Name: יצירת המושבה Cell (CFC) Assay עבור תאים hematopoietic האדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: למדו את פרוטוקול מבחן CFC להערכת התמיינות ותהליכי התרבות של תאי גזע המטופויטיים אנושיים. השיטה כוללת שתל רטרו-ויראלי של תאי CD34+, יצירת מושבות במתילצלולוזה וניתוח מורפולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ג&#39;אלווין Siteman במרכז לחקר הסרטן באוניברסיטת וושינגטון בית הספר לרפואה של בארנס יהודים החולים בסנט לואיס, מיזורי, לשימוש של Core סדרן Cell מהירות גבוהה, שסיפקה cytometry זרימת ציוד ושירותים מיון. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים R01 HL082549 ו K02 HL084179 (NRY). סרטן Siteman מרכז נתמך בחלקו על ידי תמיכה במרכז לחקר הסרטן NCI גרנט P30 CA91842.

<ol><li>Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUP98-HOXA9+induces+long-term+proliferation+and+blocks+differentiation+of+primary+human+CD34%2B+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells.</a> Cancer Res. , 66-6628 (2006).</li>
<li>Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+NUP98-DDX10+oncogene+on+primary+human+CD34%2B+cells%3A+role+of+a+conserved+helicase+motif%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Effects of the NUP98-DDX10 oncogene on primary human CD34+ cells: role of a conserved helicase motif.</a> Leukemia. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Yassin, E. R., Sarma, N. J., Abdul-Nabi, A. M., Dombrowski, J., Han, Y., Takeda, A., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+transformation+of+primary+human+hematopoietic+cells+by+the+oncogene+NUP98-HOXA9%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dissection of the transformation of primary human hematopoietic cells by the oncogene NUP98-HOXA9.</a> PLoS One. 4, e6719-e6719 (2009).</li>
<li>Nissen-Druey, C., Tichelli, A., Meyer-Monard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hematopoietic+colonies+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Haematol%22%5BJournal%5D)">Human hematopoietic colonies in health and disease.</a> Acta Haematol. 113, 5-96 (2005).</li>
<li>Pereira, C., Clarke, E., Damen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+colony-forming+cell+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic colony-forming cell assays.</a> Methods Mol Biol. 407, 177-208 (2007).</li>
<li>Coulombel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells%3A+strength+and+drawbacks+of+functional+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Identification of hematopoietic stem/progenitor cells: strength and drawbacks of functional assays.</a> Oncogene. 23, 7210-7222 (2004).</li>
<li>Hogge, D. E., Lansdorp, P. M., Reid, D., Gerhard, B., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection%2C+maintenance%2C+and+differentiation+of+primitive+human+hematopoietic+cells+in+cultures+containing+murine+fibroblasts+engineered+to+produce+human+steel+factor%2C+interleukin-3%2C+and+granulocyte+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection, maintenance, and differentiation of primitive human hematopoietic cells in cultures containing murine fibroblasts engineered to produce human steel factor, interleukin-3, and granulocyte colony-stimulating factor.</a> Blood. 88, 3765-3773 (1996).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Assay CFC נמצא בשימוש נרחב על מנת לקבוע את תפוצת ואת דפוסי הבידול של אבות hematopoietic כדי לחקור את ההשפעות של אונקוגנים (4, 5). יש לו יתרון על פני תרבויות נוזלי להיות assay משובטים, כך המושבות לייצג את הצאצאים של אב יחיד ניתן להסיר באופן פרטני לצורך ניתוח נוסף. המגבלה של assay CFC היא שזה לא מספיק לצורך זיהוי של אבות יותר בשלה, או בתאי גזע hematopoietic; תאים אלה מזוהים באמצעות לטווח ארוך תרבות ייזום תאים (LTC-IC) assay (6, 7). הניסויים שתוארו כאן להוכיח כי oncogene AML הקשורים ...

