Name: אסטרטגיות לחקר neuroprotection מן הקרה נפשית מראש (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-02T17:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 27 s
Description: חקור מנגנוני נוירו-חיסון בחתכי היפוקמפוס של עכברושים לזיהוי מטרות טיפוליות להגנה על המוח לפני פציעה נוירולוגית. השיטה מודדת ציטוקינים פרו-דלקתיים ברמות נמוכות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי תרומות של המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ (NS-19108), קרן מחקר מיגרנה, וקרן הלבן ריצ&#39;רד פ &#39;Kraig. גב &#39;פ&#39; מרשה Kraig סייעו בהכנת התקשורת בתרבות ותחזוקה של תרבויות פרוסה. אנו מודים ילנה גרינברג הערות ותיקונים אותה על גרסה סופית של מאמר זה.

<ol><li>Aptowicz, C. O., Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+plasticity+in+hippocampal+slice+cultures+involves+changes+in+voltage-gated+Na%2B+channel+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Homeostatic plasticity in hippocampal slice cultures involves changes in voltage-gated Na+ channel expression.</a> Brain Res. 998, 155-163 (2004).</li>
<li>Beattie, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+synaptic+strength+by+glial+TNFalpha%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of synaptic strength by glial TNFalpha.</a> Science. 295, 2282-2285 (2002).</li>
<li>Breder, C. D., Dewitt, D., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+inducible+cyclooxygenase+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Characterization of inducible cyclooxygenase in rat brain.</a> J Comp Neurol. 355, 296-315 (1995).</li>
<li>Caggiano, A. O., Breder, C. D., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+elevation+of+cyclooxygenase-2%2C+but+not+lipoxygenase%2C+in+regions+synaptically+distant+from+spreading+depression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Long-term elevation of cyclooxygenase-2, but not lipoxygenase, in regions synaptically distant from spreading depression.</a> J Comp Neurol. 376, 447-462 (1996).</li>
<li>Caggiano, A. O., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eicosanoids+and+nitric+oxide+influence+induction+of+reactive+gliosis+from+spreading+depression+in+microglia+but+not+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Eicosanoids and nitric oxide influence induction of reactive gliosis from spreading depression in microglia but not astrocytes.</a> J Comp Neurol. 369, 93-108 (1996).</li>
<li>Caggiano, A. O., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+and+4-aminopyridine+prevent+the+lipopolysaccharide-induced+outwardly+rectifying+potassium+current+and+interleukin-1beta+production+in+cultured+rat+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 and 4-aminopyridine prevent the lipopolysaccharide-induced outwardly rectifying potassium current and interleukin-1beta production in cultured rat microglia.</a> J Neurochem. 70, 2357-2368 (1998).</li>
<li>Caggiano, A. O., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E+receptor+subtypes+in+cultured+rat+microglia+and+their+role+in+reducing+lipopolysaccharide-induced+interleukin-1beta+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E receptor subtypes in cultured rat microglia and their role in reducing lipopolysaccharide-induced interleukin-1beta production.</a> J Neurochem. 72, 565-575 (1999).</li>
<li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+therapies+for+stroke+and+traumatic+brain+injury+often+display+U-shaped+dose+responses%3A+occurrence%2C+mechanisms%2C+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Drug therapies for stroke and traumatic brain injury often display U-shaped dose responses: occurrence, mechanisms, and clinical implications.</a> Crit Rev Toxicol. 38, 557-577 (2008).</li>
<li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+stress+response+terminology%3A+Integrating+the+concepts+of+adaptive+response+and+preconditioning+stress+within+a+hormetic+dose-response+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Biological stress response terminology: Integrating the concepts of adaptive response and preconditioning stress within a hormetic dose-response framework.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 222, 122-128 (2007).</li>
<li>Calabrese, E. J., Baldwin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormesis%3A+the+dose-response+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Hormesis: the dose-response revolution.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 175-197 (2003).</li>
<li>Hansel, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+CD4%2B+T-cell+gene+expression+in+allergic+subjects+using+two+different+microarray+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Analysis of CD4+ T-cell gene expression in allergic subjects using two different microarray platforms.</a> Allergy. 63, 366-369 (2008).</li>
<li>Hulse, R. E., Kunkler, P. E., Fedynyshyn, J. P., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+multiplexed+bead-based+cytokine+immunoassays+for+rat+serum+and+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of multiplexed bead-based cytokine immunoassays for rat serum and brain tissue.</a> J Neurosci Methods. 136, 87-98 (2004).</li>
<li>Hulse, R. E., Swenson, W. G., Kunkler, P. E., White, D. M., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monomeric+IgG+is+neuroprotective+via+enhancing+microglial+recycling+endocytosis+and+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monomeric IgG is neuroprotective via enhancing microglial recycling endocytosis and TNF-alpha.</a> J Neurosci. 28, 12199-12211 (2008).</li>
<li>Hulse, R. E., Winterfield, J., Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+clasmatodendrosis+in+hippocampal+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocytic clasmatodendrosis in hippocampal organ culture.</a> Glia. 33, 169-179 (2001).</li>
<li>Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+and+Microglial+Hormetic+Involvement+in+Neurological+Health+and+Migraine%5BTitle%5D)+AND+%22International+Dose-Respose+Society%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha and Microglial Hormetic Involvement in Neurological Health and Migraine.</a> International Dose-Respose Society. , (2010).</li>
<li>Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+cytokine+protein+expression+profiles+from+spreading+depression+in+hippocampal+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Multiplexed cytokine protein expression profiles from spreading depression in hippocampal organotypic cultures.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 24, 829-839 (2004).</li>
<li>Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Schmitt, M. W., Nicholson, C., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+current+source+density+analysis+in+hippocampal+organotypic+culture+shows+that+spreading+depression+occurs+with+uniquely+reversing+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optical current source density analysis in hippocampal organotypic culture shows that spreading depression occurs with uniquely reversing currents.</a> J Neurosci. 25, 3952-3961 (2005).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytosis+from+excitotoxic+injury+in+hippocampal+organ+culture+parallels+that+seen+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytosis from excitotoxic injury in hippocampal organ culture parallels that seen in vivo.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 17, 26-43 (1997).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+waves+precede+electrophysiological+changes+of+spreading+depression+in+hippocampal+organ+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium waves precede electrophysiological changes of spreading depression in hippocampal organ cultures.</a> J Neurosci. 18, 3416-3425 (1998).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P%2FQ+Ca2%2B+channel+blockade+stops+spreading+depression+and+related+pyramidal+neuronal+Ca2%2B+rise+in+hippocampal+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">P/Q Ca2+ channel blockade stops spreading depression and related pyramidal neuronal Ca2+ rise in hippocampal organ culture.</a> Hippocampus. 14, 356-367 (2004).</li>
<li>Lambertsen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+protect+neurons+against+ischemia+by+synthesis+of+tumor+necrosis+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia protect neurons against ischemia by synthesis of tumor necrosis factor.</a> J Neurosci. 29, 1319-1330 (2009).</li>
<li>Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulator+of+G-protein+signaling+10+promotes+dopaminergic+neuron+survival+via+regulation+of+the+microglial+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulator of G-protein signaling 10 promotes dopaminergic neuron survival via regulation of the microglial inflammatory response.</a> J Neurosci. 28, 8517-8528 (2008).</li>
<li>Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormesis+and+disease+resistance%3A+activation+of+cellular+stress+response+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Exp+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Hormesis and disease resistance: activation of cellular stress response pathways.</a> Hum Exp Toxicol. 27, 155-162 (2008).</li>
<li>Ning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+simultaneous+gene+profiling+of+84+drug-metabolizing+genes+in+primary+human+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Systematic and simultaneous gene profiling of 84 drug-metabolizing genes in primary human hepatocytes.</a> J Biomol Screen. 13, 194-201 (2008).</li>
<li>Oppenheim, J., Feldman, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOppenheim%2C+J+%22in+Cytokine+Reference%22">in Cytokine Reference</a>. Oppenheim, J. J., Feldman, M. 1, Academic. New York. (2001).</li>
<li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, e45-e45 (2001).</li>
<li>Stellwagen, D., Beattie, E. C., Seo, J. Y., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+AMPA+receptor+and+GABA+receptor+trafficking+by+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of AMPA receptor and GABA receptor trafficking by tumor necrosis factor-alpha.</a> J Neurosci. 25, 3219-3228 (2005).</li>
<li>Stellwagen, D., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+scaling+mediated+by+glial+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic scaling mediated by glial TNF-alpha.</a> Nature. 440, 1054-1059 (2006).</li>
<li>Streit, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+as+neuroprotective%2C+immunocompetent+cells+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS.</a> Glia. 40, 133-139 (2002).</li>
<li>Wilde, G. J., Pringle, A. K., Sundstrom, L. E., Mann, D. A., Iannotti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+and+augmentation+of+ischaemia-related+neuronal+death+by+tumour+necrosis+factor-alpha+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Attenuation and augmentation of ischaemia-related neuronal death by tumour necrosis factor-alpha in vitro.</a> Eur J Neurosci. 12, 3863-3870 (2000).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

