Name: בידוד של תאים אנדותל valvular (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: למדו לבודד תאים אנדותל מסוג valvular מעורקי הלב באמצעות קולגנאז וספוגי צמר גפן. פרוטוקול זה מאפשר בידוד ספציפי לצדדים השונים של עלי הלב ותומך במחקר ביולוגיית תאי אנדותל בלב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

מחקר זה נתמך על ידי פרס קריירה NSF, הקרן Hartwell, ואת איגוד הלב האמריקני (# 0830384N).

1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי במכשיר מכוסה מגש את הפריטים הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוננת מלקחיים רקמה - לטיפול ברקמת העלון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות מספריים (8 ס"מ) - לקבלת זמירה רקמות העלון cusps </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוגיות כותנה - בשביל לבודד את שכבת האנדותל מתוך העלון או סף </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון collagenase סטרילית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4.0 גרם של אבקת DMEM ל 250 מ"ל מים MΩ 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 1.11 גרם של סודיום ביקרבונט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף (600 U / mL) 180,000 יחידות של collagenase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1% (3mL) פניצילין / סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה-pH של התמיסה עד 7.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביא את הפתרון עד 270 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את הפתרון על ידי עובר דרך מסנן 0.2 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10% (30 מ"ל) של נסיוב סטרילי שור העובר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את תא סטרילי בינוני אנדותל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6.7 גרם של אבקת DMEM ל 400 מ"ל מים MΩ 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 1.85 גרם של סודיום ביקרבונט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף (50 U / mL) 25,000 יחידות של הפרין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1% (5 מ"ל) פניצילין / סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה-pH של התמיסה עד 7.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביא את הפתרון עד 450 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את הפתרון על ידי עובר דרך מסנן 0.2 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10% (50 מ"ל) של נסיוב סטרילי שור העובר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את תא סטרילי בינוני ביניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 13.37 גרם של אבקת DMEM ל 800 מ"ל מים MΩ 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3.7 גרם סודיום ביקרבונט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1% (10 מ"ל) פניצילין / סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה-pH של התמיסה עד 7.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביא את הפתרון עד 900 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את הפתרון על ידי עובר דרך מסנן 0.2 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10% (100 מ"ל) של בסרום שור סטרילית. </li></ol></li></ol> 2. בידוד של עלונים שסתום הלב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שורש והבלו אבי העורקים מיד בסביבה נקייה מחיידקים מהלב לאחר הקרבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות לשטוף את שורש האאורטה דם עם DPBS סטרילי קר. זה הכרחי להסיר את כל מרכיבי הדם מוקדם ככל האפשר להגביל את מותו VEC וזיהום חיידקי. אנטיביוטיקה antimycotics לא מומלץ בשלב זה, שכן הם מזיקים אל VEC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד עלונים שסתום (3 לכל שסתום) ישירות מן השורש ומכניסים צינורית סטרילית 15 מ"ל חרוטי מלא 12 DPBS קר מ"ל. לנער מספר פעמים כדי להסיר שאריות ולמלא עם DPBS טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחבורה בחזרה למעבדה על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהגיעם במעבדה, במקום מכולה עם הרקמה מתחת למכסה המנוע סטרילית. </li></ol> 3. בידוד של שכבת האנדותל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו צלחת 35mm סטרילי עם 3mL של פתרון collagenase קר לכל שסתום (3 כרוזים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את כל שלושת עלונים מהצינור 15 מ"ל לתוך צלחת מלאה הפתרון collagenase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הרקמה למשך 5-10 דקות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להסיר