יצירת המושבה Cell (CFC) Assay עבור תאים hematopoietic האדם

הליך זה מעריך בתווך מוצק למחצה, את יכולתם של אבות המטופויאטיים להתרבות ולהתמיין לאורך שושלות המטופויאטיות שונות כדי להתחיל בתרבית. תאים חיוביים CD 34 שהופשרו לאחרונה בנוכחות ציטוקינים כדי לקדם הפעלה לאחר יומיים. בצע התמרה רטרו-ויראלית של מבנה בדיקת ביטוי GFP על ידי הוספת התאים החיוביים CD 34 המופעלים לצלחת טעונה מראש בנגיף.

48 שעות לאחר מכן יש לבודד את התאים החיוביים ל-GFP בפקס, ואז להצמיד את התאים הללו למדיום מתיל צלולוז מוצק למחצה בתוספת גורמי גדילה לדגור במשך כשבועיים עד להופעת מושבות על פני השטח. לבסוף, קצרו את המושבות, קבעו את התאים בשקופיות באמצעות ציטוזין וצבעו בגיזה הימנית לקביעה מיקרוסקופית של השושלת ההמטופויאטית ושלב ההתבגרות. שיטה זו יכולה לספק תובנה מכניסטית במחקרים על לוקמוגנזה, כלומר ההשפעות של אונקוגנים על התמיינות המטופויאטית.

על מנת לראות תרבית, יש להפשיר במהירות בקבוקון של תאים חיוביים קפואים CD 34 ב-37 מעלות צלזיוס על ידי ניעור עדין עד שנותר גביש קרח קטן אחרון ולהעביר את תרחיף התא לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. שטפו בעדינות את התאים הנותרים מהבקבוקון עם מיליליטר אחד של טמפרטורת החדר, 2% F-B-S-I-M-D-M והוסיפו אותו טיפה לצינור של 50 מיליליטר תוך כדי סיבוב עדין. עכשיו המתן שלוש דקות.

ממשיכים בהוספה איטית של שני מיליליטר מדיה תוך ערבוב עדין ושוב מאזנים למשך שלוש דקות. חזור על הליך זה של הוספת מדיה בנפח שווה לתרחיף התא המדולל במרווחי זמן של שלוש דקות, תוך הסתחררות עדינה בין הוספות עד שהנפח הסופי מגיע ל-32 מיליליטר כדי לאסוף את צנטריפוגת התאים ב-250 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר את הסופרנט ולהשאיר אחריו כ-0.5 מיליליטר של מדיה מעל הגלולה. המשך לשטוף את התאים פעם אחת על ידי השעיית הגלולה ב-20 מיליליטר מדיה וצנטריפוגה ב-200 גרם למשך שמונה דקות בטמפרטורת החדר, הסר את השפוי והשהה את התאים במדיום IMDM שלם בכחצי מיליון תאים למיליליטר.

לבסוף, כדי לקבוע את ריכוז התאים, קח 10 מיקרוליטר מהתרחיף לתוך צינור מיקרו מעורבב באותו נפח של 0.4% תמיסה כחולה טריאן וספירה. באמצעות ציטומטר המו מדללים את התאים ל-10 עד חמישית תאים למיליליטר על ידי הוספת מדיום IMDM שלם בתוספת תערובת של תרבית ציטוקינים מפעילה, התאים בחממה לחה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך יומיים ביום ספירת התמרה של תאים לפני תחילת טעינה מוקדמת של הנגיף כדי לקבוע את מספר הבארות שיש להכין על מנת להכין צלחת תרבית רקמה 24 באר שאינה מטופלת. הוסף 400 מיקרוליטר של 25 מיקרוגרם למיליליטר, תמיסת רטרו אקטין לכל באר ודגר במשך שעתיים בטמפרטורת החדר במכסה המנוע הביולוגי של הזרימה הלמינרית.

הסר את תמיסת הרטרו אקטין וקודד כל באר עם 2% BSA על ידי דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בינתיים, הפשירו את פתרונות מלאי הנגיפים ואחסנו על קרח. לאחר מכן שאפו את נגיף העומס של תמיסת BSA על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של הכנת וירוס לכל באר וצנטריפוגה ב-2,200 גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

הסר את תמיסת הנגיף מהבארות וחזור על טעינת הנגיף שלוש פעמים נוספות. לבסוף, יש לשטוף כל באר במדיום IMDM קר. כעת אספו את התאים החיוביים CD 34 שהופעלו מראש על ידי צנטריפוגה והשעו מחדש את התאים במדיום IMDM שלם טרי בתוספת ציטוקינים של 0.15 מיליון תאים חיוביים CD 34 לכל אחת מהבארות והבארות המקודדות לנגיף ודגרו באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך יומיים על מנת לקצור את התאים המומרים בעדינות אך ביסודיות.

השעו את התאים מהצלחות הצפות של הנגיף וסננו את התרחיף דרך מסנן תאים של 50 מיקרון לתוך צינור חרוטי. קח 10 מיקרוליטר מתרחיף התא לתוך צינור מיקרו. מערבבים עם נפח שווה של תמיסה כחולה טריאן וסופרים תאים באמצעות ציטומטר המו.

