הכנת Immunogen עכבר יותרת המוח עבור אינדוקציה של Hypophysitis אוטואימונית ניסויית

היפופיזה אוטואימונית מאופיינת בהגדלה של בלוטת יותרת המוח ובמחסור בהורמון יותרת המוח אחד או יותר. האוטואנטיגנים הסיבתיים נותרו לא ידועים. כאן, מודגם פרוטוקול להכנת חלבוני בלוטת יותרת המוח של עכברים לשימוש בחקר מחלה זו.

ראשית, בלוטות יותרת המוח מבודדות מעכברים שהורדמו. לאחר מכן, יותרת המוח עוברת הומוגניזציה כדי לשבור את התאים באופן מכני ולשחרר חלבונים ציטוזוליים. ההומוגני מובהר על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה ומוערך לכמות על ידי מבחן צבע, בדיקת BCA ואיכות על ידי אלקטרופורזה של ג'ל פולי אקרילאמיד.

לבסוף, החלבון המימי הומוגנט מעורבב עם אדג'ובנט שמנוני. תערובת זו מוזרקת לאחר מכן לעכברים כדי ליצור מודל עכבר הדומה להיפופיזיטיס אוטואימונית. כפי שמוצג בסרטון הנלווה, תוארו ארבע טכניקות לגרימת היפופיזה בחיות ניסוי.

הטכניקה המוצגת במאמר זה, שהיא הזרקת אדג'ובנט תערובת של חלבוני יותרת המוח היא העתיקה ביותר משנות ה-60 של המאה ה-20. גישות אחרות היו הזרקת גליקופרוטאינים מסיסים מנגיף האדמת ב-1992, הזרקה סטריאוטקטית של אדנו-וירוס ישירות לבלוטת יותרת המוח ב-2002, והשתלת בלוטת יותרת המוח מזן חולדה אחד מתחת לקפסולת הכליה של זן חולדה אחר ב-2010. היתרון העיקרי של הגישה האדג'ובנטית של פירנצה הוא שהיא פחות פולשנית בימינו, עקבית יותר ובעיקר מדויקת יותר בגרימת מחלה הדומה מאוד למקבילה האנושית.

למרות שדווח מאז שנות ה-60, טכניקת האדג'ובנט הזר ביצעה ביצועים גרועים לאינדוקציה של היפופיזיטיס. כשהתחלתי את עבודת הדוקטורט שלי, יכולתי להשיג רק מופע וחומרה צנועים של היפופיזיטיס באמצעות פרוטוקול האדג'ובנט הזר שפורסם. הדברים משתפרים באופן משמעותי כאשר יש לי רעיון להגדיל פי עשרה את כמות חלבוני הפיטו המכילים ברגש האלקטרומגנטי

למרות ששיטות אלה יכולות לספק תובנות לגבי הפתוגנזה של היפופיזיטיס אוטואימונית, ניתן להשתמש בהן גם לחקר מחלות אוטואימוניות אחרות שעבורן האנטיגנים האוטואימוניים עדיין לא זוהו. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בעיקר עם השלב האחרון, הכנת השוליים, מכיוון שהוא דורש מיומנויות ידניות, זמן ומסירות. לכן הדגמה חזותית היא קריטית כדי להבין כיצד יש להכין תחליב מתאים.

ההשלכות של טכניקה זו חורגות מתחום החסינות האוטולוגית. הידיעה כיצד להכין את האנטיגן לחיסון יכולה לשמש גם לייצור נוגדנים חד שבטיים או לבדיקת חיסונים חדשים. הדגמת הטכניקה הזו תהיה אורה הגיבור של גן החיות S ומיילנד אל גאטו מהמעבדה שלי.

יותרת המוח של העכבר היא בלוטה בצורת גליל היושבת בבסיס הגולגולת בשקע של עצם הספנואיד הנקראת טריקה. הבלוטה גובלת לרוחב על ידי העצבים הטריגמינליים וקדמית על ידי כיאזמה של עצב הראייה. הוא מורכב מאונה קדמית גדולה יותר ואונות קטנות יותר, בינוניות ואחוריות.