את שכבת האנדותל ידי סיבוב משטח סטרילי יבש על פני השטח של העלון. את כיוון הסיבוב ואת כמות להחיל גזירה היא קריטית עבור טוהר המדגם שלך. הסיבוב של ספוגית צריך להיות בכיוון ההפוך לתנועה קווית של היד שלך ליצור גזירה מבוקר. גזירה זה מה מרימה את לתאי אנדותל של הרקמה. כמות הכוח המופעל צריך להיות מספיק כדי להרגיש את ההתנגדות של הרקמה, אבל לא לחדור את הקרום במרתף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדי פעם, להספיג את ספוגית בתוך הפתרון collagenase כדי לסלק תאים הסיבים קצה. לאחר בניקוי תושלם, את המרקם של שכבת האנדותל צריך להרגיש קצת חלק יותר מאשר לפני כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את ההשעיה תא / collagenase והעברת צינור חדש 15 מ"ל סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות ב 1000 סל"ד במשך 5 דקות עד גלולה כל התאים מבודדים לשאוב supernatant. אם לבודד תאים ביניים וכן, לבצע את הפרוטוקול בעוד תאים אלה נמצאים centrifuged. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ"ל של מדיום חזירי האנדותל אל צינורות 15 מ"ל, צנטריפוגה בפעם השנייה, התקשורת לשאוב. זה צנטריפוגה second עוזר לסנן חלק מהחומר לא רצויות כגון סיבים קצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות לתאי אנדותל centrifuged ב 5 מ"ל של מדיום חזירי האנדותל צלחת התאים בבקבוק T-25 מראש מצופה קולגן (שימוש 1 בקבוק לכל צינור צנטריפוגות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו התאים לגדול לפחות 2-3 ימים לפני שינוי בינוני האנדותל. זה עוזר לתאים להתאושש מאז לחלק את תהליך הבידוד היא קשה למדי התשואה התא עלול להיות נמוך. זה קריטי לתאי המעבר ליד מפגש מאז עיכוב הקשר יכול להוביל שינוי התא. </li></ol> 4. הכנת תבשיל 60 מ"מ התרבות בידוד ספציפיות סייד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קו 60 מ"מ זכוכית פטרי מנות עם רדיד אלומיניום (2 כוס מנות לכל leafle t). רדיד אלומיניום מסייע להסיר את פרפין, כך צלחת פטרי מזכוכית ניתן לעשות שימוש חוזר עבור isolations אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום חרוזים פרפין בתוך המנות, כמחצית מלא, כיסוי מעוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מעוקר הוא מלא פרפין הוא נמס, להעביר את הרכב המנה על משטח שטוח מגניב. כמו פרפין מתקררת, להקשיח אותו רצון ליצור שכבה כי יתמוך דקירות מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות, צלחת מעוקרים יכולים לשמש חדר בידוד כדי לשתק את הרקמה העלון. </li></ol> 5. בידוד של שכבת האנדותל לוואי ספציפיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כרוזים מן הצינורות 15ml ומניחים על צלחת מוכן תרבות 60mm לבידוד ספציפי בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפעל את העלון כך שהצד ventricularis היא עם הפנים כלפי מטה על פני השטח פרפין עוזב את הצד fibrosa חשוף. הצמד את הקצוות של העלון כדי לחשוף את שכבת האנדותל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כמה טיפות של collagenase קר על פני השטח (הפונה כלפי מעלה) כל האנדותל דגירה הרקמה למשך 5-10 דקות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו בעבר, בעדינות להסיר את שכבת האנדותל ידי סיבוב משטח סטרילי יבש על פני השטח של העלון. את כיוון הסיבוב ואת כמות להחיל גזירה היא קריטית עבור טוהר המדגם שלך. הסיבוב של ספוגית צריך להיות בכיוון ההפוך לתנועה קווית של היד שלך ליצור גזירה מבוקר. גזירה זה מה מרימה את לתאי אנדותל של הרקמה ולא שום דבר אחר. כמות הכוח המופעל צריך להיות מספיק כדי להרגיש את ההתנגדות של הרקמה, אבל לא לחדור בתוך הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדי פעם, להספיג את ספוגית בתוך הפתרון collagenase כדי לסלק תאים הסיבים קצה. לאחר בניקוי תושלם, את המרקם של שכבת האנדותל צריך להרגיש קצת חלק יותר מאשר לפני כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את ההשעיה תא / collagenase והעברת צינור חדש 15 מ"ל סטרילי. ציין סגוליות צד על התווית (כרוזים מן שסתום אותו ניתן ונקווה יחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את העלונים לצלחת תרבות חדשה כך שהצד ventricularis נחשפת עכשיו וחזור על שלבים (5.3-5.6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השעיית כל תא / collagenase נאסף, צנטריפוגה צינורות ב 1000 סל"ד עבור 5minutes כדי גלולה כל התאים מבודדים לשאוב supernatant. אם לבודד תאים ביניים וכן, לבצע את הפרוטוקול בעוד תאים אלה נמצאים centrifuged. