לשעבר אובו העובר עוף התרבות מתאים ליישומים הדמיה microsurgery מערכת

במערכת תרבית עוברי עוף X ovo הכנת רשימת קונכיות תרביות עוברי אפרוחים מאפשרת חקירה של אמבריוגנזה. ההליך מתחיל בהשגה ודגירה של ביצי עוף מופרות בטמפרטורה של 37.5 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות. מכינים ערסלים להחזקת החלמונים עם העוברים הגדלים.

לאחר מכן, ניתן להעביר חלמונים על ערסלים, והעובריות ממשיכות מחוץ לקליפה. ניתן ליישם טכניקה זו להזרקת מיקרו לכלי דם, אולטרה סונוגרפיה ומיקרו-כירורגיה, והתוצאות יכולות להראות כיצד עוברים מתפתחים בתנאים רגילים ומופרעים. היי, שמי אקשי שאקר ואני סטודנט לתואר שני במעבדה לביו-הנדסה התפתחותית קרדיווסקולרית המנוהלת על ידי ג'ונתן בוצ'ר במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת קורנל.

והיתרון העיקרי של הטכניקה שלנו על פני שיטות קודמות, כמו בתרבית ביציות, הוא שהיא מספקת גישה אופטית מלאה לעובר כמו גם קלות הובלה ללא נזק. שלום, שמי צ'אר הין. אני חוקר פוסט-דוקטורט במעבדה לביו-הנדסה התפתחותית קרדיווסקולרית, מעבדת ג'ונתן צ'ו במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת קורנל.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית, כגון כיצד מומי לב מתפתחים במהלך האמבריוגנזה. לפני שמתחילים בהליך זה, יש לעקר את כל החומרים על ידי ניגוב באתנול 70%. כדי להתחיל בהליך, מלאו שלושת רבעי פלסטיק של תשעה גרם במים סטריליים חמים.

חזור על הפעולה עם כמה כוסות שצריך. לכוס רגילה של תשעה אונקיות יש קוטר עליון של שמונה סנטימטרים, שהוא הגודל המתאים ביותר ליישום התרבית המורחבת המוצג כאן. לאחר מכן, חותכים חתיכת ניילון נצמד באורך 20 סנטימטר.

מכסים את החלק העליון של הפלסטיק בגודל 9 גרם מלאה במים סטריליים חמים בחתיכת ניילון נצמד, והשתמשו בגומייה כדי להחזיק את הניילון במקומו. ניילון נצמד הוא המתאים ביותר ליישום זה מכיוון שהוא מונע הידבקות של החלמון, מה שעלול לגרום לפיצול החלמון. במהלך ההובלה יש לפזר את הפלסטיק כך שייגע בחלק העליון של המים.

חותכים את עודפי הפלסטיק סביב הרצועה ומנגבים את הפלסטיק. עם מגבוני קים המשולבים באתנול 70%, הערסלים מוכנים כעת לתמוך בעוברים. ניתן לאחסן ביצי עוף מופרות בטמפרטורה של 13 מעלות צלזיוס עד חמישה ימים לפני הדגירה.

מבלי להפעיל את ההתפתחות, מקרר יין אדום יכול לשמור על טמפרטורה זו על מנת שהביצים יהיו מוכנות לתרבית. הפעל את התפתחות העובר על ידי דגירה של הביצים אתר אחד למעלה באינקובטור לחות קבועה של 60% עם נדנוד רציף ב-37.5 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות. כשהביצים מוכנות, הוציאו אותן מהחממה.

עקרו את הביצים על ידי ניגוב עם מגבוני קים גראס עם 70% אתנול. הניחו את הביצים בצורה אופקית על דפנותיהן על קרטון ביצים למשך דקה עד שתיים למיקום נכון של העובר. עבדו עם שש ביצים לכל היותר בכל פעם מאז שניסיתם לפצח יותר משש ביצים בבת אחת.

עלול לגרום לשמירה על טמפרטורת חדר היציאה זמן רב מדי, מה שעלול להשפיע על הכדאיות. בתום דקה עד שתיים, העובר החליק לראש הביצה. כדי להעביר כל עובר לערסל, עבדו בצורה אספטית במכסה זרימה למינר.

ראשית, סדקו בעדינות את החלק התחתון של הביצה בעזרת קצה חד כמו קצה דלי מתכת או זכוכית. זכרו שהעובר נמצא בצד העליון. מפרידים את שני חצאי קליפת הביצה בעדינות על ידי משיכה לצדדים בשני אגודלים.

לאחר מכן הניחו את העובר, החלמון והאלבומין על הערסל. האלבומין מספק סביבת שיכוך סביב החלמון הסופגת זעזועים הנגרמים מהזזת המערכת. האלבומין מספק גם תזונה לעובר בתקופת התרבית הארוכה.

אם העברת העובר מתבצעת כראוי, העובר כבר צריך להיות ממוקם למעלה. אם העובר נמצא בתחתית, השתמש בעקומה סגורה, במספריים קטנים או במכשיר קהה דומה אחר כדי לשפשף את החלמון כך שהוא יסתובב סביב עצמו והעובר יעבור למעלה. אם מגדלים עוברים מעבר לעובר, ביום השביעי, פזרו חתיכות קליפת ביצה מרוסקות סביב פריפריה של העובר כמקור סידן להתפתחות והתבגרות העצם.

