בידוד של תאים אנדותל valvular
29 בדצמבר 2010
אנו מספקים שיטה בידוד אוכלוסיות culturing טהור של שסתום הלב תאים אנדותל (VEC). VEC יכול להיות מבודד צדי סף או העלעל ומיד הבאה, תא ביניים הבסיסית (ויק) בידוד היא פשוטה.
בפרוטוקול וידאו זה מוצגת בידוד של תאי אנדותל אינטרסטיציאליים תושבים ותאי אנדותל ספציפיים לצד ממסתם אאורטלי. עלה המסתם נגזר מהלב ומונח בתמיסת סלין קרה. ניתן להסיר את שכבת האנדותל משני צדדיו של העלה על ידי גירוד עדין של הרקמה כשהיא טבולה בתמיסת קולגנאז באמצעות מקל צמר גפן; לצורך בידוד ספציפי לצד, עלה המסתם מקובע על מצע פראפין כך שפני השטח של האנדותל חשופים.
לאחר מכן מוסיפים מספר טיפות של קולגנאז קר לעלה המסתם, ומדגריים את העלים למשך 5 עד 10 דקות. לאחר הדגירה עם הקולגנאז, מסירים את השכבה האנדותליאלית הספציפית לצד על ידי גזירה עדינה של הרקמה. בעזרת מקלון (swab), אוספים את התאים האנדותליאליים ששוחררו, שוטפים אותם וזורעים אותם בצלחות גידול.
לאחר מכן, העלים הנותרים מעוכלים למשך לילה כדי לבודד את התאים הבין-רקמתיים, אשר נאספים ונשטפים. כל התאים המבודדים נתרבים וניתן להשתמש בהם כדי להבין את תפקידם בתיקון ובמידול מחדש של מסתמי הלב בתגובה לאותות מכניים וביולוגיים מקומיים. שלום, שמי ראסל גולד.
אני נמצא כאן באוניברסיטת קורנל, במחלקה להנדסה ביו-רפואית, ועובד במעבדת בוצ'ר (Butcher lab). היום אראה לכם כיצד לבודד תאי אנדותל של מסתמי הלב. להשלכות של טכניקה זו יש השפעה על הבנת האופן שבו תאי אנדותל מקומיים מתקנים ומשחזרים את עצמם באופן קבוע בתגובה לאותים מכניים וביולוגיים.
אם כן, נתחיל. ראשית, השג חזיר מהשוחט המקומי ועבוד באופן אספטי כדי להוציא את שורש האורטה. שטוף היטב את שורש האורטה מדם.
באמצעות DPBS קר וסטרילי, חובה להסיר את כל רכיבי הדם בהקדם האפשרי כדי להגביל את מות התאים האנדותליאליים של המסתם (VEC) ואת הזיהום החיידקי. בשלב זה לא מומלץ להוסיף אנטיביוטיקה ותרופות אנטי-פטרייתיות, שכן הן עלולות להזיק לתאים. לאחר מכן, בודד ישירות מהשורש שלושה.
עלעות מסנן מכל שסתום. יש להיות שמרנים בעת בידוד העלה, שכן כל רקמה טבעתית תזהם את אוכלוסיית התאים. העבירו את העלעות המבודדות לפרועת קונית סטרילית של 15 milliliter הממולאת ב-12 milliliter של DPBS קר.
נערו מספר פעמים כדי להסיר שאריות ומלאו שוב ב-DPBS טרי. לבסוף, העבירו את עלוני המסתם בחזרה למעבדה על קרח. עם ההגעה למעבדה, הניחו את המיכל עם הרקמה תחת מנדף סטרילי והמשיכו בבידוד השכבה האנדותליאלית; עקרו באוטוקלאב את הפריטים הבאים במגש מכשירים מכוסה: פינצטות רקמה משוננות, מספרי רקמה ומקלונים מכותנה.
הכינו בנוסף תמיסת קולגנאז סטרילית, מצע אנדותליאל ומצע אינטרסטיציאלי, כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב המצורף. מלאו צלחת סטרילית בקוטר 35 מילימטר בשלושה מיליליטר של תמיסת קולגנאז קרה עבור כל מסתם, והעבירו את כל שלושת העליפים מהמבחנה בנפח 15 מיליליטר אל הצלחת.
