטרסאונד משופר ניגודיות ומחקרי אספקת תרופות בתיווך מיקרו-בועות

המטרה הכוללת של מאמר זה היא לתאר כיצד לבצע בהזרקה תוך תאית של אובו של חומרים אקסוגניים לעוברי עוף. גישה זו שימושית מאוד כדי לחקור את הביולוגיה ההתפתחותית של עוברי תרנגולות.

באובו הזרקה תוך-וסקולרית בעוברי עוף

פרוטוקול זה פותח כדי לנטר לאורך זמן את התכונות המכניות של רקמת הצלחת העצבית במהלך נוירולציה של עובר אפרוח. הוא מבוסס על שילוב של מיקרוסקופ ברילואין ומערכת דגירה על הבמה, המאפשרת הדמיה מכנית חיה של רקמת לוחית עצבית בעוברי אפרוחים בתרבית לשעבר .

מעקב אחר האבולוציה המכנית של רקמה במהלך סגירת הצינור העצבי של עובר אפרוח

למד שיטת תרבות עוברי עוף לשעבר לחקר אמבריולוגיה וניסויים ביולוגיים מתקדמים. טכניקה זו מאפשרת נגישות אופטית מלאה ומניפולציות מיקרוכירורגיות על עוברי תרנגולת.

לשעבר אובו העובר עוף התרבות מתאים ליישומים הדמיה microsurgery מערכת

גלה סרטונים נוספים