Name: הכנת Immunogen עכבר יותרת המוח עבור אינדוקציה של Hypophysitis אוטואימונית ניסויית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: למדו הכנת חלבוני בלוטת יותרת המוח בעכברים לחקר היפופיזיטיס אוטואימונית. הפרוטוקול כולל בידוד, הומוגניזציה וסרכוז חלבונים ליצירת מודל מחלה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענק DK080351 למחשב.

ניסיוני פרוטוקול הצעד הראשון פרוטוקול הניסוי הזה היא לאסוף מספר גדול של בלוטות יותרת המוח העכבר. הצעד השני הוא homogenize בלוטות להכין תמצית חלבון. הצעד השלישי הוא emulsify החלבונים האלה בתערובת שמנוני. שלב 1: איסוף ואחסון של העכבר בלוטות יותרת המוח בלוטת יותרת המוח העכבר יושב בבסיס הגולגולת בשקע של העצם יתדי שנקרא יושבת הבלוטה סלע, ​​מוקף רוחבית על ידי העצבים trigeminal ו anteriorly ידי התצלובת הראייה. בלוטה מורכבת של האונה הקדמית גדול האונות האחורי ביניים קטנות יותר, ומשקלו על 1.9 מ&quot;ג בממוצע. בלוטות יותרת המוח נאספים מעכברים של זנים, מינים מעורבים, הגילאים, נועד להיות מורדמים באמצעות מתקן טיפול בבעלי חיים. כדי לבודד את בלוטת יותרת המוח, העכבר הוא מורדמים, העור מעל הגולגולת גזור, ואת עצם הגולגולת לחתוך לפתוח במספריים. המוח הוא הרים לחשוף את בלוטת יותרת המוח, אשר מבודדת אז מן מאטר הדורה שמסביב, הנדלה העצם יתדי ומאוחסנים צינור פלסטיק על קרח יבש. בדרך כלל אנו משתמשים 300 בלוטות יותרת המוח עכבר להכנת חלבון אחד, מספר כי ניתן לאסוף על ידי אדם אחד ב 9 שעות. לאחר איסוף הושלמה, שפופרת המכילה את בלוטות יותרת המוח מאוחסן ב -80 ° C עד מוכן לשלב הבא. שלב 2. הפקת עכבר יותרת המוח חלבונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את החיץ homogenization לצינור פלקון 15 מ&quot;ל (קטלוג לא 352,059) שמר באמבט קרח, באמצעות 250 μL של המאגר על כל 100 בלוטות יותרת המוח שנאספו. השתמש חיץ של חוזק היוני דומה לזו שקיימת פיזיולוגית בתוך הציטופלסמה של התא (0.2 מ &#39;) של ה-pH פיזיולוגי (7.4). אנו משתמשים פוספט שנאגרו מלוחים (0.161 M, pH 7.4), בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז (סיגמא אולדריץ, קטלוג לא P8340-1ML). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את בלוטות יותרת המוח למאגר רק לפני homogenization, ולאחר מכן למקם את מחולל (5 מ&quot;מ קוטר) של homogenizer Polytron בתחתית הצינור פלקון. Homogenize בסל&quot;ד מרבי למשך 30 שניות, בעדינות להזיז את הצינור פלקון למעלה ולמטה תוך שמירה על אותה באמבט קרח. לאחר מכן, שאר homogenate על קרח דק 1. חזור על homogenization וקירור צעדים עוד פעמיים. זה homogenization עדין צריך לשבור את התאים לשחרר חלבונים cytosolic מבלי לשבש את הגרעינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר, גרעינים שלמים רקמות וחומרים מסיסים (כגון רקמת החיבור ואת קומפלקסים חלבונים מפוגל), בצנטריפוגה homogenate במהירות נמוכה (1000g) במשך 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את supernatant (נקרא כעת פוסט גרעיני Supernatant, PNS) לצינור פלקון חדש, מקפיד להשאיר גלולה באין מפריע, ולאחסן את PNS