<table><tbody><tr><td>IMDM</td><td>Life Technologies</td><td>12440</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>06150</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומייסין (PS)</td><td>Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>ליגנד FLT-3</td><td>PeproTech Inc</td><td>300-19</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>PeproTech Inc</td><td>300-03</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech Inc</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>PeproTech Inc</td><td>300-18</td><td></td></tr><tr><td>IL3</td><td>PeproTech Inc</td><td>200-03</td><td></td></tr><tr><td>IL6</td><td>PeproTech Inc</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין מסרום בקר (Bovine Serum Albumin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Retronectin</td><td>Takara Bio Inc</td><td>T100A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14200</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת Trypan Blue (0.4%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Methocult GF+ H4435</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>04445</td><td></td></tr><tr><td>מדיה מועשרת במתילצלולוז אנושית</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>HSC005</td><td></td></tr><tr><td>צביעת Wright/ Giemsa</td><td>Harleco</td><td>64571</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת בופר פוספט, pH 6.4 - נוסחת Giordano</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>1450</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>8310</td><td></td></tr><tr><td>סרום עכבר נורמלי</td><td>Rockland Immunochemicals</td><td>D208</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Anti-Human CD11b מצומד ל-phyc&amp;#8211;rythrin</td><td>BD Biosciences</td><td>555388</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Anti-Human CD33 מצומד ל-allophycocyanin</td><td>BD Biosciences</td><td>551378</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Anti-Human CD45 מצומד ל-phyc&amp;#8211;rythrin-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557748</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Anti-Human CD71 מצומד ל-phyc&amp;#8211;rythrin</td><td>BD Biosciences</td><td>555537</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Anti-Human CD235a מצומד ל-allophycocyanin</td><td>BD Biosciences</td><td>551336</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Anti-Human CD45 מצומד ל-phyc&amp;#8211;rythrin-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557748</td><td></td></tr><tr><td>פלטות לתרבית רקמה בעלות 24 בארות, ללא טיפול</td><td>BD Biosciences</td><td>35-1147</td><td></td></tr><tr><td>צלחית 30 mm ללא טיפול</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>27150</td><td></td></tr><tr><td>צלחית לתרבית רקמה 100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>צלחית סימון עם רשת</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>27500</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות צנטריפוגה 15 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>35-2097</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות צנטריפוגה 50 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>35-2070</td><td></td></tr><tr><td>מזרקים 3 ml</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>28240</td><td></td></tr><tr><td>מחט בעלת קצה קהה, 16 gauge, אורך 1&amp;frac12; אינץ'</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>28110</td><td></td></tr><tr><td>מסנן תאים CellTrics בסינון של 50 &amp;mu;m</td><td>Partec</td><td>04-004-2327</td><td></td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td>Fisher Scientific</td><td>0267110</td><td></td></tr><tr><td>תאי דגימה TPX</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>A78710018</td><td></td></tr><tr><td>זכוכיות מיקרוסקופ Fisherbrand Superfrost/Plus, מנוקות מראש</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>כרטיסי סינון Shandon</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>5991022</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק זכוכיות cytospin של Shandon</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>59920063</td><td></td></tr><tr><td>מערך צביעה מלא Shandon Complete Staining Assembly 100</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>100</td><td></td></tr><tr><td>ניירות Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון 1 &amp;mu;m</td><td>VWR international</td><td>28307-134</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>Nikon Instruments</td><td>Diaphot</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת מיקרוסקופ</td><td>Nikon Instruments</td><td>DS-F11</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת מיקרוסקופ</td><td>Olympus Corporation</td><td>DP71</td><td></td></tr><tr><td>סורק</td><td>Microtek</td><td>Scanmaker 4</td><td></td></tr><tr><td>מערבל וורטקס (Vortex mixer)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור לתרבית רקמה</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin</td><td>Shandon, Inc.</td><td>Cytospin 2</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגת שולחן</td><td>Eppendorf</td><td>5810-R</td><td></td></tr><tr><td>מערכת לטיהור מים</td><td>Barnstead</td><td>Nanopure-Diamond</td><td></td></tr></tbody></table>