כדי לבודד את בלוטת יותרת המוח, השתמש במספריים כדי לערוף את ראשו של העכבר שהורדם, ולאחר מכן בצע חתכים מקבילים מהחלק האחורי לקדמת הגולגולת. הרם את המוח והפוך אותו לאחור כדי לחשוף את בלוטת יותרת המוח, המופיעה כגליל בהקשר של משולש שווה שוקיים. בלוטת יותרת המוח כבסיס, העצבים הטריגמינליים כצדדים, והכיאזמה האופטית כקודקוד.

הקיפו את הבלוטה בקצות המלקחיים הסגורים כדי לשבור את מנינגה שמסביב. לאחר מכן בעזרת מלקחיים עדינים, תפסו את יותרת המוח מתא טורקה והניחו אותה בצינור פלסטיק על קרח יבש. להכנה אחת, אספו 300 בלוטות יותרת המוח של העכברים.

איסוף זה דורש כתשע שעות אדם. לאחר השלמת האיסוף, אחסן את בלוטות יותרת המוח במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שיהיה בהן צורך. הניחו שפופרת פלקון בנפח 15 מיליליטר באמבט קרח.

הוסף לצינור 250 מיקרוליטר של מאגר הומוגניזציה. על כל 100 יותרות המוח שנאספו ממש לפני ההומוגניזציה, הוסף את בלוטות יותרת המוח של העכבר למאגר. לאחר מכן, הניחו את קצה ההומוגנייזר של הפוליטרון, גנרטור בקוטר חמישה מילימטרים, בתחתית צינור הבז המכיל את יותרת המוח של העכבר, והחיץ הומוגניזציה במהירות מרבית למשך 30 שניות.

הזזת הצינור בעדינות למעלה ולמטה תוך שמירה על קרח. לאחר מכן הניחו את ההומוגנאט על קרח למשך דקה. חזור על שלבי ההומוגניזציה והקירור פעמיים נוספות.

הומוגניזציה עדינה זו אמורה לשבור את התאים ולשחרר את החלבונים מבלי לשבור את צנטריפוגת הגרעין. ההומוגנאט במהירות נמוכה, כ-1000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס למשקעים, לגרעינים, לרקמה הבלתי שבורה ולחומרים בלתי מסיסים כגון רקמת חיבור וקומפלקסים של חלבונים שעברו דנטורציה. הקפדה לא להפריע לכדור.

העבירו את ה-SNA שנקרא עכשיו פוסט-גרעיני או PNS לחנות שפופרת חדשה של פלקון. ה-PNS על הקרח מושך את הגלולה באמצעות אותו נפח של מאגר הומוגניזציה כמו לפני הומוגניזציה וצנטריפוגה כמו קודם. לאחר איגום שתי דגימות ה-PNS, הכניסו את התמיסה לצינורות מיקרו-צנטריפוגות רבים.

אחסן את צינורות המיקרו צנטריפוגה במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שהם נחוצים. תכשיר חלבון זה יציב במינוס 80 מעלות צלזיוס, אך מאבד בהדרגה מעוצמתו. לפיכך, מומלץ להשתמש בו תוך חצי שנה מההכנה.

שמור עלייה קטנה אחת של PNS כדי לקבוע את תפוקת החלבון וריכוזו על ידי בדיקת חומצת הביה. לאחר מכן קבע את איכות החלבון על ידי אלקטרופורזה של ג'ל מ-300 בלוטות יותרת המוח של עכברים, שמשקלן הכולל הממוצע הוא כ-570 מיליגרם. צפו לתשואה של 60 מיליגרם חלבוני יותרת המוח או מיליגרם אחד של חלבון לכל 10 מיליגרם רקמה.