לאחר השלמת העברת העובר, הניחו צלחת פטרי בקוטר 10 סנטימטרים על גבי הכוס כדי לאטום את העובר. הנח את הערסל בחממה מכוונת ל -37.5 מעלות צלזיוס. אם משתמשים בחממה ניידת, הניחו גם אחת עד שתיים של תשעה אונקיות מלאות במים בחממה.

על מנת לשמור על לחות של כ-60% העוברים ממשיכים להתפתח וניתן להשתמש בהם למיקרו-הזרקה ביישומים מיקרו-כירורגיים. תרבית עובר זו מתאימה ליישומי מיקרו-הזרקה שבהם יש להזריק פתרונות לכלי הדם. ראשית, הכינו את מנגנון ההזרקה החל מהמחטים, תוך שימוש בצורת מיקרו זיוף, צינורות נימי זכוכית משוכים לתוך מחטי קצה משופעות.

גודל הקצה תלוי בקצב הזרימה הרצוי. חבר את מזרק המיקרו-מחט לצינורות סיליקון בקוטר פנימי של 0.03 אינץ'. טען את צינור המזרק בתמיסה להזרקה וחבר את מיקרו-מחט המזרק לצינור.

הנח את המיקרו-מחט על המניפולטור המיקרו והמזרק למחזיק המזרק או למשאבת המזרק. לאחר שמכלול ההזרקה מוכן, אחזר את העוברים. חדירה אופקית של המחט נדרשת לכניסה נכונה של המחט לכלי דם כגון כלי חיוני.

לכן העובר צריך להיות באותה רמה כמו שולי הכוס המחזיקים אותו. על מנת לגדל את העובר, הסירו את הגומייה המחזיקה את הניילון התומך בעובר. הרימי צד אחד של הפלסטיק בעדינות והוסיפי מעט מים לכוס מבלי להזיז את העובר יותר מדי.

לאחר מכן הניחו שוב את הגומייה על הפלסטיק. כעת, לאחר שהעובר מורם, ניתן להזריק את התמיסה לכלי עוברי. שימו לב שכאשר מזריקים כלי חיוני, גודל המיקרו-מחט צריך להיות בערך עשירית מגודל קוטר הכלי.

כדי לשמור על זלוף יעיל מבלי לגרום לדימום, ראשית, יש לשאוב את התמיסה לתוך המיקרו-מחט כך שלא יילכד אוויר בפנים. לאחר מכן, יישר את קצה המיקרו-מחט עם כלי נבחר לכלי דם חיוניים. בחירת אזור עבור נותנת שטח מקסימלי למיקוד כלי השיט.

לאחר הגדרת אזור ההזרקה, דחוף את המחט לכיוון הכלי. הכלי נסוג תחילה. ברגע שהמחט חודרת התחל זלוף, צבע הדם הזורם משתנה עם הזלוף.

אם לא רואים את שינוי הצבע, ייתכן שהמחט נדחפה דרך הכלי במקרה כזה, משוך לאט את המיקרו-מחט תוך שאיבת תמיסה בו זמנית עד שנראה שינוי צבע בכלי. בסיום השפע, משוך בעדינות את המיקרו-מחט מהכלי. תרבית עובר זו מתאימה גם ליישומים מיקרוכירורגיים כמו קשירת פרוזדורים שמאלית, המתבצעת ביום הרביעי לדגירה.

ראשית, הכינו את הקשרים לשימוש בקוטר 0.5 מילימטר מ-10 תפרים כירורגיים אפס ניילון. בעזרת מלקחיים עדינים, הסר את הממברנות הכוריוניות וה-LAN מהעובר. הרם את העובר מהגב וסובב אותו אנכית כך שהצד השמאלי של העובר יהיה כעת למעלה ונגיש.

לאחר מכן, הסר את קרום הלב מעל האטריום השמאלי. יישר את הקשר מעל האטרי השמאלי והדק אותו על ידי אחיזה ומשיכה מהצדדים בעזרת מלקחיים יש לקשור את הקשר כך שימנע כ-75% מזרימת הדם המקורית לצד שמאל. חותכים את שולי הקשר במספריים מיקרו ומסירים בזהירות וזורקים תפרים עודפים.

לבסוף, סובב את העובר בחזרה לכיוון המקורי שלו כשהצד הימני למעלה. מוצגים כאן עוברים בשלבים שונים שתורבתו X ovo כפי שהודגם זה עתה מחמם זרימת מים יכול לשמור על התנאים הסביבתיים לזמן ממושך, מה שעשוי להידרש. במהלך הדמיה ויישומים מיקרו-כירורגיים.

עוברי האפרוח המתורבתים X ovo מתאימים למיקרו-הזרקה. בניסוי זה, הוזרק צבע פלואורסצנטי לכלי הדם של עובר אפרוח מתורבת X ovo. עוברי האפרוח שגודלו X ovo מתאימים למיקרו-כירורגיה.

בניסוי זה בוצע הליך קשירת פרוזדורים שמאלית על עובר אפרוח מתורבת X ביצית. לאחר השליטה בתרבית X ovo עוברי אפרוחים יכולים להיעשות תוך כחמש דקות לכל עובר. לאחר צפייה בסרטון זה, היא אמורה להבין היטב כיצד ליצור תרביות עוברי אפרוחים XO המתאימות ליישומי הדמיה ומיקרו-כירורגיה, והיכן יש צורך בהובלת תרביות.