שני מושגים חשובים ביסודו חשוב התיחום של מערכת איתות ציטוקינים המעורבים neuroprotection קר נפשית מראש מומחשים איורים 6 ו -7. ראשית, ציטוקינים הם ריכוז נמוך מאוד מולקולות איתות במוח הנורמלי. עם זאת, שינויים פיזיולוגיים ריכוז ציטוקינים יש פוטנציאל עצום לשנות את מבנה המוח ותפקודו (כלומר, פנוטיפ) בגלל היכולת שלהם לשנות את ביטוי הגנים (איור 6). יתר על כן, הציטוקינים הם מיותרים מאוד pleiotropic בכך ציטוקינים מרובים יכולה להיות השפעה דומה ציטוקין בודד יכולה להיות השפעה משתנה (איור 7). לכן, כדי לקבוע במדויק את המולדת ציטוקינים-בסיסים neuroprotection מהקור-נפשית מראש (או גירויים אחרים נפשית מראש פיזיולוגיים), ניתוח מורכב של משתנים הקשורים איתות חייבת להיות נחושה. מטרה זו מושגת באמצעות אסטרטגיות assay multiplexed. זה יהיה להקים את ציטוקינים "חתימה" של neuroprotection קר נפשית מראש. <img src="/files/ftp_upload/2192/2192fig6.jpg" alt="איור 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 6"> איור 6. כוחה של ציטוקינים איתות במוח. האיורים להעביר את הכוח איתות עצום של ריכוזים פיזיולוגיים של ציטוקינים במוח לעומת ריכוזי מוכרת היטב עמיתיהם אחרים. ריכוז מיוצג ההופכי של המרחק, החל זיף חתול בודד כנקודת התייחסות. נתרן (מ -1 10 מאויר על ידי גרגר פלפל) ואשלגן (10 מ -3 מאויר על ידי עגבניה) נמצאים במרחב ביניים המוח ברמות של סביב 150 ו - 3 מ"מ, בהתאמה, יש מוכרים היטב תפקידים תאים עצביים לתפקד אלקטרו. כמו כן, ה-pH (כלומר, ~ 10 -7 M רמות של יוני מימן ואייר כמו 780 מטרים לאורך שפת האגם של שיקגו) וסידן (כלומר, ~ 10 -8 M רמות כפי שמוצג 7.8 ק"מ לראות תמונת לווין גוגל שפת האגם של שיקגו מ מקורמיק המקום לנקודה חרטום בהייד פארק ליד אוניברסיטת שיקגו). בנוסף, העצביים המשוחררים לחלל ביניים על ריכוזים אלה משפיעים על הפעילות המקומית אזור במוח. לעומת זאת, ציטוקינים (כפי שמוצג המרחק מכדור הארץ למאדים) יכול לשנות את תפקוד המוח בריכוזים יותר מעשר מיליון פעמים פחות. <img src="/files/ftp_upload/2192/2192fig7.jpg" alt="איור 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 7"> איור 7. איתות אינטראקטיבית של מסלולים ציטוקינים מולדים. ציטוקינים הם מיותרים מאוד pleiotropic בכך ציטוקינים מרובים יכולה להיות השפעה דומה ציטוקין בודד יכולה להיות השפעה משתנה. גיוון כזה נובעת איתות אינטראקטיביים מורכבים המתרחשת ברמה של ligands, קולטנים, ו phosphoproteins. מורכבות נוספת נובעת מהעובדה כי המוח מורכב של סוגי תאים שונים, שכל אחד מהם מסוגל ציטוקינים תא קולטן ספציפי מולדת, ושינויים phosphoprotein בנושא. לשם המחשה כאן, רק ציטוקינים מולדת איתות המסלולים (הנגזרות מחקרים תא החיסון) מוצגים. לשם הפשטות, המוח הוא נמשך כמו תא בודד (קו לבן) מראה את יחסי הגומלין פוטנציאל מולד ציטוקינים (IL-1α ו-IL-1β (המכונה כאן כמו IL-1α / β), TNF-α, IL-6, IFN-γ ו IL-10), קולטנים (IL-1R1, TNFR1, IL-6/gp130, IFNγR, ו-IL-10R), ו phosphoproteins (כלומר, קינאזות ERK1 / 2, p38 (p38-MAPK) ו JNK) ואת גורמי תעתוק (ATF-2, NFκB ו STAT3). לדוגמה, TNF-α אותות דרך TNFR1 כדי JNK, p38 ו-MAPK ERK1 / 2, אשר מפעילה ביטוי גנים באמצעות ATF-2. TNF-α גם משנה את ביטוי הגנים ישירות באמצעות הפעלת NFκB. יחד, הפעלה של גורמי שעתוק אלה מעוררות מוגברת (חץ) וירידה (סוף בוטה) ביטוי של ציטוקינים הקולטנים שלהם כפי שצוין. חשוב לציין, מסלולים אלה מראים כי שינויים ציטוקינים אחד (למשל, TNF-α) ההשפעה של ייצור (למשל, IL-1β) ציטוקינים אחרים. לכן, כדי להקים במדויק את ציטוקינים-בסיסים neuroprotection מהקור-נפשית מראש, ניתוח מורכב של משתנים הקשורים איתות חייבת להיות נחושה. זה יהיה להקים את ציטוקינים מולדת "חתימה" של קר נפשית מראש. (תמונה נערך מנתוני התייחסות # 25).

