מיקרוסקופיה confocal קרנית: שיטה חדשנית לא פולשני לכמת סיב פתולוגיה קטנים neuropathies היקפיים
3 בינואר 2011
מיקרוסקופיה Confocal קרנית היא טכניקה לא פולשנית קליניים אשר עשויים לשמש לכמת נזק C סיבים לאבחן לרבד חולים עם חומרת נוירופתי גוברת.
סרטון זה מדגים הליך לדימות סיבי C בקרנית באמצעות טכניקת מיקרוסקופיה קונפוקלית של הקרנית (CCM), שהיא טכניקה לא פולשנית המאפשרת כימות של נזק לסיבי העצב. ראשית, מותאם מישור המיקוד של העדשה ב-CCM ומוחל ג'ל דמעות ויסקוזית על העדשה לפני התקנת הכובע החד-פעמי. לאחר מכן, מוחלים טיפות הרדמה וג'ל דמעות ויסקוזית על העין.
בשלב הבא, המצלמה מכווננת כך שייוצר מגע בין הג'ל בחלק הקדמי של העדשה לבין קרנית המטופל. לבסוף, עומק מישור המיקוד מכוונן ותופסות תמונות של עצבי הקרנית מהחלק המרכזי של שכבת בומן (Bowman's layer). ניתן להבחין בשינויים מורפולוגיים בסיבי עצבי הקרנית כדי לכמת נוירופתיה.
זוהי טכניקה חדשנית מאוד אשר למעשה שימשה בעבר בעולמות האופטומטריה והאופתלמולוגיה, אך במהלך שמונה השנים האחרונות השתמשנו בה ביעילות רבה כדי לחקור ולהעריך נוירופתיה סוכרתית ונוירופתיות פריפריאליות אחרות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לכמת נזק בסיבים קטנים בשלב מוקדם מאוד, ולאחר מכן לסווג את חומרת הנוירופתיה אצל המטופלים באופן לא פולשני לחלוטין; ניתן לעשות זאת במהירות רבה באמצעות סריקה של שתי דקות, אותה ניתן לכמת במונחים של חומרת הנוירופתיה. לפיכך, אנו מקווים כי שיטה זו תחליף חלק מהטכניקות הפולשניות הרבה יותר, כגון ביופסיית עור וביופסיית עצב. למרות שהיא נראית כטכניקה פשוטה באופן כללי, היא דורשת למעשה שלבים מוגדרים כדי ללכוד את התמונה באופן אופטימלי ולאחר מכן לכמת אותה.
אנו מעוניינים להפוך את התהליך כולו לברור ושקוף עבור כל מי שירצה להשתמש בטכניקה זו. השלב הראשוני בבדיקה באמצעות מיקרוסקופ הקונפוקליות של הקרנית מדגם HRT הוא הכנת קצה עדשת העצם בצינור העצמה של מצלמת הסריקה בלייזר. הגדירו את השבירה ל-12+ דיופטרים, לאחר מכן כווןו את המצלמה למצב הנמוך ביותר ונעלו את העדשה על ידי סיבובה נגד כיוון השעון.
יש להניח טיפה גדולה, הומוגנית וללא בועות בגודל P של visco tears על קצה העדשה. יש להוציא tomo cap מהמכל הסטרילי שלו ולהרכיבו מעל קצה העדשה רחוק ככל האפשר מעל התושבת, כך שהג'ל ייצור מניסקוס בין עדשת האובייקטיב לבין ה-cap. יש להיזהר לא לגעת במשטח הקדמי של ה-tomo cap במהלך ההרכבה.
כעת, העבירו את מצלמת סריקת הלייזר לאחור ככל האפשר על תושבת המצלמה אל פני השטח הפנימיים והחיצוניים של מכסה הטומו (tomo cap). שניהם יופיעו כהשתקפות לייזר בהירה על מסך התצוגה. כווןו את גלגל התאמת מישור המוקד עד שתצפיתו השתקפות בהירה, המעידה על כך שהעדשה ממוקדת בחלקו הקדמי של המכסה.