על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה בהיקף המקורי של חיץ homogenization (250 μL של המאגר על כל 100 בלוטות יותרת המוח שנאספו), homogenize לעיל, צנטריפוגה לעיל, ולאחר מכן לשלב את PNS השני עם הראשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot שני PNS אספו דגימות לתוך צינורות microcentrifuge ולאחסן ב -80 ° C עד מוכן לשלב הבא. הכנה זה החלבון ניתן לאחסן -80 ° C אבל לאט לאט מאבד את העוצמה שלה, לכן אנו ממליצים להשתמש בו בתוך 6 חודשים מיום ההכנה. השתמש aliquot קטן כדי לקבוע את התשואה חלבון ריכוז ידי assay BCA (קטלוג פירס לא. 23,225), ואת איכות החלבון על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה. באופן כללי, אנו מקבלים על 60 מ&quot;ג של חלבון מן 300 מ&quot;ל יותרת המוח העכבר של 1.5 חיץ homogenization, בריכוז סביב 40 ​​מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li></ol> שלב 3. הכנת התחליב עבור חיסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי במהירות aliquots חלבון קפוא הדרושים לניסוי ולהתאים את ריכוז החלבון עד 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל. תמצית חלבון זה יהיה emulsified 01:01 עם adjuvant השלם של פרוינד (CFA, Sigma-F-5881) המכיל 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של חום הרג Mycobacterium tuberculosis (בקטון דיקינסון, 231,141). עכבר יקבל 1 מ&quot;ג של תמצית יותרת μL 100 של אמולסיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדוגמה שניתנה כאן היא מחסנת 10 עכברים, שבו כל העכבר יהיה הזריקו μL 100 של תחליב המכיל 1 מ&quot;ג של חלבונים יותרת המוח. אפשר שני עכברים נוסף עבור אובדן חומר במהלך תקופת ההכנה, כדי להשתמש 12 מ&quot;ג של חלבונים יותרת המוח. Aspire 600 μL של לחלץ את מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​20 חלבון יותרת המוח לתאר לעיל באמצעות מזרק 2.5 מ&quot;ל המילטון gastight. Resuspend CFA ידי רועדות, שואפים 600 μL של CFA לתוך מזרק נוסף המילטון 2.5 מ&quot;ל. צרף ומאובטח 22-מד מיקרו emulsifying מחט המזרק מלא CFA. לאט לאט לדחוף את הבוכנה של המזרק CFA כך את המחט מלא CFA, אז לצרף ו לאבטח את הקצה השני שלהמחט במזרק מלא לחלץ יותרת המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט לקדם את הבוכנה של המזרק CFA לדחוף את מרכיב שמן לתוך לחלץ את acqueous יותרת המוח, כך רק כמות קטנה מעורבת. ואז להדוף את הבוכנה של המזרק לחלץ יותרת המוח לתוך המזרק CFA. חזור על פעולה זו בהדרגה את כמות החומר מעורבת. המשך עד התוכן של שני מזרקים מעורבבים. תוכלו לקבל פתרון לבנבן ומופץ באופן שווה המייצג את תחליב מים בתוך שמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שנוצר תחליב, לחזור על תנועה אחורה-and-הלאה לפחות 500 פעמים על מנת להבטיח את האמולסיה הוא מעורב באופן יסודי. לאחר מחזור הערבוב הסופי, 01:01 מים ב-תחליב שמן מוכן לשימוש מכיל ריכוז חלבון יותרת המוח של 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל. התחליב יהיה להזריק באותו יום תת עורי לעכברים SJL הרדים, כמפורט במאמר יופיטר לוויה. </li></ol>