ריכוז החלבון הוא בדרך כלל בסביבות 40 מיליגרם למיליליטר. הדוגמה שניתנה כאן היא לחיסון 10 עכברים. תכננו להזריק לכל עכבר 100 מיקרוליטר תחליב המכיל מיליגרם אחד של חלבון יותרת המוח, מה שמאפשר לשני עכברים נוספים לאובדן חומר במהלך ההכנה כאן, מכינים 12 מיליגרם של תחליב חלבון.

התחל בהפשרה מהירה של חבילות החלבון הקפואות על ידי חימום בידיים שלך. התאם את ריכוז החלבון ל -20 מיליגרם למיליליטר עם PBS. לאחר מכן, שאב 600 מיקרוליטר של תמצית חלבון יותרת המוח המתאימה ל-12 מיליגרם לתוך 2.5 מיליליטר מזרק גז טייט המילטון, אדג'ובנט FRONS מלא או CFA המכיל חמישה מיליגרם למיליליטר של חום הרג מיקובקטריום טוברקולוזיס על ידי ניעור ידני שלו.

לאחר מכן משוך 600 מיקרוליטר של ה-CFA למזרק המילטון נוסף של 2.5 מיליליטר. חבר ואבטח מחט מיקרו מתחלבת בגודל 22 למזרק המלא ב-CFA. דחוף לאט את הבוכנה כך שהמחט תתמלא ב-CFA.

לאחר מכן חבר ואבטח את הקצה השני של המחט למזרק השני המלא בתמצית חלבון יותרת המוח. הימנע מלכידת בועות אוויר בתוך המזרקים. קדם לאט את הבוכנה של מזרק ה-CFA כדי לדחוף את רכיב השמן לתוך תמצית יותרת המוח המימית כך שרק כמות קטנה מעורבבת.

לאחר מכן דחף לאחור את הבוכנה של מזרק תמצית יותרת המוח לתוך מזרק CFA. חזור על פעולה זו כדי להגדיל בהדרגה את כמות החומר המעורבב עד שכל התוכן מעורבב. חומר לבנבן זה המפוזר באופן שווה מייצג את תחליב המים והשמן.

לאחר יצירת האמולסיה, חזור על המחזור המלא הלוך ושוב לפחות 500 פעמים לאחר המחזור הסופי, המזרקים יכילו תחליב מים ושמן אחד לאחד כאשר ריכוז חלבון יותרת המוח הוא כעת 10 מיליגרם למיליליטר. האמולסיה מוכנה לשימוש כדי לבחון את איכות האמולסיה בטיפה שלה לכוס מים. אם האמולסיה מוכנה כהלכה, הטיפה תישאר קומפקטית ומהודקת על פני השטח.

אם האמולסיה באיכות ירודה, היא תתפשט ותתפצל לטיפות קטנות יותר. האמולסיה מוזרקת באותו יום של הכנתו לעכברי SJL כדי לגרום להיפופיזה אוטואימונית ניסיונית. פרוטוקול זה מפורט בג'ו הנלווה של אנכי.

לאחר איסוף בלוטת הפיטו ושליטה בטכניקות, ניתן לבצע את הוראת החלבון בשעה אחת, ולזכור לעבוד על צום ועל קרח. במהלך שלב זה, במהלך הכנת הטבילה, הדורשת כשעה. זכרו לעבוד לאט ובסבלנות בשלב הערבוב הראשוני לאחר התפתחותו.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האוטואימוניות לחקור את המנגנונים שדרכם לימפוציטים אוטוראקטיביים מזהים וחודרים לאיבר המטרה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין תמצית חלבון מבלוטת יותרת המוח של העכבר וכיצד לערבב אותה עם אג'ו של קרוהן להכנת תחליב מוכן לשימוש כאימונוגן. אל תשכח שעבודה עם מזרקים וקצה שפעת שלמים, המכילים שחפת מיקרובקטריאלית מושבתת ויבשה עלולה להיות מסוכנת אם אתה מנקב את עצמך בטעות.

אז השתמש תמיד בזוהר G והשליך מחטים כראוי בזמן ביצוע הליך זה.