דגרו את הרקמה במשך חמש עד 10 דקות ב-37 °C. לאחר מכן, הסירו בעדינות את השכבה האנדותלליאלית משני צדי העלבד על ידי סיבוב של מקלון סטרילי יבש על פני השטח. כיוון הסיבוב וכמות כוח הגזירה המופעלים הם קריטיים לטוהרת הדגימה.
סיבוב מקריץ הוון הוא בכיוון הפוך לתנועה הליניארית של היד המחזיקה את מקריץ הוון. פעולה זו יוצרת גזירה מבוקרת המרימה את התאי האנדותל מהרקמה. כמות הכוח המופעל מספיקה כדי להרגיש את התנגדות הרקמה, אך ללא חדירה לממברנה הבסיסית; טבל את מקריץ הוון מדי פעם בתוך תמיסת הקולגנאז כדי לשחרר את התאים מסיבי הקצה.
לאחר השלמת השפשוף, מרקם השכבה האנדותליאלית צריך להרגיש חלק מעט יותר מאשר קודם. אספו את התאים התלויים בתמיסת הקולגנאז והעבירו אותם לפקעת סטרילית חדשה של 15 ליטר. מיד לאחר שפשוף התאים האנדותליאליים מהעלונים, הניחו את העלונים בפקעת של 15 מיליליטר המכילה 10 מיליליטר של תמיסת קולגנאז לצורך בידוד תאים אינטרסטיציאליים.
סבבו את המבחנות בצנטריפוגה ב-1000 RPM למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לשקע תאים מבודדים, ושאבו את העל-נוזל. הוסיפו שלושה מיליליטר של מצע גידול לאנדותל למבחנות בנפח 15 מיליליטר. סבבו בצנטריפוגה פעם שנייה כפי שבוצע קודם לכן ושאבו את המצע.
סבב צנטריפוגציה שני זה מסייע בסינון חלק מהחומרים הבלתי רצויים, כגון סיבי קצה. השביו את תאי האנדותל מהצנטריפוגה בחמישה מיליליטר של endothelial medium והעבירו את התאים לבקבוק T 25 שצופה מראש בcollagen. השתמשו בבקבוק אחד לכל מבחנה של צנטריפוגה, והניחו לתאים לגדול לפחות יומיים עד שלושה ימים לפני החלפת ה-endothelial medium.
פעולה זו מסייעת לתאים להתאושש ולהתחלק. מכיוון שתהליך הבידוד הוא קשה למדי ותשוא התאים עלול להיות נמוך, קריטי לבצע מעבר תאים (passage) כאשר הם קרובים למצב של התכנסות (confluence). מאחר שעיכוב במגע (contact inhibition) עלול להוביל לטרנספורמציה של התאים, ניתן לבודד תאים אנדותליאליים גם מצד ספציפי.
כדי לעשות זאת, ראשית, הכין פטריית פטרי המכילה שכבת פאראפין. השתמש בכלי פטרי מזכוכית בקוטר 60 מילימטר עם נייר אלומיניום. חשב שני כלי זכוכית לכל עלון.
נייר האלומיניום מסייע בהסרת הפרפין לצורך שימוש חוזר בצלחת הפטרי. לאחר מכן, מלאו את הצלחות בחרוזי פרפין עד למחצית מנפחן וכסו אותן לצורך עיקור באוטוקלאב. עם סיום העיקור והמסת הפרפין, העבירו את מערך הצלחות למשטח שטוח וקריר.
ככל שהפראפין מתקרר, הוא מתקשה ויוצר שכבה שתתמוך בדקירות מחט. לאחר 60 דקות, ניתן להשתמש בכלי המעקר כדי לקבע את רקמת העלבד. הוצא את העלבדים שהבודדו מהמסתם מהמבחנות בנפח 15 מיליליטר והנח אותם על מצע הפראפין.