<ol><li>Caturegli, P., Newschaffer, C., Olivi, A., Pomper, M. G., Burger, P. C., Rose, N. R. Autoimmune Hypophysitis Endocr Rev. 26, 599-614 (2005).</li>
<li>Blansfield, J. A., Beck, K. E., Tran, K., Yang, J. C., Hughes, M. S., Kammula, U. S., Royal, R. E., Topalian, S. L., Haworth, L. R., Levy, C., Rosenberg, S. A., Sherry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T-lymphocyte-associated+antigen-4+blockage+can+induce+autoimmune+hypophysitis+in+patients+with+metastatic+melanoma+and+renal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4 blockage can induce autoimmune hypophysitis in patients with metastatic melanoma and renal cancer.</a> J Immunother. 28, 593-598 (2005).</li>
<li>Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+Hypophysitis+of+SJL+mice%3A+Clinical+Insights+from+a+New+Animal+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model.</a> Endocrinology. 149, 3461-3469 (2008).</li>
<li>Goudie, R. B., Pinkerton, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+hypophysitis+and+Hashimoto%27s+disease+in+a+woman%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Anterior hypophysitis and Hashimoto's disease in a woman.</a> J Pathol Bacteriol. 83, 584-585 (1962).</li>
<li>Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+hypophysitis%3A+an+underestimated+disease+in+search+of+its+autoantigen%28s%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s).</a> J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

למרות העובדה כי החולה הראשון עם hypophysitis אוטואימוניות דווחה בשנת 1962 4, autoantigens פתוגניים יותרת המוח נשארים להיות מזוהה 5. במודלים של בעלי חיים יכול להיות מאוד שימושי כדי לזהות אלה autoantigens, בסיוע גילוי סמנים כי הם לתרגום על הטיפול בחולה. מאמר זה הוכיח הליך פשוט להכנת חלבונים יותרת המוח בצורה שהיא מתאימה גרימת hypophysitis אוטואימוניות בחיות מעבדה.

<table><tbody><tr><td>מבחנות פאלקון בנפח 15-ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>בופר הומוגניזציה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סליין בבופר פוספט (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תערובת מעכבי פרוטאז</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>הומוגנייזר Polytron</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת BCA assay</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>עזר דלקתי מלא של פרוינד (CFA) &amp;rsquo;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-5881</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis</td><td>BD Biosciences</td><td>231141</td><td></td></tr><tr><td>מזרק Hamilton gastight בנפח 2.5 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחט מיקרו-אמולסיה בכיול 22-gauge</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הכנת immunogen עכבר יותרת המוח עבור אינדוקציה של hypophysitis אוטואימונית ניסויית

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Hypophysitis אוטואימונית היא דלקת כרונית של בלוטת יותרת המוח הנגרמת או מלווה אוטואימוניות 1. זה באופן מסורתי נחשב מחלה נדירה אך דיווח גדל במידה ניכרת בשנים האחרונות. Hypophysitis, למעשה, מפתחת לא יוצאת דופן כמו &quot;תופעת לוואי&quot; אצל חולי סרטן שטופלו עם נוגדנים החוסמים קולטנים מעכבות הביע על לימפוציטים מסוג T, כגון CTLA-4 2 ו PD-1 קולטנים. Hypophysitis אוטואימונית יכול להיגרם על ידי הזרקת בניסוי בעכברים עם חלבונים יותרת המוח מעורב עם 3 adjuvant. במאמר זה וידאו אנחנו מדגימים כיצד לחלץ חלבונים מן העכבר בלוטות יותרת המוח ואיך להכין אותם בצורה מתאימה גרימת hypophysitis אוטואימוניות בעכברים SJL.

Hypophysitis אוטואימוניות ניתן לשחזר בעכברים באמצעות הזרקת תמצית של חלבונים עכבר יותרת המוח.

הכנת Immunogen עכבר יותרת המוח עבור אינדוקציה של Hypophysitis אוטואימונית ניסויית

היפופיזיטיס אוטואימונית היא דלקת כרונית של בלוטת היפופיזה שנגרמת על ידי או מלווה באוטואימוניות1. באופן מסורתי היא נחשבה ל...