הכנת תרבויות Slice <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / ציוד </td><td> חברה </td><td> קטלוג / דגם מספר </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Millicell-CM בתרבית רקמה מוסיף (30 מ&quot;מ) </td><td> תרמו פישר </td><td> PICM0-3050 </td><td></td></tr><tr><td> בינוני בסל הנשר </td><td> Invitrogen </td><td> 21010 </td><td></td></tr><tr><td> ארל s פתרון מאוזן מלח </td><td> סיגמא </td><td> E2888 </td><td></td></tr><tr><td> סוס בסרום </td><td> Invitrogen </td><td> 26050-088 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 35050 </td><td></td></tr><tr><td> גנטמיצין </td><td> Invitrogen </td><td> 15710-064 </td><td></td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Invitrogen </td><td> 15295 </td><td></td></tr><tr><td> D-גלוקוז </td><td> סיגמא </td><td> G8769 </td><td></td></tr><tr><td> BSL-1 קטר ברדס </td><td> אופה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> McIlwain המסוק רקמה </td><td> Brinkmann </td><td></td><td></td></tr><tr><td> טפלון דיסקים </td><td> Brinkmann </td><td> 023-49-310-1 </td><td></td></tr><tr><td> מרית </td><td> תרמו פישר </td><td> 14-373-25A </td><td></td></tr><tr><td> Curved איריס מספריים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 14091-09 </td><td></td></tr><tr><td> מספריים ישר ארוך </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 14002-14 </td><td></td></tr><tr><td> לונג מלקחיים </td><td> תרמו פישר </td><td> 13-812-40 </td><td></td></tr><tr><td> בזווית מלקחיים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 11808-02 </td><td></td></tr><tr><td> קצר מלקחיים </td><td> תרמו פישר </td><td> 13-812-38 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 Inox מלקחיים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> 2 איריס spatulae </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 10094-13 </td><td></td></tr><tr><td> 150 x 15 מ&quot;מ צלחות פטרי </td><td> תרמו פישר </td><td> 08-757-148 </td><td></td></tr><tr><td> 60 x 15 מ&quot;מ צלחות פטרי </td><td> תרמו פישר </td><td> 08-757-100B </td><td></td></tr><tr><td> Stereomicroscope Wild M8 </td><td> Wild Heerbrugg </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מלח איזון גיי של פתרון </td><td> סיגמא </td><td> G9779 </td><td></td></tr><tr><td> Blak-Ray למדידת גלים קצרים סגול מטר </td><td> UVP </td><td> J-225 </td><td></td></tr><tr><td> 6-Falcon היטב מנות תרבות </td><td> תרמו פישר </td><td> 08-772-1B </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Invitrogen </td><td> 21103</td><td></td></tr><tr><td> תוסף B27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504 </td><td></td></tr><tr><td> Gem21 Neuroplex </td><td> ג&#39;מיני Bioproducts </td><td> 400-160-010 </td><td></td></tr><tr><td> חומצה אסקורבית </td><td> סיגמא </td><td> A4544 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2 Analyzer </td><td> בכרך </td><td> # 2820 </td><td></td></tr></tbody></table> לפני ההקרנה של Vitality תרבויות Slice <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / ציוד </td><td> חברה </td><td> קטלוג / דגם מספר </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Sytox גרין </td><td> Invitrogen </td><td> S7020 </td><td></td></tr><tr><td> DMIBRE הפוכה מיקרוסקופ </td><td> לייקה </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> הקרה נפשית מראש <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / ציוד </td><td> חברה </td><td> קטלוג / דגם מספר </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> BSL-2 פומה הוד </td><td> NuAire </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Excitotoxic פגיעה <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / ציוד </td><td> חברה </td><td> קטלוג / דגם מספר </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> CoolSnap fx מצלמת CCD </td><td> Photometrics </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fluoroscein </td><td> Invitrogen </td><td> F36915 </td><td></td></tr><tr><td> MetaMorph תוכנה </td><td> מולקולרית התקנים </td><td> נ 7.5.04 </td><td></td></tr><tr><td> 100 hemacytometer עמוק מיקרומטר </td><td> האוסר מדעי </td><td></td><td></td></tr><tr><td> N-methyl-D-aspartate </td><td> Calbiochem </td><td> 454575 </td><td></td></tr><tr><td> SigmaStat תוכנה </td><td> Systat תוכנה בע&quot;מ </td><td> נ 3.5 </td><td></td></tr></tbody></table> עמית טיפולים להחיל עם הקרה נפשית מראש <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / ציוד </td><td> חברה </td><td> קטלוג / דגם מספר </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> sTNFR1 </td><td> R &amp; D מערכות </td><td> 425-R1-050 </td><td></td></tr><tr><td> שור סרום אלבומין </td><td> סיגמא </td><td> A-4503 </td><td></td></tr></tbody></table> בידוד RNA <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / ציוד </td><td> חברה </td><td> קטלוג / דגם מספר </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> RNAl ater </td><td> Ambion </td><td> AM7021 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרו RNEasy Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74004 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoethanol </td><td> דיג </td><td> 03446-100 </td><td></td></tr><tr><td> Diposable 1.5 RNAse ללא העלי </td><td> דרום ג&#39;רזי כלי Precision ו, עובש בע&quot;מ </td><td> 749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> RNasin </td><td> Promega </td><td> N261A </td><td></td></tr><tr><td> טריס [hydroxymethyl] aminomethane </td><td> סיגמא </td><td> T3069 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA (ethylenediaminetetraacetic חומצה disodium מימה מלח </td><td> סיגמא </td><td> # E7889 </td><td></td></tr></tbody></table> RNA כימות <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / ציוד </td><td> חברה </td><td> קטלוג / דגם מספר </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> RiboGreen Assay </td><td> Invitrogen </td><td> R11491 </td><td></td></tr><tr><td> שמרים tRNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td></td></tr><tr><td> 1.5 צנטריפוגות צינורות מ&quot;ל </td><td> ארה&quot;ב מדעי </td><td> 16155500 </td><td></td></tr><tr><td> גם 96-assay פלורסנט צלחת </td><td> Nunc </td><td> DK-4000 </td><td></td></tr><tr><td> 96 גם צלחת פלורסנט הקורא </td><td> טקאן </td><td> ספייר מה&quot;ניו II </td><td></td></tr></tbody></table> PCR כמותי <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / ציוד </td><td> חברה </td><td> קטלוג / דגם מספר </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> שעתוק iScript הפוכה ערכת </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8891 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR גרין </td><td> Invitrogen </td><td> S7563 </td><td></td></tr><tr><td> תקי פלטינום פולימראז </td><td> Invitrogen </td><td> RNA Ultrasense 11732-927 </td><td></td></tr><tr><td> iCycler thermocycler </td><td> Bio-Rad </td><td> iCycler אופטי מודול </td><td></td></tr><tr><td> iCycler תוכנת המערכת </td><td> Bio-Rad </td><td> נ 3.1 </td><td></td></tr></tbody></table> כמותי PCR עבור microarrays <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / ציוד </td><td> חברה </td><td> קטלוג / דגם מספר </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> RNase חוץ </td><td> מולקולרית Bioproducts </td><td> # 7000 </td><td></td></tr><tr><td> RT 2 סטרנד ראשון Kit </td><td> SABiosciences </td><td> C-03 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR גרין מבוססי PCR לערבב </td><td> SABiosciences </td><td> PA-011 </td><td> ספציפיות iCycler </td></tr><tr><td> RT 2 Profiler מערך ה-PCR </td><td> SABiosciences </td><td> פרן-011A </td><td></td></tr></tbody></table> Proteomic Assay <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / ציוד </td><td> חברה </td><td> קטלוג/ דגם מספר </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> תמוגה Cell ערכת </td><td> Bio-Rad </td><td> 171-304011 </td><td></td></tr><tr><td> Microcentrifuge </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> מיקרו 7 </td><td></td></tr><tr><td> BSA מניות חלבון </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0007 </td><td></td></tr><tr><td> Assay BCA חלבון ערכת </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23225 </td><td></td></tr><tr><td> חיסונית 96 microwell צלחות </td><td> Nunc </td><td> 449824 </td><td></td></tr><tr><td> איטום קלטת </td><td> Bio-Rad </td><td> 2239444 </td><td></td></tr><tr><td> 96 גם צלחת הקורא </td><td> פרקין אלמר </td><td> 1420-mulilabel לדלפק </td><td></td></tr><tr><td> Bioplex עכברוש TNF-α ציטוקינים assay </td><td> Bio-Rad </td><td> X0000001T </td><td></td></tr></tbody></table> Immunostaining <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / ציוד </td><td> חברה </td><td> קטלוג / דגם מספר </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> 16% Paraformaldehyde </td><td> אלפא Aesar </td><td> 43368 </td><td></td></tr><tr><td> ליזין </td><td> סיגמא </td><td> L-6001 </td><td></td></tr><tr><td> סודיום פוספט </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> S374-1 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן periodate </td><td> סיגמא </td><td> S-1878 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן אזיד </td><td> סיגמא </td><td> S-2002 </td><td></td></tr><tr><td> מי חמצן (30%) </td><td> סיגמא </td><td> H1009 </td><td></td></tr><tr><td> עיזים בסרום </td><td> קולורדו החברה סרום </td><td> CS 0920 </td><td></td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> סיגמא </td><td> T-8787 </td><td></td></tr><tr><td> מכתים מנות </td><td> טד פלה, Inc </td><td> 14511 </td><td></td></tr><tr><td> פלייט שאכר </td><td> Lab-Line מכשירים, Inc </td><td> 3520 </td><td></td></tr><tr><td> # 1 סנן מאמרים (185 מ&quot;מ) </td><td> Whatman </td><td> 1001-185 </td><td></td></tr><tr><td> 3,3-diaminobenzidine </td><td> סיגמא </td><td> D8001 </td><td></td></tr><tr><td> דימתיל sulfoxide </td><td> סיגמא </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> אתנול </td><td> Pharmco-AAPER </td><td> 111000200 </td><td></td></tr><tr><td> קסילן </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> X3S-4 </td><td></td></tr><tr><td> התקשורת הרכבה Permount </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> SP15-100 </td><td></td></tr><tr><td> Cryostat </td><td> לייקה </td><td> 3 ס&quot;מ 050 S </td><td></td></tr><tr><td> רקמות-Tek </td><td> טד פלה, Inc </td><td> 27050 </td><td></td></tr><tr><td> עדין קצה מברשת צבע </td><td> טד פלה </td><td> 11806 </td><td></td></tr><tr><td> PAP חסימת עט </td><td> טד פלה, Inc </td><td> 22309 </td><td></td></tr><tr><td> SFX אות משפר </td><td> Invitrogen </td><td> A31631 </td><td></td></tr><tr><td> להאריך Antifade </td><td> Invitrogen </td><td> P7481 </td><td></td></tr></tbody></table>