ערך העומק המוצג בתצוגת מיקום המיקוד צריך להיות כעת בין 150- מיקרומטרים ל-150+ מיקרומטרים. אפס את הגדרת העומק. כעת נראה כיצד להכין את המטופל.
לאחר הרדמת עיני הנבדק באמצעות טיפה של 0.4%ate hydrochloride, יש לשמן את קדמת העין עם visco tears. מקמו את הנבדק בנוח כאשר סנטרו נשענת על משענת הסנטר, תוך וידוא שמצחם נלחץ בחוזקה אל מוט המצח. הבדיקה הופכת לקלה יותר כאשר המטופל מודחה להתרכז באור הקיבוע החיצוני.
בזמן שהעין אינה נבדקת, גודלו הקומפקטי של ראש המיקרוסקופ מבטיח שהעין הנגדית של הנבדק אינה חסומה. דבר זה מאפשר שימוש במטרות מרחק. מקם את מצלמת ה-CCD כך שהגישה האופטית שלה תהיה ניצבת לגישה האופטית של מצלמת הסריקה בלייזר.
בעת הדמיית העין הימנית, המצלמה צריכה להיות בצדו הימני של המטופל, ולהיפך. במיקום זה, פני השטח הקדמיים של מכסה ה-tomo נראים במרכז מצלמת ה-CCD. תמונה חיה.
הזז את מצלמת הסריקה בלייזר לכיוון המטופל עד שהקרניית המטופל תהיה במרחק של כ-5 עד 10 מילימטרים ממכסה ה-tomo. לאחר מכן, השתמש בכפתורי כיוון הגישה האנכיים והאופקיים על תושבת המצלמה כדי להזיז את מצלמת הסריקה בלייזר למעלה ולמטה ושמאלה וימינה, עד שמכסה ה-tomo ימוקם במרכז קרנית המטופל. כעת בקש מהמטופל לפקוף את עיניו לרווחב ככל האפשר.
הנח slowly את מצלמת הסריקה בלייזר לכיוון המטופל עד שכיסוי הטומו (tomo cap) בא במגע עם קרנית המטופל. בשלב זה, וודא שאור הלייזר האדום נמצא במרכז הקרנית ושההשתקפות של קרן הלייזר מהקרנית מתרחשת בדיוק בקוטב הקדמי (anterior pole) של הקרנית. עם כיוון אופטימלי, נקבל מגע מינימלי בין העדשה לקרנית.
גשר ג'ל דק בין מכסה הטומוגראפיה לקרנית נראה בתמונת החיים של מצלמת ה-CCD. אם קיים לחץ רב מדי בין מכסה הטומוגראפיה לקרנית, תופיע מראה שטוחה של הקרנית בתמונת מצלמת ה-CCD. תמונת החיים והסטראייר (strayer) מופיעים בתמונת ה-CCM.
לאחר התאמת המטופל, הפעל את מצלמת הלייזר המשולשת HR three; חלון רכישת התמונות יופיע על המסך. השתמש בתמונת ה-CCD כדי למקם את ה-tomo cap ואת אור הלייזר על קרנית המטופל. ל-CCM יש שלוש אפשרויות לצילום תמונות.
סריקת הרצף מאפשרת רכישה של עד 100 תמונות בקצב פריימים ניתן לכיוונון. נבחר קצב פריימים שבין 30 ל-1 פריים לשנייה. על בסיס זה, ניתן לרכוש סרטון באורך של 3 עד 100 שניות.
במצב סריקת נפח (volume scan), המצלמה רוכשת באופן אוטומטי סדרה של 40 תמונות במישורי מוקד עוקבים. ניתן לסרוק עומק כולל של 85 micrometers, והמרחק המוקדי בין שתי תמונות עוקבות הוא כ-2.1 micrometers. האפשרות האחרונה היא מצב חיתוך (section mode), שבו נעשה שימוש בניסוי זה.