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ"ל של מדיום חזירי האנדותל אל הצינורות, צנטריפוגה בפעם השנייה, ואת לשאוב התקשורת. זה צנטריפוגה second עוזר לסנן חלק מהחומר לא רצויות כגון סיבים קצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות לתאי אנדותל centrifuged ב 5 מ"ל של מדיום חזירי האנדותל צלחת התאים בבקבוק T-25 מראש מצופה קולאז' (1 להשתמש בבקבוק לכל צינור צנטריפוגות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו התאים לגדול לפחות 2-3 ימים לפני שינוי בינוני האנדותל. זה עוזר לתאים להתאושש מאז לחלק את תהליך הבידוד הוא קשה למדי. אם אתה מבחין התשואה יהיה נמוך מאוד, שקול להעביר את בקבוקון קטן או צלחת יפה מאז תאים תאים הידבקות מקדם צמיחה התא. זכור המעבר ליד מפגש מאז עיכוב הקשר יכול להוביל שינוי התא. </li></ol> 6. בידוד של תאים ביניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו צנטריפוגה סטרילי 15 מ"ל עם שפופרת 10 מ"ל של תמיסת collagenase לכל שסתום (3 כרוזים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפת כרוזים בתאי האנדותל, מיד למקם אותם בצינור 15 מ"ל מתאים עם פתרון collagenase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של כ -12 עד 18 שעות (להתסיס בעדינות אם רוצים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות את הרקמה מושפל עם טפטפת סרולוגיות עד ההשעיה תא / collagenase הופך הומוגני. Homogenization זה עוזר לשבור את הרקמות ולשחרר את התאים ביניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה רקמת מתעכל במשך 5 דקות ב 1000 סל"ד ו לשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ"ל בינוני ביניים חזירי את צינורות 15 מ"ל, צנטריפוגה בפעם השנייה, ואת לשאוב supernate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות לתאי אנדותל centrifuged ב 5 מ"ל של מדיום חזירי ביניים צלחת התאים T-75 צפחת (1 להשתמש בבקבוק לכל צינור צנטריפוגות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו התאים לגדול לפחות 1-2 ימים לפני שינוי המדיום הסלולרי ביניים. יהיו פסולת רקמות הרבה יותר מאשר עם לתאי אנדותל, אך זה צפוי. התאים צריכים גם לגדול מהר יותר מאשר מפגש בתאי האנדותל בגלל התשואה התא הטבע שלהם. </li></ol> 7. נציג תמונות <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. מורפולוגיה של תאים מבודדים בבידוד בבית 2-3 ימים הדואר. (א) VEC מפגינים מורפולוגיה אנדותל טיפוסי הטופס אשכולות כדי לקדם צמיחה. (ב) ויק מורפולוגיה דומה myofibroblasts אשר בדרך כלל ציר בצורת להתפשט באופן שווה על פני הבקבוק. class = "jove_content"&gt; <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. מורפולוגיה של תאים מבודדים בבית confluency. (א) VEC מפגינים מורפולוגיה אופיינית האנדותל אשר בדרך כלל המרוצף וקשר צמיחה עכבות. (ב) ויק מורפולוגיה דומה myofibroblasts אשר בדרך כלל בצורת כישור ולא לפנות צמיחה עכבות. <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. המאפיינים פונקציה של תאים מבודדים 6. (א) VEC קשורים עם רמות גבוהות של LDL ספיגת acetylated (אדום). (ב) ויק קשורים עם רמות נמוכות של LDL ספיגת acetylated. <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. סמנים נייד של תאים מבודדים 6. (א) פנוטיפ VEC הוא תרם מכתים חיובית פון Willebrand Factor (ירוק), כחול (גרעינים). (ב) פנוטיפ ויק הוא תרם מכתים שלילי גורם Willebrand פון. <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5. סמנים נייד של תאים בודדים. (א) פנוטיפ VEC הוא תרם מכתים שלילי אלפא SMA (ירוק), כחול (גרעינים). (ב) פנוטיפ ויק הוא תרם מכתים חיובית SMA אלפא. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> דיסוציאציה Agent </td><td> דיסוציאציה טכניקה </td><td> תא אוסף </td><td> Cell כמות </td><td> תא טוהר </td><td> זיהום </td></tr><tr><td> EDTA (3mm) ללא CaCl 2 </td><td> 5, 20, 60 דקות. לפני CaCl 2 בנוסף </td><td> 20, 60, 120 דקות. לפני איסוף </td><td> - </td><td> + / - </td><td> + + + </td></tr><tr><td> EDTA (6 מ"מ) ללא CaCl 2 </td><td> 5, 20, 60 דקות. לפני CaCl 2 בנוסף </td><td> 20, 60, 120 דקות. לפני איסוף </td><td> + / - </td><td> + </td><td> + + + </td></tr><tr><td> טריפסין-EDTA (0.5 g / L) </td><td> 5, 10, 15 דקות. לפני שחרור משרות </td><td> בינוני נאסף מיד </td><td> + </td><td> + </td><td> + + </td></tr><tr><td> Collagenase II (300 U / mL) </td><td> 5, 10, 15 דקות. לפני שחרור משרות </td><td> בינוני נאסף מיד </td><td> - + + + </td><td> - + +, + </td><td> + </td></tr><tr><td> Collagenase II (600 U / mL) </td><td> 5, 10, 15 דקות. לפני שחרור משרות </td><td> בינוני נאסף מיד </td><td> + + +, + + + </td><td> + +, + +, - </td><td> - </td></tr></tbody></table> טבלה 1. תוצאות ראשוניות של פרוטוקולים valvular בידוד תא האנדותל.