סדרו את העליקים כך שהצד הבלתירי (ventricular side) פונה כלפי מטה אל משטח הפרפין, והצד הפיברוטי נשאר חשוף. הצמידו את שולי העליק בעזרת סיכות כדי לחשוף את השכבה האנדותליאלית. לאחר מכן, הניחו מספר טיפות של קולגנאז קר על כל משטח אנדותלי הפונה כלפי מעלה והדרימו את הרקמה למשך 5 עד 10 דקות בטמפרטורה של 37 °C.
בסיום הדגירה, הסר בעדינות את השכבה האנדותליילית כפי שנעשה קודם לכן, על ידי סיבוב של מקל דגימה סטרילי ויבש על פני השטח של העלולית. מדי פעם, טבול את מקל הדגימה בתוך תמיסת הקולגנאז כדי לשחרר תאים מסיבי הקצה. לאחר סיום הדגימה, מרקמה של השכבה האנדותליילית צריכה להרגיש חלקה מעט יותר מבעבר.
אסוף את תרחיף התאים והעבר אותו לשפופרת סטרילית חדשה בנפח 15 מיליליטר. סמן על גבי התוויות את הספציפיות לצד; ניתן לאגד יחד רסיסי עלה מאותו שסתום. שטוף את השסתום המקובע באמצעות מספר טיפות של DPBS קר כדי לשטוף תאים נותרים או פסולת.
העבירו את העלעות לכלי תרבית חדש כך שהצד הוונטריקולרי יהיה חשוף, ואספו תאי אנדותל כפי שהודגם זה עתה. ברגע שפעולת השפשוף של תאי האנדותל מהעלה G הושלמה, העבירו מיד את העלעות למבחנה של 15 milliliter המכילה 10 milliliter של תמיסת קולגנאז. שטפו את התאים, השביו אותם למצב של סספנזיה וגדלו אותם כפי שהודגם עבור בידוד לא-ספציפי לצד של תאי האנדותל.
אם תפוקת התאים נמוכה מאוד, שקלו לעבור לבקבוק קטן יותר או להשתמש בלוחית בארות. מכיוון שהצמדות בין תאים מעודדת צמיחת תאים, זכרו לבצע מעבר תאים (passage) כאשר הם קרובים למצב של התמזגות (confluence). מכיוון שעכבה במגע (contact inhibition) עלולה להוביל לטרנספורמציה של התאים, התחילו את בידוד התאים הבין-רקמתיים תוך כדי סבב (centrifugation) של התאים האנדותליאליים; דגרו את המבחנות המכילות את העלונים למשך כ-12 עד 18 שעות.
בתוך תמיסת קולגנאז, תוך ערבוב עדין במידת הצורך. בתום תקופת האינקובציה, השתמשו בפיפטה סרולוגית כדי לערבב בעדינות את הרקמה שעברה עיכול עד שת сусפנסיות התאים יהיה הומוגני. הומוגניזציה זו מסייעת בפירוק הרקמה ובשחרור התאים הבין-רקמתיים; סבבו בצנטריפוגה ושטפו את התאים כפי שהודגם עבור התאים האנדותליאליים.
במקום להשתמש בחמישה מיליליטר של interstitial medium resus, השעו את תאי הביניים מהצנטריפוגה ב-15 מיליליטר של interstitial medium והעבירו את התאים לבקבוק T 75, תוך שימוש בבקבוק אחד עבור כל מבחנה של הצנטריפוגה. אפשרו לתאים לגדול במשך יום אחד עד יומיים לפחות לפני החלפת ה-interstitial medium; צפו לכמות גדולה יותר של שאריות רקמה מאשר עם תאי האנדותל. כמו כן, תאי הביניים מגיעים למצב של confluence מהר יותר מאשר תאי האנדותל מטבעם, והם מספקים תנובה גבוהה יותר של תאים בתמונות מייצגות אלו.
המורפולוגיה של תאי אנדותל שסתומתיים של V Cs מתורבדים לעומת תאי אינטרסטיציאליים שסתומתיים מוצגת לאחר יומיים עד שלושה. תאי ה-Becs מראים מורפולוגיה אנדותליאלית טיפוסית שבה התאים בעלי דפוס של ריצוף אבנים ומתחילים להיווצר לצבירים.