מצב זה מאפשר דימות אופטימלי עם תמונות בודדות וברורות שנרכשות ונשמרות בכל לחיצה על מתג הרגל. מצב זה משמש ללכידת תמונות מכל שכבת הקרנית, כולל שכבת בומאן (Bowman's layer) במרכז הקרנית. לאחר לכידת מספר מספיק של תמונות, ניתן להשתמש במצבים אחרים, כולל רצף ונפח.
לאחר מספר סריקות, ניתן לשנות את מישור המוקד של העדשה כדי למדוד את העומק של שכבת תאי קרנית ביחס לפני השטח של הקרנית, זאת על ידי הבאת שכבת התאים האפיתליים למיקוד ולאחר מכן לחיצה על כפתור האיפוס (reset) כדי להגדיר את ערך העומק לאפס. עם סיום הבדיקה, כבה את המצלמה באמצעות לחיצה על כפתור ההפעלה של המצלמה בחלון הרכישה. הפיק את המטופל או המטופלת לכך שלא יעבירו את עיניהם עד להסרת השפעת ההרדמה המקומית.
הסר את מכסה ה-tomo מהמצלמה, השלך אותו, ולאחר מכן נקה את עדשת המיקרוסקופ באמצעות מקלון צמר גפן טבול במים מזוקקים. כעת נראה כיצד לנתח תמונה ולכמת פרמטרים של סיבי עצב כדי לסקור ולנתח בדיקות קיימות. ראשית, בחר את רשומת המטופל המתאימה בחלון מסד הנתונים.
חלון הצפייה בתמונות מספק סקירה כללית של בדיקות קרנית קיימות עבור המטופל שנבחר. בדיקות שבוצעו בימים שונים נשמרות בלשוניות ביקורים נפרדות. שלושת סוגי הסריקה השונים מיוצגים על ידי שלושה סמלי אייקונים שונים. בלשונית ביקורי קרנית HRT 3 בחלון הצפייה בתמונות של ה-Heidelberg Eye Explorer.
כדי לסקור את תמונת הקרנית, יש ללחוץ פעמיים על סמל התמונה המתאים ולאחר מכן ללחוץ על show now כדי לייצא את התמונות הרלוונטיות לניתוח נוסף; לחצו על export בסרגל הכלים ולאחר מכן בחרו את התיקייה לשמירת התמונות. מכיוון שהמיקוד המרכזי של מחקר זה הוא בשכבת בומאן (Bowman's layer) ובעצבי הקרנית, רק תמונות משכבה זו ינותחו. עבור כל נבדק נבחרים חמישה עד שישה פרייםים משכבת בומאן בעומקים שונים של הקרנית.
ניתוח תמונות מבוצע באמצעות תוכנה ייעודית שפותחה על ידי הקבוצה שלנו הנקראת CCM Image Analysis Tools, גרסה 0.64. הפרמטרים העיקריים עבור עצבי הקרנית נמדדים באמצעות התוכנה כצפיפות סיבי עצב, המוגדרת כמספר העצבים הראשיים לכל פריים. צפיפות ענפי העצבים היא המספר הכולל של הענפים הראשיים לכל פריים.
אורך סיב העצב הוא האורך הכולל של העצבים הראשיים והענפים הראשיים לכל סיב עצב במסגרת. טורטואוסיות (מפותלות) היא המידה של התפתלות העצבים הראשיים לכל מסגרת. כדי לפתוח תמונת CCM, עברו לקובץ ולאחר מכן בחרו בפתיחה.
לאחר טעינת התמונה, גודלה וסוגה מוצגים בתיבת מידע התמונה בצד שמאל למעלה של פאנל הבקרה, וקנה המידה ברירת המחדל מוצג בשורת העריכה של מידע התמונה. אם קנה המידה שונה, שנו את המספר בשורת העריכה. כדי להתחיל בניתוח התמונה, בחרו את הפרמטר שברצונכם למדוד מתיבת המדדים בצד ימין למעלה של פאנל הבקרה.