<ol><li>Thompson, R. P., Fitzharris, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+truncus+arteriosus+of+the+chick+embryo+heart%3A+the+formation+and+migration+of+mesenchymal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the truncus arteriosus of the chick embryo heart: the formation and migration of mesenchymal tissue.</a> Am J Anat. 154, 545-556 (1979).</li>
<li>Johnson, C. M., Fass, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+cardiac+valvular+endothelial+cells+in+culture%3A+A+relative+deficiency+of+fibronectin+synthesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Porcine cardiac valvular endothelial cells in culture: A relative deficiency of fibronectin synthesis in vitro.</a> Lab Invest. 49 (5), 589-598 (1983).</li>
<li>Manduteanu, I., Popov, D., Radu, A., Simionescu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calf+cardiac+valvular+endothelial+cells+in+culture%3A+production+of+glycosaminoglycans%2C+prostacyclin+and+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Calf cardiac valvular endothelial cells in culture: production of glycosaminoglycans, prostacyclin and fibronectin.</a> J Mol Cell Cardiol. 20 (2), 103-118 (1988).</li>
<li>Cheunyg, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+isolating+and+purifying+porcine+aortic+valve+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JHVD%22%5BJournal%5D)">Techniques for isolating and purifying porcine aortic valve endothelial cells.</a> JHVD. 17 (6), 674-681 (2008).</li>
<li>Paranya, G., Vineberg, S., Dvorin, E., Kaushal, S., Roth, S. J., Rabkin, E., Schoen, F. J., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+valve+endothelial+cells+undergo+transforming+growth+factor-beta-mediated+and+non-transforming+growth+factor-beta-mediated+transdifferentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro.</a> Am J Pathol. 159 (4), 1335-1343 (2001).</li>
<li>Butcher, J. T., Penrod, A., Garcia, A. J. M., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+morphology+and+focal+adhesion+development+of+valvular+endothelial+cells+in+static+and+fluid+flow+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Bio%22%5BJournal%5D)">Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments.</a> Arterioscler Thromb Vasc Bio. 24 (1), 1429-1434 (2004).</li>
<li>Simmons, C. A., Grant, G. R., Manduchi, E., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+heterogeneity+of+endothelial+phenotypes+correlates+with+side-specific+vulnerability+to+calcification+in+normal+porcine+aortic+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial heterogeneity of endothelial phenotypes correlates with side-specific vulnerability to calcification in normal porcine aortic valves.</a> Circ Res. 96, 792-799 (2005).</li>
<li>Butcher, J. T., Tressel, S., Johnson, T., Turner, D., Sorescu, G., Jo, H., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Profiles+of+Valvular+and+Vascular+Endothelial+Cells+Reveal+Phenotypic+Differences%3A+Influence+of+Shear+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Profiles of Valvular and Vascular Endothelial Cells Reveal Phenotypic Differences: Influence of Shear Stress.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 69-69 (2006).</li>
<li>Parachuri, S., Yang, J. H., Aikawa, E., Melero-Martin, J. M., Khan, Z. A., Loukogeorgakis, S., Schoen, F. J., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Pulmonary+Valve+Progenitor+Cells+Exhibit+Endothelial%2FMesenchymal+Plasticity+in+Response+to+Vascular+Endothelial+Growth+Factor-A+and+Transforming+Growth+Factor-%CE%B22%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Human Pulmonary Valve Progenitor Cells Exhibit Endothelial/Mesenchymal Plasticity in Response to Vascular Endothelial Growth Factor-A and Transforming Growth Factor-β2.</a> Circ Res. 99 (8), 861-869 (2006).</li>
<li>Shi, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+circulating+bone+marrow-derived+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells.</a> Blood. 92, 362-367 (1998).</li>
<li>Rehman, J., Li, J., Orschell, C. M., March, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+endothelial+progenitor+cells+are+derived+from+monocyte%2Fmacrophages+and+secrete+angiogenic+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood endothelial progenitor cells are derived from monocyte/macrophages and secrete angiogenic growth factors.</a> Circulation. 107, 1164-1169 (2003).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הבנה של הביולוגיה valvular נפגעה על ידי קשיים טכניים בידוד אוכלוסיות culturing טהור של בתאי האנדותל valvular. טכניקות בידוד אופייניים לערב עיכול אנזימטי של מטריקס הבסיס הבסיסי או כימי דיסוציאציה של אג&quot;ח דבק אנדותל 2,3. ניסויים ראשוניים בידוד איכותית הוערכו על ידי סוכנים שונים דיסוציאציה תקופות הדגירה. תוצאות ניסויים אלה הראו כי EDTA (או טריפסין-EDTA) הדגירה של עד 60 דקות הצליח בכל התאים פירוק. עם זאת, מערכת העיכול collagense למשך 5-10 דקות הוכיחה את יעילותה לאחזור ...