המורפולוגיה של VS.Exhibit דומה לזו של מיופיברובלסטים, שבה התאים הם בדרך כלל בעלי צורה של כישכור ומאוכלסים בצפיפות נמוכה כאשר הם גדלים עד להגעה לfluence, בעוד ש-ECS מראים מורפולוגיה אנדותליאלית טיפוסית שבה התאים הם בעלי תבנית של ריצוף אבנים והצמיחה שלהם מעכבת במגע. ה-VI CS מראים מורפולוגיה דומה למיופיברובלסטים, שבה התאים הם בדרך כלל בעלי צורה של כישכור ואינם מעכבים במגע. ניתן להסיק מאפיינים תפקודיים הן של VEC והן של VIC מהצביעה. עבור ספיגת LDL מסומן.
תאי VEC מאופיינים ברמות גבוהות של ספיגת acetylated LDL. בעוד שתאי VIC מאופיינים ברמות נמוכות של ספיגת acetylated LDL, סממנים תאיים של VEC ו-VIC מוצגים כאן. תאי ECS נצבעים בחיוביות לגורם von Willebrand factor בעוד ש-
אינם מראים צביעה לגורם von Willebrand. יתרה מכך, צביעת V CS שלילית לאקטין של שריר חלק אלפא, בעוד שצביעת V CS חיובית לאקטין של שריר חלק אלפא. ובכן, אני מקווה שלמדתם רבות מהבידודים שלנו היום.
עם זאת, חשוב לזכור שקרום הבסיס של התאי האנדותליאליים שברירי מאוד, וכל הפרעה למטריקס שמתחתיו משחררת לעיתים קרובות תאים מזוהמים משאר הרקמה. כדי לאשר בידוד מוצלח, אפיון הוא קריטי להערכת טהרת הבידודים שביצעתם. לכן, בהצלחה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה לבידוד ולתרבית של אוכלוסיות טהורות של תאי אנדותל ממסתמי הלב (VEC) ממסתמי אבי העורקים. הפרוטוקול כולל שלבים מפורטים לקציר של עלה המסתם ולבידוד שכבת האנדותל משני הצדדים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה של התא
- מחקר קרדיווסקולרי
- ביולוגיה של תאי אנדותל
רקע
- מסתמי הלב מכילים אוכלוסיות נפרדות של תאי אנדותל.
- בידוד תאים אלה הוא קריטי לחקר תפקודיהם הספציפיים.
- ייתכן ששיטות נוכחיות אינן מספקות אוכלוסיות טהורות של VEC.
- מחקר זה נועד לשפר את טכניקות הבידוד על מנת להשיג תוצאות מחקר טובות יותר.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה לבידוד VEC ממסממי לב אאורטליים.
- סיוע למחקרים עתידיים על תפקידו של VEC בבריאות קרדיווסקולרית.
- אספקת פרוטוקול שניתן לשחזור בקלות על ידי חוקרים אחרים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- קצירה של עלון המסתם מהלב.
- טבילה של הרקמה בתמיסת סלין קרה.
- שימוש בתמיסת קולגנאז להסרה עדינה של השכבה האנדותלליאלית.
- איסוף, שטיפה וזריעה של התאים האנדותלליים המבודדים.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של תאים אנדותליאליים ספציפיים לצד מהעלה של המסתם.
- הדגמה של פרוטוקול פשוט לבידוד VEC.
- פוטנציאל ליישומים נוספים במחקר קרדיווסקולרי.
- הבנה משופרת של הביולוגיה של מסתמי הלב.
מסקנות
- השיטה מספקת גישה מהימנה לבידוד VEC.