היפופיזיטיס אוטואימונית מאופיינת בהגדלה של בלוטת יותרת המוח ובחסור בהורמון אחד או יותר מבלוטה זו. האוטו-אנטיגנים הגורמים למחלה נותרו לא ידועים. כאן מוצג פרוטוקול להכנת חלבונים מבלוטת יותרת המוח של עכבר לצורך חקר מחלה זו.ראשית, מבודדים בלוטות פיתואיטריז מעכברים שהורגזו. לאחר מכן, מבצעים הומוגניזציה של הבלוטות על מנת לשבור את התאים באופן מכני ולשחרר חלבונים ציטוסוליים. את ההומוגנאט מבהירים באמצעות צנטריפוגציה במהירות נמוכה, ואת הכמות והאיכות בוחנים באמצעות בדיקת BCA קולורימטרית וכרומטוגרפיית ג'ל פוליאקרילאמיד (PAGE).לבסוף, את הומוגנאט החלבון המימי מערבבים עם אדג'ובנט שומני. תערובת זו מוזרקת לאחר מכן לעכברים כדי ליצור מודל עכברים המדמה היפופיזיטיס אוטואימונית. כפי שמוצג בסרטון הנלווה, תוארו ארבע טכניקות להשראת היפופיזיטיס בבעלי חיים ניסיוניים.הטכניקה המוצגת במאמר זה, שהיא הזרקה של תערובת חלבונים מהיתבון כעזר שפעת, היא הוותיקה ביותר ומתאריכה לשנות ה-60. גישות אחרות כללו הזרקה של גליקופרוטאינים מסיחים מנגיף האדומים בשנת 1992, הזרקה סטריאוטקסטית של אדנווירוס ישירות לבלוטת היתבון בשנת 2002, והשתלה של בלוטת יתבון מזן חולדה אחד תחת הקפסולה של הכליה של זן חולדה אחר בשנת 2010. היתרון המרכזי של גישת העזר של Florence הוא שהיא פחות פולשנית כיום, עקבית יותר ובעיקר מדויקת יותר בהשראת מחלה הדומית מ

preparation-mouse-pituitary-immunogen-for-induction-experimental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

וידאו זה מראה כיצד לגרום hypophysitis אוטואימוניות בעכברים SJL וכיצד להעריך חומרתה ידי histopathology.

אינדוקציה של Hypophysitis אוטואימוניות הניסויי עכברים SJL

סרטון זה מדגים טכניקת הומוגניזציה יעילה ליצירת תחליב אנטיגן-אדג'ובנטי כדי לגרום לאנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) במודל מורין. התחליב מכיל אנטיגן עצמי - גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין (MOG) - בשלב המים, מוקף בשלב שמן רציף הכולל חיידק פתוגני בלתי פעיל. האמולסיה מבטיחה שחרור מתמשך של אנטיגנים לתגובה חיסונית ממושכת.

הכנת תחליב אנטיגן-אדג'ובנטי להשראת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית

הסרטון מדגים השראת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית במודל עכברי על ידי הזרקת שילוב של גליקופרוטאינים אוליגודנדרוציטים מיאלין ושחפת מיקובקטריום בלתי פעילה. המודל מאפשר לחוקרים לחקור מנגנוני מחלה ולבחון התערבויות טיפוליות.

אינדוקציה של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית במודל עכבר

בסרטון זה, מודל עכבר של טרשת נפוצה נקבע באמצעות אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE). העכבר מוזרק עם תחליב המכיל פפטיד עצבי ואדג'ובנט, המפעיל תגובה חיסונית המפעילה תאי T אוטוריאקטיביים. לאחר מכן מתבצעת הזרקה של רעלן שעלת (PTX) כדי להגביר את חדירות מחסום הדם-מוח, מה שמאפשר לתאי T האוטו-תגובתיים לחדור למוח. חדירה זו יוזמת מפל איתות שבסופו של דבר גורם לנזק למיאלין, המחקה את המצב הדה-מיאלינציה של טרשת נפוצה.