יצירת המושבה cell (cfc) assay עבור תאים hematopoietic האדם

Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

האדם hematopoietic גזע / ובתאים מתקבלים בדרך כלל ממח העצם, דם טבורי, או דם היקפיים משמשים ללמוד hematopoiesis ו leukemogenesis. יש להם את היכולת להתמיין שושלות הלימפה ואת מיאלואידית. המושבה להרכיב (CFC) assay תא משמש כדי ללמוד את התרבות ואת דפוס הבידול של אבות hematopoietic על ידי היכולת שלהם ליצור מושבות בתווך מוצק למחצה. המספר את המורפולוגיה של המושבות הוקמה על ידי מספר קבוע של תאים קלט לספק מידע ראשוני על היכולת של אבות להבדיל מתרבים. תאים ניתן לקצור ממושבות הפרט או מהצלחת כולו להמשיך להעריך את מספרם ומדינות בידול באמצעות זרימת cytometry והערכה מורפולוגיים של Giemsa מוכתם שקופיות. Assay זה שימושי להערכת בידול מיאלואידית אך לא הלימפה. מיאלואידית המונח בהקשר זה משמש במובן הרחב שלה כדי להקיף שושלות granulocytic, monocytic, erythroid ו megakaryocytic. השתמשנו זה assay כדי להעריך את ההשפעות של אונקוגנים על התמיינות של תאים אנושיים העיקרי CD34 + שמקורם דם היקפי. בשביל זה התאים למטרה הם transduced עם לבנות או לשלוט retroviral או לבנות ביטוי oncogene של עניין, במקרה זה NUP98-HOXA9. אנו מעסיקים וקטור retroviral נפוץ, MSCV-IRES-GFP, אשר מבטאת mRNA bicistronic שמייצר הגן של עניין סמן ה-GFP. תאים מופעלות מראש על ידי גידול בנוכחות ציטוקינים יומיים לפני התמרה retroviral. אחרי עוד יומיים, GFP + תאים מבודדים ידי מיון הקרינה המופעל תאים (FACS) ומעורבבים עם המדיום methylcellulose המכילים מוצק למחצה בתוספת ציטוקינים מודגרות עד מושבות להופיע על פני השטח, בדרך כלל על 14 ימים. מספר ומורפולוגיה של המושבות מתועדים. תאים יוסרו אז מן הלוחות, שטף, נספר, והוא נתון cytometry זרימה ובדיקה מורפולוגיים. Cytometry זרימה עם נוגדנים ספציפיים על פני התא סמנים הביע במהלך hematopoiesis מספק מידע על השושלת שלב ההבשלה. מחקרים מורפולוגי של תאים בודדים תחת מיקרוסקופ לאחר מכתים רייט Giemsa לספק מידע נוסף לגבי השושלת והתבגרות. השוואה בין תאים transduced עם בקרת וקטור ריק לאלה transduced עם oncogene מגלה את ההשפעות של oncogene על בידול hematopoietic.

המושבה להרכיב (CFC) assay התא assay במבחנה שבה אבות hematopoietic טופס מושבות בינוני חצי מוצק. שילוב של מורפולוגיה המושבה, מורפולוגיה התא cytometry זרימה משמשים כדי להעריך את היכולת של אבות להתרבות להבדיל לאורך שושלות hematopoietic שונים.

יצירת המושבה Cell (CFC) Assay עבור תאים hematopoietic האדם

תאי גזע/প্রוגניטור המטופואטיים אנושיים מופקים בדרך כלל ממוח עצם, דם חבל טבילה או דם פריפריאלי, ומשמשים לחקר ההמטופואזה ו...