שוטפים כל באר עם 0.8 מיליליטר HBSS קר עם 0.02% EDTA ומוסיפים לאותו צינור איסוף דרך מסנן תאי CEL Trix 50 מיקרון. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ושטוף פעם אחת עם HBSS קר. השעו מחדש את גלולת התא הסופית ב-HBSS עם 1% BA והשאירו את התאים על הקרח בחושך למיון התאים הבא, המבוצע בדרך כלל במתקן ליבת מיון תאים במהירות גבוהה המבוסס על תכנון ניסיוני.

הפשירו את המספר הנדרש של מערבולת מדיה של בדיקת CFC במרץ כדי לערבב ולתת לצינור לעמוד לפחות חמש דקות כדי לאפשר לבועות לעלות לפני השטח לפני הוספת תאים. כעת קח 3000 תאים ממוינים שהומרו על ידי וירוס לתוך מיקרו צינור סטרילי המכיל מדיה קרה של 2% F-B-S-I-M-D-M והתאם את נפח ההשעיה הסופי ל-0.3 מיליליטר. השעו את התאים והעבירו את כל תרחיף התא ל-3 מיליליטר של מדיום גידול מתיל פולחן.

צור תרחיף תאים הומוגני על ידי מערבולת נמרצת. תן לצינור לעמוד במקום במשך שלוש דקות. על מנת לצלחת התאים, חבר מחט קצה קהה בגודל 16 למזרק של שלושה מיליליטר ושאב של 2.2 מיליליטר.

הקפידו להימנע מספיגת בועות גדולות, דחפו החוצה 1.1, מיליליטר כל אחד לשתי צלחות תרבית רקמות לא מטופלות בגודל 30 מילימטר ופזרו את התערובת באופן שווה על ידי סיבוב הניחו צלחות כפולות בצלחת של 100 מילימטר יחד עם צלחת מים. המשך שלושה ליטרים של תרבית מים סטרילית למשך שבועיים. אפיינו וציינו את המושבות על פי המורפולוגיה שלהן במיקרוסקופ הפוך בהגדלה של פי 40 בצלחת תרבית המסומנת ברשת ניקוד.

על מנת לתעד את תוצאות התרבית, סרוק את כל לוחית בדיקת ה-CFC באמצעות סורק רגיל ב-600 DPI וצלם מיקרוגרפי צילום בעוצמה נמוכה של מושבות מייצגות באמצעות מיקרוסקופ הפוך המצויד במצלמה צבעונית לניתוח נוסף של תאי התמיינות והתפשטות מכל לוחית בדיקת ה-CFC משוחזרים על ידי השעיה במספר נפחים של טמפרטורת החדר 2% F-B-S-I-M-D-M נשטף ונספר לניתוחים מורפולוגיים. העבר 30,000 תאים ששוחזרו מלוחות בדיקת CFC לשקופית. באמצעות צנטריפוגת סיבוב STOs, יבש את המגלשות באוויר למשך הלילה כדי להכתים את המגלשות ביעילות.

הקימו פס ייצור של תשעה כלי צביעה המכילים תמיסות בסדר הבא. מתנול מוחלט ימין gemsa פתרון מלאי gemsa נכון מאגר gemsa, 50% מתנול ומים, שני כלי מאגר פוספט מים pH שש ולבסוף שני כלי מים. הנח את השקופיות במנשא שקופיות וטבל במתנול מוחלט למשך שתי דקות ודם עודף מתנול.

טבלו מיד את מנשא השקופיות וכתבו תמיסת מלאי אבני חן למשך חמש דקות. העבירו את המנשא למאגר אבני חן ימני pH 6.4 ודגרו למשך 10 דקות. טבלו את המנשא פעמיים ב-50% מתנול 10 פעמים במים ועוד 10 פעמים בכלי המים הבא ולאחר מכן חמש פעמים במאגר פוספט.

pH 6.0. מעבירים את המנשא למים ודוגרים למשך שתי דקות. חזור על הכביסה בכלי המים האחרון.

כעת הניחו לשקופיות להתייבש לחלוטין במנשא. הסר כל שקופית ונגב את החלק האחורי של השקופית במגבוני קים ספוגים במתנול להסרת כתמים. מניחים טיפה של אטם ציטו 60 וזכוכית כיסוי לאיטום.

בצע ספירה דיפרנציאלית של 500 תאים עבור כל שקופית מתמשכת GM באמצעות מיקרוסקופ. למטרות ניסוי זה, התאים מחולקים לחמש קטגוריות, תאים פרימיטיביים, תאים מיאלואידים ביניים, תאים מיאלואידים בוגרים, תאי אריתרואידים ביניים ותאי אריתרואידים בוגרים. לדוגמה, בהשוואה לביטוי הביקורת של 98 הנצים החדשים, תשעה אונקוגנים הגבירו את היווצרותן של מושבות אריתרואידים אדומות.

השפעת השוק הזו של האונקוגן ניכרת בבירור כאשר נצפות מושבות בהגדלה נמוכה. בדיקה מורפולוגית נוספת על ידי GEM מספקת מידע על השושלת ומידת ההתבגרות של אוכלוסיית התאים. בדוגמה זו, הצגת 98 הוקס חדשים, תשע גרמה לעלייה כללית במספר התאים עם היפרפלזיה אריתרואידית ועיכבה עיכוב של התבגרות אריתרואידית ומיאלואידית.

SA זה מספק תובנה לגבי התמיינות תאים המטופויאטיים על ידי מדידת היכולת של תכשיר תאי קלט להתרבות, להתמיין וליצור מושבות בתווך מוצק למחצה.