אסטרטגיות לחקר neuroprotection מן הקרה נפשית מראש

Strategies for Study of Neuroprotection from Cold-preconditioning

פציעה נוירולוגיות הוא הגורם השכיח של תחלואה ותמותה מן ההרדמה הכללית ניתוחים הקשורים שניתן להקל על ידי פיתוח יעיל, קל לניהול וטיפולים נפשית מראש בטוח. אנו מבקשים להגדיר את האותות העצביים האחראים החיסונית קר נפשית מראש כאמצעי לזיהוי מטרות הרומן לפיתוח הרפוי כדי להגן על המוח לפני תחילת פציעה. ברמה נמוכה הפרו דלקתי מתווך איתות שינויים לאורך זמן חיוניים neuroprotection קר נפשית מראש. איתות זה עולה בקנה אחד עם העקרונות הבסיסיים של hormesis מיזוג פיזיולוגיים, אשר דורשים גירויים irritative להגיע גודל סף עם מספיק זמן הסתגלות לגירויים להגנה להיות ברור. לפיכך, התוויית איתות החיסון המעורבים neuroprotection קר נפשית מראש דורש כי מערכות ביולוגיות מניפולציות ניסיוני בתוספת היכולות הטכניות ולייצר מאוד רגיש. הגישה שלנו היא להשתמש תרבויות פרוסה בהיפוקמפוס כמו במודל חוץ גופית כי מקרוב משקף שלהם עם עמיתיהם vivo רב סינפטיים רשתות עצביות מושפע macroglia בוגרת שקט / microglia. מצב זה גליה חשוב במיוחד עבור microglia שכן הם המקור העיקרי של ציטוקינים, אשר פעיל בטווח femtomolar. כמו כן, תרבויות פרוסה יכול להישמר במבחנה במשך מספר שבועות, וזה מספיק זמן כדי לעורר גירויים הפעלת ולהעריך התגובות אדפטיבית. לבסוף, תנאים סביבתיים ניתן לשלוט בצורה מדויקת באמצעות תרביות פרוסה כך ציטוקינים כי האיתות של קר נפשית מראש ניתן למדוד, חיקה, ומתנגן לנתח את ההיבטים צומת קריטי. איתות ציטוקין מנתחת המערכת דורשת שימוש בטכניקות multiplexed רגיש לשחזור. אנו משתמשים כמותי PCR עבור TNF-α למסך להפעלת microglial ואחריו כמותי ההקרנה בזמן אמת qPCR מערך להעריך רקמות רחב שינויים ציטוקינים. האחרון הוא אמצעי רגיש ביותר לשחזור למדוד מערכת ציטוקינים מרובים איתות שינויים בו זמנית. שינויים משמעותיים הם אישרו עם qPCR ממוקד ולאחר מכן גילוי חלבון. אנחנו בדיקה עבור מבוססי רקמות ציטוקינים שינויים חלבון באמצעות זרם multiplexed microsphere מבחני cytometric באמצעות טכנולוגיית Luminex. תא ספציפי ייצור ציטוקינים נקבעת עם אימונוהיסטוכימיה פעמיים התווית. יחדיו, זו רקמת המוח הכנה וסגנון השימוש, מצמידים את האסטרטגיות החקירה הציע, יכול להיות גישה אופטימלית לזיהוי מטרות פוטנציאליות לפיתוח הרפוי הרומן הזה יכול לחקות את היתרונות של קר נפשית מראש.