בתיבת התוצאות בתחתית הדף, NFD ו-MBD מוצגים כמספר ממשי. NFL מוצג במילימטרים והפיתול (tortuosity) מוצג כמקדם פיתול. ניתן לייצא את התוצאות לגיליון Excel.
בעת פתיחת דף ה-Excel, התוצאות יוצגו כמספר למילימטר רבוע עבור NFD, מילימטרים למילימטר רבוע עבור NFL, ומקדם עקמומיות עבור NFT. כדי לבצע מדידות אלו, התחילו בסימון כל עצב ראשי, לאחר מכן סמנו כל ענף של עצב ראשי. לבסוף, התקיפו (trace) כל עצב בפריים.
ניתן להשתמש בעט דיגיטלי לדיוק גבוה יותר. ברגע שהטכניקה נלמדת, ניתן לבצעה תוך דקה אחת אם היא מבוצעת כראוי בעת ניסיון לבצע הליך זה. חשוב להישמע להוראות המפורטות.
לאחר צפייה בסרטון זה, אנו מקווים כי רכשתם הבנה טובה לגבי אופן העבודה והצילום של שכבת התנועה בקרנית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של הקרנית, וכן לגבי כימות וניתוח התמונות משכבה זו בחולים עם נוירופתיה פריפרית, ובמיוחד נוירופתיה סוכרתית. ואינכם שוכחים כי עבודה עם CCM דורשת מומחיות, ומומלץ כי אנשי מקצוע המוכשרים בבדיקת עיניים יבצעו את הפרוצדורה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
סרטון זה מדגים פרוצדורה לדימות של סיבי C בקרנית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של הקרנית (CCM), טכניקה לא פולשנית לכימות נזק בסיבי העצב. השיטה מאפשרת להעריך שינויים מורפולוגיים בסיבי העצב של הקרנית, ובכך מסייעת באבחנה ובסיווג של חומרת הנוירופתיה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- דימות קליני
- הערכה של כאב נוירופתי
רקע
- מיקרוסקופיה קונפוקלית של הקרנית היא טכניקה לדמיון לא פולשנית.
- היא משמשת להדמיית סיבי העצבים בקרנית.
- כימות של נזק עצבי יכול לסייע באבחון נוירופתיות.
- הבנת המורפולוגיה של סיבי העצב היא קריטית לסיווג חולים.
מטרת המחקר
- להדגים את הליך הדימות של סיבי C בקרנית.
- לאפשר כימות של נזק לסיבי העצב בחולים.
- להדגיש את החשיבות של CCM בהערכת חומרת הנוירופתיה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- התאמת מישור המוקד של העדשה ב-CCM.
- מריחת ג'ל דמעות ויסקוזי על העדשה ועל העין.
- שימוש בטיפות אלחוש לפני הצילום.
- לכידת תמונות מהחלק המרכזי של שכבת בומן (Bowman's layer).
תוצאות עיקריות
- הושגה הדמיה מוצלחת של סיבי C בקרנית.
- נצפו שינויים במורפולוגיה של עצבי הקרנית.
- הטכניקה אפשרה כימות של הנזק העצבי.
- CCM הוכחה כיעילה להערכת חומרת הנוירופתיה.
מסקנות
- מיקרוסקופיה קונפוקלית של קרנית היא כלי בעל ערך בפרקטיקה קלינית.
- הטכניקה מסייעת באבחנה ובניהול של נוירופתיות.
- מחקרים נוספים עשויים לשפר את ההבנה של נזק עצבי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
מיקרוסקופיה קונפוקלית של קרנית (CCM) מאפשרת כימות לא פולשני, in vivo, של פתולוגיה בסיבים קטנים, ובכך נותנת מענה לפער קריטי באבחון מוקדם של נוירופתיות פריפריות. על ידי אספקת מדדים אובייקטיביים וניתנים לשחזור של צפיפות סיבי עצב, צפיפות הסתעפויות, אורך ועקמומיות (tortuosity), ה-CCM תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בתהליכי תיקוף מטרות ובביטחון חיזוי בבחירת מודלים פרה-קליניים. הדבר ממצב את ה-CCM ככלי לסמן ביולוגי תרגומי עם רלוונטיות ישירה לפיתוח בדיקות לכאב נוירופתי ולמסלולי סינון תרופתיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות כימות נזק מוקדם של סיבים קטנים הקודם לאובדן האפידרמיס.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות ויזואליזציה ישירה של תיקון ודגנרציה של סיבי עצב לא ממיאלינתיים.