<table><tbody><tr><td>מצעג'י של דולבקו (Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium)</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>50-103-PB</td><td></td></tr><tr><td>סרום עוברי בקר (Fetal Bovine Serum)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומייצין (Penicillin Streptomycin)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>מלח נתרן של הפרין (Heparin Sodium Salt)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784-1G</td><td></td></tr><tr><td>קולגנז Type 2</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21300-058</td><td></td></tr><tr><td>קולגן מזנב חולדה (Rat Tail Collagen)</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>מטבונים סטריליים (Critical Swabs)</td><td>VWR international</td><td>89031-270</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט (Sodium Bicarbonate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>55761</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקי T25</td><td>BD Biosciences</td><td>353018</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקי T75</td><td>BD Biosciences</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>פלטה בעלת 24 בארות</td><td>Falcon BD</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 60x15 mm</td><td>VWR international</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>צלחות זכוכית 60x15</td><td>VWR international</td><td>89000-310</td><td></td></tr><tr><td>שעוות פאראפין לטמיעה (Paraffin Embedding Wax)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19304-01</td><td></td></tr><tr><td>מחטים מסוג Precision Glide</td><td>BD Biosciences</td><td>305165</td><td></td></tr><tr><td>מסנני Nalgene בנפח 500 mL</td><td>VWR international</td><td>73520-985</td><td></td></tr><tr><td>מסנני Nalgene בנפח 1L</td><td>VWR international</td><td>73520-986</td><td></td></tr><tr><td>פינצט לרקמות</td><td>Fine Science Tools</td><td>11023-15</td><td></td></tr><tr><td>פינצט FSC מס' 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-00</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של תאים אנדותל valvular