אנו מבקשים להגדיר את האותות העצביים האחראים החיסונית קר נפשית מראש כאמצעי לזיהוי מטרות הרומן לפיתוח הרפוי כדי להגן על המוח לפני תחילת פציעה. אנו מציגים אסטרטגיות עבודה כזו הדורשים מערכות ביולוגיות, מניפולציות ניסיוני בתוספת היכולות הטכניות, כי הם לשעתקו מאוד רגיש.

פגיעה נוירולוגית היא גורם שכיח לתחלואה ותמותה כתוצאה מהרדמה כללית והליכים כירורגיים נלווים, שניתן להפחיתה על ידי...

פגיעה נוירולוגית היא סיבה שכיחה לתחלואה ותמותה כתוצאה מהרדמה כללית. מטרת העבודה המוצגת בסרטון זה היא לבחון את ההשפעה של התנייה מוקדמת בקור (cold preconditioning) על סיגנל immunity נוירולוגי בחולדות, כדרך לזיהוי מטרות חדשות לטיפולים להגנה על המוח לפני תחילת הפגיעה. מטרה זו מושגת על ידי יצירת תרביות של פרוסות היפוקמפוס מחולדות בוגרות, בריאות וארוכות חיים.התרביות נחשפו לה Conditioning קירור מוקדם כדי להשרות נוירופרוטקציה מבוססת מערכת חיסון. לאחר מכן, נוסף רעלן anci והתרביות של הפרוסות צולמו. ניתוח התמונות מצביע על כך ש-Conditioning קירור מוקדם מוביל להפחתה דרמטית ברמת האובדן הנוירונלי הסלקטיבי.שמי הוא ריצ'רד קרייג, ואיתי היידי מיטשל. אנחנו מהמחלקה לנוירולוגיה באוניברסיטת שיקגו, והיום נתאר עבורכם כיצד ניתן להשתמש בהכנת תרבית פרוסות כדי לענות על שאלות בנוגע להגנה עצבית (neuroprotection) המערבת אותות חיסוניים פרו-דלקתיים ברמה נמוכה, כאמצעי לחיזוק המוח נגד מחלות מוח. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בפרוצדורה זו מתקשים בה עקב הצורך להבטיח חיוניות לטווח ארוך ותרביות בריאות המסוגלות להפגין אותות פרו-דלקתיים ברמה נמוכה.היידי תדגים כעת מספר פרוצדורות המשמשות אותנו במעבדה כדי להתגבר על מכשולים אלו, כך שניתן יהיה למדוד סיגנל פרו-דלקתי ברמה נמוכה ככלי לפיתוח חומרים נוירופרוטקטיביים למוח. יש לבצע את הניסויים הבאים כאשר לובשים חלוק מעבדה נקי וכפפות סטריליות המתוחות מעל שרוולי החלוק. התחילו בהנחת כל הפריטים הדרושים לפרוצדורה בתוך מנשף למינרי ברמת BSL 1, כולל קוצץ רקמות מסוג mcil wane עם התאמי טפלון רלוונטיים, להב תער, כלי ניתוח וצלחות פטרי לדיסקציה.את המכסה יש למקם בחדר תרביות בלחץ חיובי עם סינון HIPAA, כאשר האוויר מטוהר על ידי מאווררי ניקוי אוויר באור על-סגול עצמאיים לפחות 30 דקות לפני תחילת הניסויים. הניחו פלטה קרה לדיסקציה בתוך המכסה וחברו אותה למקלח מים סמוי בתוך מכסה תרביות התאים. הכניסו inserts של milli cell לכל באר בלוח שש בארות והוסיפו 1.1 milliliters של מצע תרבית לכל אחת.הנח את המגש באינקובטור בטמפרטורה של 36 °C, 5% carbon dioxide ו-95% לחות למשך לפחות 20 דקות. שמור על גורי החולדה חמים עד למועד השימוש בהם על ידי הנחתם תחת מנורת חימום. הרדם את הגור על ידי הנחתו ב-100% carbon dioxide. לאחר ההרדמה, טבול את הגור ב-100% ethanol, לאחר מכן בצע עריפת ראש והנח את הגוף בצלחת פטרי אחת של 100 millimeter ואת הראש בצלחת אחרת.בשלב הבא, השתמש במספרי איריס קמורים כדי לפתוח את הגולגולת באמצעות חתך בקו האמצע, ולאחריו שני חתכים צדיים משמאל ומימין מאחורי העיניים. השתמש בפינצטה זוויתית כדי לקלף את הגולגולת העוטפת ובשפכטלה כדי להתחיל להוציא את המוח. הוצא את המוח על ידי חיתוך עצבי הטריגמינוס באמצעות השפכטלה, והעבר את המוח לחצי התחתון של צלחת פטרי בנפח 60 מילימטר המכילה 10 מיליליטר של תמיסת מלח מאוזנת של גייז (gaze balanced salt solution) סטרילית וקרה, בתוספת גלוקוז.בשלב הבא, השתמשו בפינצטת IOx מספר 5 תחת מרית איריס מספר 2 כדי לבלוט את ההיפוקמפוסים מכל המיספירה והניחו אותם על דיסק טפלון עבור קוצץ המקילוויין (McIlwain chopper). בעזרת המרית, התירו את המצע מרקמת המוח והשתמשו בקוצץ כאשר עובי החיתוך מכוון ל-350 עד 400 micrometers. חתכו את ההיפוקמפוסים בניצב לציר האורכי שלהם בעזרת perpet של 1 milliliter בתנועות מהירות.שטפו את הפרוסות שזה עתה נחתכו מההסמנים העשויים טפלון אל תו החלק העליון של צלחת פטרי בנפח 60 מילימטר המכילה cold gaze BSS. הניחו את הפרוסות תחת מיקרוסקופ סטריאו ובחנו אותן. זהו את הפרוסות שבהן ה-dentate gyrus ושכבת ה-parametal cell שלמים.לאחר מכן, הניחו בעדינות את שלוש הפרוסות הגדולות ביותר על גבי תושב (insert), והכינו סך כולל של 12 פרוסות לכל פופ (pop). מקמו את התושבים במגש בעל שישה בארות והדגרימו בטמפרטורה של 36 degrees Celsius בכל שלושה עד ארבעה ימים. רעננו את מצע הגידול על ידי החלפת המצע הישן במצע טרי וחם.