ההשתלה של תאי גזע עצביים / אב (NPCs) מחזיקה בהבטחות גדולות בתחום הנוירולוגיה רגנרטיבית. המשלוח המערכתי של NPCs הפך לפרוטוקול יעיל, נמוך פולשנית וטיפולית יעיל מאוד כדי לספק תאי גזע במוח ובחוט השדרה של מכרסמים וקופים לא אנושיים מושפעים מניזק דלקתי כרוני ניסיוני של מערכת העצבים המרכזית.

הזרקה מערכתית של תאי גזע / אב עצביים בעכברים עם EAE כרוני

בדו"ח זה אנו מציגים פרוטוקול המאפשר לחוקר ליצור מודל עכבר של אובאיטיס תוך עינית. מודל מבוסס זה, המכונה בדרך כלל אובאיטיס אוטואימונית ניסיונית (EAU), לוכד היבטים רבים של מחלות אנושיות. במאמר זה נתאר כיצד לגרום ולנטר את התקדמות המחלה באמצעות מספר קריאות.

אובאיטיס אוטואימונית ניסיונית: מודל עכבר דלקתי תוך עיני

הפרוטוקול הנוכחי מתאר אינדוקציה של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית במודל עכברי המשתמש בגליקופרוטאין מיאלין אוליגודנדרוציטים וניטור תהליך המחלה באמצעות מערכת ניקוד קלינית. תסמינים אוטואימוניים ניסיוניים הקשורים לאנצפלומיאליטיס מנותחים באמצעות ניתוח טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת של עצם הירך ובדיקת שדה פתוח כדי להעריך את תהליך המחלה באופן מקיף.

אינדוקציה ומדדי הערכה מגוונים של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית

נקבעו מספר סוגים של מודלים של בלוטת התריס של השימוטו, כמו גם דלקת אוטואימונית ספונטנית של בלוטת התריס בעכבר NOD. עכברי H-2h4 הם מודל פשוט ואמין להשראת HT. מאמר זה מתאר גישה זו ומעריך את התהליך הפתולוגי להבנה טובה יותר של מודל SAT murine.

יצירת עכבר מודל אוטואימוני ספונטני של בלוטת התריס

כדי לגרום לאנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית, מודל חייתי של טרשת נפוצה, עכברים מחוסנים בתחליב מים בשמן המכיל אוטואנטיגן ואדג'ובנט שלם של פרוינד. בעוד שקיימים מספר פרוטוקולים להכנת אמולסיות אלה, מוצג כאן פרוטוקול הומוגניזציה מהיר, פשוט וסטנדרטי להכנת אמולסיה.

שיטת הומוגניזציה מהירה, פשוטה וסטנדרטית להכנת אמולסיות אנטיגן/אדג'ובנטיות לגרימת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית

אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית היא אחד המודלים הנפוצים ביותר של טרשת נפוצה. בפרוטוקול הנוכחי, עכברי C57BL/6J משני המינים מחוסנים בפפטיד גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין, וכתוצאה מכך בעיקר פרזיס עולה של הזנב והגפיים. כאן אנו דנים בפרוטוקול של אינדוקציה והערכה של EAE.

מידול טרשת נפוצה בשני המינים: MOG35-induced ניסיוני אוטואימוני אנצפלומיאליטיס

למדו הכנת חלבוני בלוטת יותרת המוח בעכברים לחקר היפופיזיטיס אוטואימונית. הפרוטוקול כולל בידוד, הומוגניזציה וסרכוז חלבונים ליצירת מודל מחלה.

הכנת Immunogen עכבר יותרת המוח עבור אינדוקציה של Hypophysitis אוטואימונית ניסויית

גלה סרטונים נוספים