Isolation of Valvular Endothelial Cells

שסתומי הלב הוא האחראי הבלעדי לשמירה על זרימת דם חד כיווני דרך מערכת הלב וכלי הדם. דקים אלה, סיבי רקמות חשופים מדגיש מכני משמעותי כפי שהם לפתוח ולסגור כמה מיליארדי פעמים על תוחלת חיים. סיבולת מדהימה של רקמות אלה נובע valvular התושב האנדותל (VEC) ותאי ביניים (ויק), כי כל הזמן לתקן לשפץ בתגובה לאותות מכני ביולוגי המקומית. רק לאחרונה התחלנו להבין את התנהגות ייחודית של תאים אלה, אשר בניסויים במבחנה יש תפקיד מפתח. מאתגר במיוחד הוא בידוד תרבות VEC. טיפול מיוחד יש להשתמש מרגע רקמה יוסר המארח באמצעות ציפוי הסופי. כאן אנו מציגים פרוטוקולים בידוד ישיר, בידוד צד מסוים, תרבות, ואימות של אוכלוסיות טהורות של VEC. אנו משתמשים עיכול אנזימטי ואחריו טכניקה גירוד עדין ספוגית כדי לסלק משטח תאים בלבד. תאים אלו נאספים אז לתוך צינור ו centrifuged לתוך גלולה. גלולה היא resuspended אז מצופה לתוך צלוחיות תרבות טרום מצופה מטריצה ​​אני קולגן. פנוטיפ VEC הוא אושר על ידי מגע עכבות הצמיחה ביטוי של סמנים ספציפיים כגון PECAM1 האנדותל (CD31), פון Willebrand Factor (vWF), ואת הביטוי השלילי של אקטין אלפא שריר חלק (α-SMA). המאפיינים של פונקציונלי VEC קשורים עם רמות גבוהות של LDL acetylated. בניגוד לתאי אנדותל כלי הדם, VEC יש יכולת ייחודית להפוך mesenchyme, אשר בדרך כלל מתרחשת במהלך היווצרות שסתום עובריים 1. זה יכול להתרחש גם במהלך ומחוברות משמעותית לפרסם ממושך בתרבות חוץ גופית, ולכן הטיפול צריך להיעשות כדי המעבר ליד או מפגש. לאחר בידוד VEC, אוכלוסיות טהור של ויק אז יכול להיות נרכש בקלות.

אנו מספקים שיטה בידוד אוכלוסיות culturing טהור של שסתום הלב תאים אנדותל (VEC). VEC יכול להיות מבודד צדי סף או העלעל ומיד הבאה, תא ביניים הבסיסית (ויק) בידוד היא פשוטה.

מסתמי הלב הם האחראים הבלעדיים לשמירה על זרימת דם חד-כיוונית במערכת קרדיווסקולרית. רקמות סיביות דקות אלו הן...

בפרוטוקול וידאו זה מוצגת בידוד של תאי אנדותל אינטרסטיציאליים תושבים ותאי אנדותל ספציפיים לצד ממסתם אאורטלי. עלה המסתם נגזר מהלב ומונח בתמיסת סלין קרה. ניתן להסיר את שכבת האנדותל משני צדדיו של העלה על ידי גירוד עדין של הרקמה כשהיא טבולה בתמיסת קולגנאז באמצעות מקל צמר גפן; לצורך בידוד ספציפי לצד, עלה המסתם מקובע על מצע פראפין כך שפני השטח של האנדותל חשופים.לאחר מכן מוסיפים מספר טיפות של קולגנאז קר לעלה המסתם, ומדגריים את העלים למשך 5 עד 10 דקות. לאחר הדגירה עם הקולגנאז, מסירים את השכבה האנדותליאלית הספציפית לצד על ידי גזירה עדינה של הרקמה. בעזרת מקלון (swab), אוספים את התאים האנדותליאליים ששוחררו, שוטפים אותם וזורעים אותם בצלחות גידול.לאחר מכן, העלים הנותרים מעוכלים למשך לילה כדי לבודד את התאים הבין-רקמתיים, אשר נאספים ונשטפים. כל התאים המבודדים נתרבים וניתן להשתמש בהם כדי להבין את תפקידם בתיקון ובמידול מחדש של מסתמי הלב בתגובה לאותות מכניים וביולוגיים מקומיים. שלום, שמי ראסל גולד.אני נמצא כאן באוניברסיטת קורנל, במחלקה להנדסה ביו-רפואית, ועובד במעבדת בוצ'ר (Butcher lab). היום אראה לכם כיצד לבודד תאי אנדותל של מסתמי הלב. להשלכות של טכניקה זו יש השפעה על הבנת האופן שבו תאי אנדותל מקומיים מתקנים ומשחזרים את עצמם באופן קבוע בתגובה לאותים מכניים וביולוגיים.אם כן, נתחיל. ראשית, השג חזיר מה

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

זה פרוטוקול וידאו ממחישה את הבידוד של התרבות האנושית וריד הטבור בתאי האנדותל (HUVEC) מ חבל הטבור האדם. לאחר מבודד את התאים האלה יכול לשמש ב מבחני חוץ גופית אנגיוגנזה כמו Assay אופטימליים הפיברין ביד ג'ל הוכיח גם על ידי המעבדה יוז.

בידוד של האדם תאים עורק טבורי האנדותל (HUVEC)

בסרטון זה, אנו מדגימים את הבידוד של תאים אינטרסטיציאליים של מסתם אבי העורקים מליבו של עכבר בוגר באמצעות הליך קולגנאז דו-שלבי והתרבית הבאה שלהם בנפח נמוך של מצעי גדילה.