החזירו את התאים לאינקובטור בטמפרטורה של 36 מעלות לאחר שבעה ימים. החליפו את המצע ב-1.1 milliliters של מצע neuro Basal מועשר ללא סרום. ביום 18, בדקו את החיוניות של תרביות הפרוסות.התחילו בהעברה של 1.1 milliliters של ox poel למנות של six well culture dishes. הניחו את הצלחת באינקובטור כדי לחמם אותה ל-36 degrees Celsius. בינתיים, הדליקו מקור אור פלואורסצנטי עם fitzy filter עבור המיקרוסקופ והמתינו לחימומו במשך 20 דקות לפחות.פעולה זו תבטיח עוצמת תאורה אחידה. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי להניח את תבתי תרביות הפרוסות בתוך המצע למשך 10 דקות. לאחר מכן, העבירו אותם בחזרה למצע ללא SIM.הנח את תבנית התרבית עלבמת המיקרוסקופ וסמן את הכיוון כדי לסנן נזקים בלתי הפיכים בשכבה הפראמטלית. הנח את התרביות על משטח אספטי של מיקרוסקופ הפוך תחת הגדלה של five x, כאשר הפרוסות נשמרות בכיוון דומה לזה ששימש לבדיקה המקדימה.עברו לקוביית פליטת הציטציה FIT CX. בחרו תרביות שיש בהן פחות מ-30 תאים חיוביים ל-cytx באזור ca one עבור התניה לקור. העבירו 1.1 milliliters של מצע ללא סרום לצלוחית תרבית בעלת שישה בארות והניחו את הצלוחית באינקובטור בטמפרטורה של 30 °C עם 5% carbon dioxide ו-95% לחות למשך 20 דקות לפחות כדי לאפשר למצע להגיע לשיווי משקל; לאחר שחלפו 20 דקות.הוצא את מצע השיווי מהאינקובטור. העבר את תבתי התרבית עם הפרוסות ממצע ללא סרום רגיל למצע בטמפרטורה של 30 מעלות. לאחר מכן, הנח אותן באינקובטור של 30 מעלות למשך 90 דקות לאחר האינקובציה.החזירו את תרביות הפרוסות למצע הרגיל ללא סרום והדגירו בטמפרטורה של 36 degrees למשך 24 שעות. התחילו את הסינון המקדימה לשימוש ניסיוני בתרבית הפרוסות על ידי העברת תבתי התרבית למצע cyt למשך 20 דקות. בזמן שהפרוסות מדגירות, הדליקו את מנורת העל-סגול (ultraviolet) ואת מצלמת ה-CCD ואפשרו להן להתחמם במשך 20 דקות.במידת הצורך, השתמש בתוכנה כדי לנקות את ה-CCD על ידי חשיפה לאור למשך 50 מחזורים. לאחר מכן, טפטף תמיסה של 10 µL של fluorescein ב-90 µL של PBS אל תוך hemo cytometer בעומק 100 µm והנח אותו על בסיס המיקרוסקופ. באמצעות התוכנה, כוון את זמן החשיפה כך שהטווח הדינמי יהיה 1,000 מתוך 4,096.כעת הניחו את הצלחת עם תרביות הפרוסות שעברו התנייה מוקדמת בקור על המיקרוסקופ ורכשו תמונות. אלו ישמשו לקביעת רמת הפלואורסצנציה של הרקע, אשר תופחת מהפלואורסצנציה הנפלטת מפרוסות פגועות. אם ההתנייה המוקדמת בקור עצמה גרמה לפגיעה, ייראו בשלב הבא תאים בעלי פלואורסצנציה מוגברת.כדי לבחון את השפעת הפגיעה ה-ExoToxic, העבירו את התבניות (inserts) למצע נטול סרום המכיל 20 עד 50 micromolar NMDA שהובא לטמפרטורה של 36 degrees Celsius למשך 20 דקות לפחות. דגרו למשך 60 דקות בטמפרטורה של 36 degrees Celsius; ה-NMDA מחקה את השפעותו של הנוירוטרנסמיטור גלוטמט. לאחר הדגירה, שטפו את ה-NMDA מהתבניות על ידי טבילה של כל תבנית שלוש פעמים בשלוש צלחות נפרדות של 60 millimeter.כל אחד מכיל 10 milliliters של מצע neuro basal המחומם ל-36 °C. אין להשתמש ביותר משלושה סמי-מבני התכנסות (inserts) עבור כל סט של כלי שטיפה בנפח 360 millimeter. לאחר השטיפה, הניחו את הסמי-מבנים במגש המכיל מצע טרי והחזירו אותם לאנקובטור בטמפרטורה של 36 °C.לאחר 24 שעות, כייל את המצלמה באמצעות סטנדרט פלואורסצאין כפי שבוצע קודם לכן. לאחר מכן, העבר את התרביות למצע OX למשך 20 דקות לפני הצילום. אם רמות הפגיעה נמוכות יום אחד לאחר הפגיעה, הארך את הניסוי לשניים עד שלושה ימים לפי הצורך, כדי לכמת את הפגיעה באמצעות תוכנת metamorph.הגדירו אזור עניין (area of interest) סביב אזור CA one כדי למדוד את העוצמה של אזור נבחר עבור הפגיעה. העתיקו והדביקו את אזור העניין מהתמונה של הפגיעה לתמונת הרקע. לאחר מכן, הזינו את הערכים מהפגיעה ומהרקע ל-excel באמצעות תוכנה סטטיסטית.חשבו את המונה פחות הרקע עבור תרביות ביקורת ותרביות שעברו התנייה מוקדמת בקור, והריצו את המבחן הסטטיסטי המתאים להשוואת הפגיעה בקבוצה הניסיונית לעומת קבוצת ביקורת, אשר יש לכלול תמיד בכל הרצה ניסיונית. תמונה זו מציגה צביעה טיפוסית של תרבית פרוסות היפוקמפוס בוגרות לאחר 21 ימים של תרבית in vitro. סימון של קצוות חדשים המוצג בירוק משמש להדגמת הארכיטקטורה התאית של הנוירונים העיקריים.