- היא יכולה לקדם מחקרים על תפקודי תאי אנדותל במסתמי לב.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על פרוטוקול זה עבור יישומים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך ניהולי
בידוד אמין של תאי אנדותל מסתמיים (VEC) טהורים הוא קריטי לאימות מטרות בשלבים מוקדמים של מחקר קרדיווסקולרי ולצמצום סיכונים מכניסטיים במחקר ופיתוח של תרופות ביולוגיות.&ד. פרוטוקול זה מאפשר יצירה של אוכלוסיות VEC המאומתות פנוטיפית וספציפיות לצד מסוים, ובכך תומך בביטחון חיזוי במידול מחלות ובפיתוח בדיקות (assays). השיטה נותנת מענה לצוואר בקבוק מרכזי בביסוס מערכות רלוונטיות למחלה עבור מחקר תרגומי וקידום של שלבים פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה&ד'
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של מסלולים ספציפיים ל-VEC המעורבים בתיכון ובמידול מחדש של מסתמי הלב.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי אספקת אוכלוסיות תאים טהורות ומאומתות פנוטיפית.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבחנה בין תרומת ה-VEC לתרומתם של תאים אינטרסטיציאליים.
- משפר את רמת הוודאות החזויה עבור מידול מחלות וסדר עדיפויות של מטרות בשלבים הבאים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק תרביות VEC שעברו תיקוף לצורך פיתוח בדיקות סטנדרטיות וסריקת תרכובות.
- מבטיח הדירות ותוצאה כמותית באמצעות אימות סממנים פנוטיפיים (PECAM1, vWF, ספיגת acetylated LDL).
- מאפשר סקילביליות ושימוש חוזר בפלטפורמה על ידי תמיכה בתהליכי בידוד ישירים ותהליכי בידוד ספציפיים לצד.
- מפחית משתנים מתערבים על ידי מזעור זיהומים מתאים לתאים שאינם אנדותליאליים.
מחקר טרנסלציונלי ופרה-קליני
- מבסס מערכות in vitro רלוונטיות למחלה לצורך מידול פתופיולוגיה של מסתמי הלב וגילוי סמנים ביולוגיים.
- תומך ברציפות משלב הגילוי המוקדם ועד לתיקוף פרה-קליני, על ידי מתן אפשרות לביצוע מחקרים פונקציונליים על אוכלוסיות טהורות של VEC.
- מסייע בקבלת החלטות מושכלות לגבי התקדמות מבוססת סיכונים, באמצעות אספקת מודלים תאיים חסונים למחקר תרגומי.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
פרוטוקול בידוד VEC זה מתאים לממשק שבין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר הפרה-קליני, ומאפשר ביצוע מחקרים מונחי-היפותזה ופיתוח בדיקות עבור אינדיקציות קרדיווסקולריות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי מנגנונים ספציפיים ל-VEC ובצמצום סיכונים ביולוגיים.
- סקר (Screening): מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור להערכת תרכובות במערכות VEC שעברו תיקוף.
- אנליטיקה: מספק אישור פנוטיפי מבוסס-סמנים ובדיקות תפקודיות (למשל, ספיגת LDL אצטילated) לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: עולה בקנה אחד עם גילוי סמנים ביולוגיים ומידול מחלות במחקר קרדיו-וסקולרי פרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע תהליך עבודה סטנדרטי וניתן לשימוש חוזר ליצירת אוכלוסיות טהורות של VEC ו-VIC בפרויקטים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתהליכי תיקוף של מטרות קרדיו-וסקולריות.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של תהליכי בידוד ותרבית תאים.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך הפרויקט (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי מתן אפשרות למודלים חסונים בשלבים מוקדמים.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של תוכניות גילוי בתחום הקרדיו-וסקולרי.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטכניקה סטרילית וטיפול ברקמות כדי לשמר את חיוניות התאים ואת טוהרם.
- נדרשת גישה למכשור ייעודי לעיכול אנזימטי, תרביות תאים ואימות פנוטיפי.
- נדרשת סטנדרטיזציה קפדנית בין הצוותים כדי להבטיח הדירות ולמזער זיהומים.
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמה עבור מינים שונים או סוגי שסתומים שונים, בהתאם למאפייני הרקמה.
- טיפול זהיר הוא חיוני כדי למנוע פגיעה בממברנה הבסיסית ולהבטיח בידוד VEC בדרגת טוהר גבוהה.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:13
Introduction
1:42
Isolation of Heart Valve Leaflets
8:03
Isolation of Interstitial Cells
5:22
Isolation of Side Specific Endothelial Layer
3:03
Isolation of Endothelial Layer
9:07
Isolation of Valvular Endothelial Cells Representative Images
10:30
Conclusion