בידוד תאי אינטרסטיציאל של שסתום עכבר: שיטה אנזימטית לבידוד ותרבית VICs ממסתם אבי העורקים של העכבר

תרבית תאים העיקרית היא טכניקה שימושית לניתוח אוכלוסיות מסוימות של תאים, במיוחד מעוברי עכבר מהונדסים בשלבי התפתחות ספציפיים. בזאת, חדרי לב עובריים הם גזורים וניתקו, וחרוזים נוגדנים מצומדות לזהות ולהפריד את תאי האנדותל לניתוח נוסף.

בידוד של תאי האנדותל חדרית עובריים

היכולת לבודד תאי אנדותל של מסתמי הלב (VECs) היא קריטית להבנת מנגנוני התפתחות, תחזוקה ומחלות של מסתמים.  כאן אנו מתארים את הבידוד של VECs מעכברי Tie2-GFP עובריים ובוגרים באמצעות FACS שיאפשר מחקרים הקובעים את תרומתם של VECs בתהליכי התפתחות ומחלות.

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

פרוטוקול זה מוכן לחלוק את השיטה שלנו לבידוד תאי אנדותל כליליים של עכברים לצורך הדמיה או לביצוע ניסויים ביולוגיים מולקולריים.

בידוד של תאי האנדותל העכבר כלילי

אנו מציגים פרוטוקול עבור בידוד של אנדוקקרודיאל ותאי הכליליים כלילית מלבבות חולדה באמצעות עיכול הרקמה הסדרתית במאגר העיכול, איסוף תא מחזורי צנטריפוגה חוזרים, וטיהור תאים באמצעות anti-rat CD31 microbeads.

בידוד של תאי כלילית ותאים כליליים מהקיר החופשי של לב החולדה

מאמר זה מתאר את הבידוד של תאי שסתום אבי העורקים עכבר על ידי הליך collagenase דו שלבי. תאי שסתום עכבר מבודדים חשובים לביצוע מבדקים שונים, כגון בדיקה זו של הסתיידות במבחנה, ולחקירת המסלולים המולקולריים המובילים מינרליזציה שסתום אבי העורקים.

בידוד של תאי שסתום ביניים עכבר ללמוד את הסתיידות של שסתום אבי העורקים במבחנה

פרוטוקול זה מתאר את איסוף המסתמים האאורטליים האנושיים המופקים במהלך הליכים כירורגיים להחלפת מסתם אבי העורקים או מרקמה קדבורית, ואת הבידוד, ההרחבה והאפיון שלאחר מכן של תאי אנדותל ותאי אינטרסטיציאליים ספציפיים למטופל. כלולים פרטים חשובים לגבי התהליכים הדרושים כדי להבטיח את הכדאיות של התא ואת הספציפיות הפנוטיפית.

בידוד תאי שסתום ראשוניים אנושיים למידול מחלות חוץ גופיות

אנו מציגים שיטה לבידוד תאי אנדותל וגרעינים מלומן של עורקי הצוואר של עכברים החשופים לתנאי זרימה יציבים או מופרעים כדי לבצע ניסויים באומיקה חד-תאית.

בידוד תאי אנדותל מהלומן של עורקי הצוואר של עכברים לניסויים רב-תאיים חד-תאיים

למרות שהוא מאתגר, הבידוד של תאי אנדותל ריאתיים חיוני למחקרים על דלקת ריאות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך לבידוד בעל תפוקה גבוהה וטוהר גבוה של תאי אנדותל מקרו-וסקולריים ומיקרו-וסקולריים.

בידוד וטיהור תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ומקרו-וסקולריים מדגימות שמקורן בריאה

מאמר זה מתאר שיטה לבידוד מבוסס חרוזים מגנטיים של תאי אנדותל מורין מנימי לימפה עוריים. תאי האנדותל הלימפטיים המבודדים יכולים לשמש לניסויים במבחנה במורד הזרם ולניתוח ביטוי חלבונים.

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

למדו לבודד תאים אנדותל מסוג valvular מעורקי הלב באמצעות קולגנאז וספוגי צמר גפן. פרוטוקול זה מאפשר בידוד ספציפי לצדדים השונים של עלי הלב ותומך במחקר ביולוגיית תאי אנדותל בלב.

בידוד של תאים אנדותל valvular

גלה סרטונים נוספים