נוירונים פירמידליים מוצגים באזורים ca one ו-ca three של ההיפוקמפוס, ונוירוניהן של הפיתול המשנני או DG נראים כאן משמאל. אזור CA one המוצג בהגדלה ממחיש את המבנה המסועף של מיקרוגליה רדומה. בתוך תרביות של פרוסות בוגרות, התאים סומנו עם הסמן של פני השטח של המיקרוגליה CD 11 B. איור זה מראה את ההשפעות של התנייה מוקדמת לקור, נוירופרוטקציה, ותרביות פרוסות היפוקמפוס שדוגנו עם סמן cytx green לתאים מתים.תמונות הבדיקה המוקדמת משמאל אינן מראות פגיעה ב-ca one כאן. בתארים העליונים מוצגות תרביות ביקורת דמה (Sham control), ובתארים התחתונים מוצגות תרביות שעברו עיבוד מקדים בקור (cold preconditioned). התמונות בשורה האמצעית מראות פגיעה יחסית בתרבית הפרוסות 24 שעות לאחר חשיפה ל-20 micromolar NMDA.שימו לב כי הפגיעה בקבוצת הביקורת (sham control) גדולה מזו של תרביות שנחשפו להתנייה מקדימה בקור (cp). סרגל כיול צבעי הפגיעה היחסית מוצג בתמונה השמאלית העליונה. באופן מסורתי, התרביות נחשפות לאחר מכן לרמה מקסימלית של פגיעה, כגון 20 µM של MDA למשך הלילה, כדי למקסם את רמות הפגיעה הנוירונלית ב-CA1 ואת הפגיעה היחסית של התנייה מקדימה בקור לעומת ביקורת, המצוינת כיחס בין הפגיעה לפגיעה המקסימלית.עם זאת, חשיפה לגירויי פגיעה מקסימליים עשויה שלא להספיק כדי להתגבר על ההגנה העצבית (neuroprotection) הנובעת מהתניית מקדימה (preconditioning). בהתאם לכך, שימוש ביחסים שבין הפגיעה לפגיעה המקסימלית עשוי שלא לשקף במדויק את ההגנה העצבית מההתנייה המקדימה. דבר זה ניכר בתמונות בצד ימין, המראות כי הרמות המקסימליות בהתנייה מקדימה בקור נמוכות מאלו של קבוצת הביקורת (sham).במחקר זה נמצא כי שימוש ביחסים בין הפגיעה לבין הפגיעה המקסימלית עלול להסוות נוירופרוטקציה הנובעת מקונדיציונית קרה. ניתן לראות זאת מהסכימה, שבה פגיעה דמה מוצגת באדום ופגיעה לאחר קונדיציונית קרה מוצגת בכחול יום אחד לאחר חשיפה ל-NMDA; נמצא כי רמת הפגיעה בקונדיציונית קרה הייתה 3, בהשוואה לרמה של 5 שנצפתה בביקורת הדמה. נתון זה עולה בקנה אחד עם 40% נוירופרוטקציה.עם זאת, במידה ונעשה שימוש בפורמט מסורתי המשתמש ביחסים כגון פגיעה ביחס לפגיעה מקסימלית, לא ניכרת הגנה. במילים אחרות, 50% עבור קבוצת השם (sham) לעומת 50% עבור קדם-קירור (cold preconditioning). Quantitative PCR בוצע באמצעות דגימות mRNA כפי שמוצג כאן.רמות של TNF alpha לאחר התניה קרה, המיוצגות על ידי הקו הכחול, היו גבוהות יותר מאשר בקבוצות הביקורת, המיוצגות על ידי הקווים הירוקים, הצהובים והסגולים. דבר זה מרמז כי התניה קרה מעוררת ייצור מוגבר של TNF alpha במוח; כדי לאשר את תוצאות ה-quantitative PCR וה-quantitative PCR array, בוצעה צביעה אימונולוגית. תרבית פרוסה זו עובדה עבור interleukin 11 המוצג באדום, ו-NeuN כדי להראות נוירונים המוצגים בירוק.שימו לב כי חלק מהנוירונים הפרה-מטאלים (parametal neurons), המסומנים על ידי החצים, מראים צביעה של interleukin 11 ו-new end ומוצגים בצבע צהוב. החצים מצביעים על מספר תאים קטנים יותר, אשר ההנחה היא שהם אסטרוציטים, המראים רק עלייה בצביעה של interleukin 11. בתיאור מערכת השליחויות של הציטוקינים המעורבת בנוירופרוטקציה על ידי התניה מוקדמת בקור, חשוב לציין מספר מושגים חשובים מיסודם.למרות שציטוקינים נמצאים בריכוזים נמוכים ביותר במוח רגיל, שינויים קטנים בריכוזי הציטוקינים משנים את ביטוי הגנים. לפיכך, גם בריכוזים נמוכים, לציטוקינים יש פוטנציאל עצום לשנות את מבנה המוח ותפקודו, ובכך את הפנוטיפ של האורגניזם. מושג זה מיוצג כאן על ידי ההופכי של המרחק, כאשר שערת חתול משמשת כנקודת ייחוס, ונתוני נתרן, אשלגן, pH וסידן מושווים ל-TNF alpha.חשוב לזכור גם שציטוקינים הם בעלי רב-גיוון (redundant) ובעלי השפעות מרובות (pleiotropic); מספר ציטוקינים עשויים להשפיע באופן דומה, וציטוקין בודד עשוי להוביל להשפעות משתנות. לפיכך, כדי לבסס באופן מדויק את הבסיס הציטוקיני המולד להגנה עצבית (neuroprotection) כתוצאה מה conditioning קריר, יש לקבוע ניתוח מורכב של משתני איתות קשורים. הדבר מתבצע באמצעות אסטרטגיות של בדיקות multiplex, שיקבעו את חתימת הציטוקינים של ההגנה העצבית הנובעת מה conditioning קריר. לאחר השליטה בשיטה, ניתן להכין תרביות אלו בתוך כשלוש שעות וביצוע מניפולציות לצורך מחקר.ניתן לבצע את התגובה לה conditioning קריר לאורך כ שלושה ימים. בעת ביצוע הליכים אלו, חיוני לזכור כי נדרשים טכניקות סטריליות וטיפול מינימלי כדי לשמר את היכולת לזהות איתות פרו-דלקתי ברמה נמוכה לאחר הליכים אלו. ניתן ליישם שיטות אחרות, כגון אנליזות פרוטאומיות וביולוגיה מולקולרית, על התרביות כדי לפענח את האמצעים שבאמצעותם ל-conditioning קריר יש השפעה תזונתית ומגנה על המוח.