- ערך ניבוי: משפר את תעדוף תיקי הפיתוח באמצעות סיווג חומרת הנוירופתיה וניטור רגנרציה לאחר התערבות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עבור תהליכי עבודה המשכיים באמצעות דימוג סטנדרטי של עצבי הקרנית בשכבת בומן (Bowman's layer).
- פלט כמותי: מספק תוצאות מספריות הניתנות לשחזור (צפיפות סיבי עצב, צפיפות הסתעפויות, אורך, עקמומיות), החיוניות לסטנדרטיזציה של הבדיקה.
- אפשרות לסריקה: מאפשר הערכה אמינה של תרכובות באמצעות סריקות מהירות ולא פולשניות שנמשכות שתי דקות, המתאימות למחקרים ארוכי טווח.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: תועלת מוכחת בנוירופתיה סוכרתית, נוירופתיה אידיופטית של סיבים קטנים ומחלת פברי, התומכת במידול מערכות רלוונטיות למחלה.
- המשכיות תרגומית: מגשרת בין שלב הגילוי לוולידציה פרה-קלינית על ידי שיקוף של הערכת סיבי עצב קלינית במערכות מודל.
- קידום מותאם סיכון: מספקת בסיס להחלטות go/no-go על ידי כימות תיקון העצבים בעקבות התערבות טיפולית (למשל, השתלת לבלב).
שילוב תהליכי עבודה ו-Pipeline
CCM משתלב ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה דרך זיהוי המולקולה המובילה ועד לבדיקות יעילות פרה-קליניות, במיוחד כאשר פתולוגיה של סיבים קטנים משמשת כמדד מכניסטי.
- ביולוגיה של התגליות: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי זיהוי הנזקים המוקדמים ביותר לסיבים קטנים במודלים נוירופתים.
- סריקה: מבטיח מוכנות של הבדיקה ויכולת שחזור באמצעות לכידה וניתוח סטנדרטיים של מורפולוגיית העצבים בקרנית.
- אנליטיקה: מספק מדדים כמותיים הניתנים לייצוא (לכל mm²) המאפשרים השוואה בין תנאים שונים והערכה סטטיסטית.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית באמצעות התאמת סמנים ביולוגיים בסטריפיקציה של חומרת הנוירופתיה ומעקב אחר התחדשות.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמת דימות הניתנת לשימוש חוזר עבור אינדיקציות נוירופתיות שונות, ובכך מפחית את ההסתמכות על ביופסיות פולשניות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי באישור מטרה, צמצום עמימות מכניסטית בפתולוגיה של סיבים קטנים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת הרחבה של כימות סיבי עצב.
- ערך אסטרטגי: שיפור קבלת החלטות מסוג go/no-go, יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות לטיפול בנוירופתיה.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכון המבוסס על מדדי סיבי עצב לאורכיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדימוי עיני (ophthalmic imaging) ובאנטומיה של הקרנית.
- תלות במיקרוסקופ קונפוקאלי עם סריקה בלייזר בעל מישור מיקוד ניתן לכיוון ודימוי CCD.
- צורך בפרוטוקולים סטנדרטיים להרדמה ולמריחת ג'ל דמעות ויסקו (visco tear gel).
- שיקולי התאמה בין מינים שונים ושונות בעובי הקרנית.
- מגבלה מעשית: הכימות מסתמך על שרטוט ידני או חצי-אוטומטי של סיבי העצב בשכבת בומן (Bowman's layer).