strategies-for-study-of-neuroprotection-from-cold-preconditioning

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

יש מצטבר ראיות, שנפשי מראש איסכמי (PC) - אתגר איסכמי שאינו מזיק למוח - מעניק הגנה זמנית לעלבון איסכמי מזיק שלאחר מכן. הקמנו הבילטרלי חסימת עורק תרדמה משותפת (BCCAO) כגירוי נפשית מראש כדי לגרום לסובלנות איסכמי מוקדם (IT) לאיסכמיה מוחית מוקדי חולפים (הנגרם על ידי חסימה של עורק מוח אמצעי, MCAO) בC57BL6 / י עכברים.

ספיגה דו צדדי משותף עורק תרדמה כגירוי נפשית מראש מספיק כדי לגרום סובלנות איסכמי מוקדמת לאיסכמיה מוחית מיקוד

מקור: Zheng, Y., et al. מודלים ניסיוניים לחקר ההגנה העצבית של התניה חומצית מפני איסכמיה מוחית. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את היישום של התניה לאחר חומצה (APC) כדי להעריך את ההשפעות הנוירו-פרוטקטיביות שלה מפני פגיעה איסכמית במודל עכבר של חסימת עורק המוח האמצעי (MCAO). הוא מתאר את השלבים הכרוכים ברפרפוזיה במודל MCAO ויישום APC במהלך רפרפוזיה, כדי להפחית אקסיטוטוקסיות, מתח חמצוני ומוות עצבי.

 הערכת ההשפעות הנוירו-פרוטקטיביות של התניה חומצית במודל עכבר של איסכמיה מוחית

מקור: Poinsatte, K., et al., כימות הגנה נוירו-וסקולרית בעקבות התניה מוקדמת היפוקסית חוזרת וחסימת עורק מוח אמצעי חולף בעכברים. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים את השיטה של התניה מוקדמת היפוקסית חוזרת (RHP) על ידי חשיפת עכבר למחזורי היפוקסיה מבוקרים לפני גרימת שבץ איסכמי. הניסוי מעריך את השפעותיו על יציבות מחסום הדם-מוח, הסתגלות עצבית ודלקת.

הסתגלות עצבית להתניה מוקדמת היפוקסית חוזרת בעכברים

מקור: Brandli, A. התניה מוקדמת איסכמית של גפיים מרוחקות: טכניקה נוירו-פרוטקטיבית במכרסמים. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים פרוטוקול התניה איסכמית לא פולשנית של גפיים בחולדות כדי לגרום להגנה עצבית מערכתית. ההליך כולל חסימת עורקים מבוקרת ורפרפוזיה, המפעילה מסלולי לחץ תאיים המשחררים גורמי הגנה. גורמים אלה משפרים את העמידות בפני פגיעות איסכמיות ומטבוליות באיברים מרוחקים כמו המוח והרשתית.

התניה מוקדמת איסכמית לא פולשנית של גפיים במודל חולדה להגנה עצבית

נפשית מראש איסכמי מרחוק (RIP) הוא שיטה של ​​רקמות אוויר נגד לחץ מזיק. הקמנו שיטה של ​​איסכמיה מרחוק בגפיים האחורי, על ידי ניפוח שרוול מד לחץ דם למשך 5-10 דקות. יכולות ההגנה העצביות של RIP הוכחו במודל של ניוון רשתית במכרסמים.

איבר מרוחק איסכמי אכשור קד: טכניקת neuroprotective במכרסמים

פרוטוקול זה מתאר התניה מוקדמת היפוקסית חוזרת ונשנית, או חשיפות קצרות להיפוקסיה מערכתית המפחיתות את נפחי האוטם והפרעה במחסום הדם-מוח בעקבות חסימה חולפת של עורק המוח האמצעי בעכברים. הוא גם מפרט כימות כפול של נפח האוטם והפרעה במחסום הדם-מוח לאחר שבץ מוחי כדי להעריך את היעילות של הגנה נוירו-וסקולרית.

כימות של הגנת עצבים וכלי דם בעקבות חסימת עורק חוזר חוסר חמצן אכשור קד וחלוף התיכון מוחין של עכברים

חסימה כירורגי של ענף עורק דיסטלי באמצע המוח (MCAo) היא מודל משמש לעתים קרובות במחקר שבץ ניסיוני. כתב יד זה מתאר את הטכניקה הבסיסית של MCAo קבע, בשילוב עם הכניסה של חלון גולגולתי לרוחב, אשר מציעה את ההזדמנות עבור מיקרוסקופיה intravital אורך בעכברים.

הכנת חלון גולגולת כרוני לרוחב מאפשרת In vivo תצפית בעקבות העורקים התיכון ספיגה מוחין דיסטלי של עכברים

Accic postconditioning מגן מפני איסכמיה מוחית. כאן אנו מציגים שני מודלים לביצוע APC. הם מושגים בהתאמה על ידי העברת פרוסות corticostriatal למאגר חומצי לאחר מחסור בגלוקוז חמצן במבחנה ועל ידי שאיפה 20% CO 2 לאחר חסימת עורק המוח התיכון in vivo .

מודלים ניסיוניים לחקר הנוירו-פרוטקציה של התסמינים החומציים נגד איסכמיה מוחית

ומכניקה מורכבות בסביבות נטורליסטי הדורשים תיאום זהיר של הגפיים כולל אזורים של קליפת הקודקוד. הפרוטוקול הבא המתאר את השימוש הפיך קירור-induced הביטול כדי להדגים את התפקיד של אזור הקודקוד 5 ב מונחה זיכרון ממכשולים של החתול הליכה.

הפיכה Deactivations קירור-induced ללמוד תרומות קורטיקלית מכשול זיכרון של החתול הליכה

ההשפעות המובהק של דרגות שונות של היפותרמיה על הגנה שריר הלב לא הוערכו ביסודיות. מטרת המחקר הנוכחי הייתה לכמת את רמות המוות התאי בעקבות טיפולי היפותרמיה שונים במודל מבוסס קרדיומיוציטים אנושיים, ולהניח את היסודות למחקר מולקולרי מעמיק בעתיד.

אין ויטרו הערכה של הגנה שריר הלב בעקבות היפותרמיה-תנאים מקדים במודל מיוציטים לב אנושי

מאמר זה מתאר שתי שיטות של אינדוקציה היפותרמיה לכל הגוף קצר בחולדות. שיטת האינדוקציה הראשונה, המהירה, משתמשת בקירור פעיל באמצעות מאווררים ותרסיס אתנול לירידה מהירה בטמפרטורה. השיטה השנייה היא שיטת קירור הדרגתית. זה מושג באמצעות השילוב של הרדמה איזופלוריין והפחתת הגדרות הטמפרטורה על מחצלת החום ההומיאותרמית. התוצאה היא ירידה הדרגתית בטמפרטורת הגוף הליבה ללא שימוש במכשירי קירור...

אינדוקציה היפותרמיה משך זמן קצר בחולדות באמצעות מודלים למחקרים הבוחנים רלוונטיות קלינית ומנגנונים

חקור מנגנוני נוירו-חיסון בחתכי היפוקמפוס של עכברושים לזיהוי מטרות טיפוליות להגנה על המוח לפני פציעה נוירולוגית. השיטה מודדת ציטוקינים פרו-דלקתיים ברמות נמוכות.

אסטרטגיות לחקר neuroprotection מן הקרה נפשית מראש

גלה סרטונים נוספים