הליך זה מעריך, בתווך חצי-מוצק, את יכולתם של תאי אב המטופואטיים להתרבות ולהתמיין למסלולי ייחוס המטופואטיים שונים בתחילת התרבית. תאים חיוביים ל-CD 34 שהופשרו לאחרונה נוכחים בנוכחות ציטוקינים כדי לעודד אקטיבציה לאחר יומיים. בצע טרנסדוקציה רטרו-ויראלית של מבנה בדיקה המבטא GFP על ידי הוספת התאים החיוביים ל-CD 34 המופעלים לצלחת הטעונה מראש בנגיף.לאחר 48 שעות, בודדים את התאים החיוביים ל-GFP באמצעות FACS, ולאחר מכן זורעים תאים אלה במצע מתילצלולוז חצי-מוצק המועשר בגורמי גדילה, ומדגירים למשך כשבועיים עד להופעת מושבות על פני השטח. לבסוף, קוצרים את המושבות, מקבעים את התאים על סליידים באמצעות ציטוסין וצובעים ב-Wright-Giemsa לצורך קביעה מיקרוסקופית של השורה ההמטופואטית ושל שלב ההבשלה. שיטה זו יכולה לספק תובנה מכניסטית במחקרים של לוקמוגנזה, ובייחוד לגבי השפעותיהם של אונקוגנים על התמיינות המטופואטית.על מנת להכין תרבית, הפשיר במהירות מבחנה של תאי CD 34 חיוביים קפואים בטמפרטורה של 37 °C על ידי ניעור עדין עד שנותר גביש קרח קטן אחרון, והעבר את תרחיף התאים למבחנה קונית של 50 ml. שטוף בעדינות את התאים שנותרו במבחנה עם 1 ml של מצע 2% F-B-S-I-M-D-M בטמפרטורת החדר, והוסף אותו בטיפות למבחנה של ה-50 ml תוך כדי סיבוב עדין. כעת המתן במשך שלוש דקות.המשיכו בהוספה איטית של 2 milliliters של מצע תוך כדי ערבוב עדין, והמתינו שוב שלוש דקות להגעה לשיווי משקל. חזרו על הליך זה של הוספת מצע בנפחים שווים לת сусפנזיית התאים המדוללת במרווחים של שלוש דקות, תוך סיבוב עדין בין ההוספות, עד שהנפח הסופי יגיע ל-32 milliliters. לאיסוף התאים, ביצעו צנטריפוגה ב-250 G למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, והסירו את הנוזל העליון (supernatant) תוך השארת כ-0.5 milliliter של מצע מעל המשקע (pellet). המשיכו לשטיפת התאים פעם אחת על ידי השעיה של המשקע ב-20 milliliters של מצע וביצוע צנטריפוגה ב-200 G למשך שמונה דקות בטמפרטורת החדר; הסירו את הנוזל העליון והשעיו את התאים במצע IMDM מלא בריכוז של כחצי מיליון תאים ל-milliliter.לבסוף, כדי לקבוע את ריכוז התאים, העבירו 10 µL מהתליה למבחנה קטנה (micro tube), ערבבו עם נפח זהה של תמיסת tripan blue בריכוז 0.4% ובצעו ספירה. באמצעות המוציטומטר (hemo cytometer), דללו את התאים לריכוז של 10⁵ תאים למל' על ידי הוספת מצע IMDM מלא המועשר בתערובת ציטוקינים מפעילים; דגרו את התאים באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 °C עם 5% CO2 למשך יומיים. ביום התעתוק (transduction), ספרו את התאים לפני תחילת טעינת הנגיף המוקדמת כדי לקבוע את מספר הבארות שיש להכין עבור פלטת תרבית רקמות של 24 בארות שלא עברה טיפול. הוסיפו 400 µL של תמיסת retro actin בריכוז 25 µg/mL לכל באר ודגרו למשך שעתיים בטמפרטורת החדר בתוך מabilis זרימה למינרית (laminar flow biosafety hood).הסר את תמיסת ה-retro actin וצפה כל באער ב-2% BSA על ידי דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בינתיים, הפשר את תמיסות המאגר של הנגיף ושמור אותן על קרח. לאחר מכן, שאב את תמיסת ה-BSA והעמס את הנגיף על ידי הוספת 0.5 milliliter של תמיסות הנגיף לכל באער, וסבב בצנטריפוגה במהירות של 2,200 G בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius למשך 15 דקות.הסר את תמיסת הנגיף מהבארות וחזור על טעינת הנגיף שלוש פעמים נוספות. לבסוף, שטוף כל בארה במצע IMDM קר. כעת אסוף את תאי ה-CD 34 חיוביים שהופעלו מראש באמצעות סנטריפוגציה וסבב מחדש את התאים במצע IMDM מלא וטרי המועשר בציטוקינים. חלק 0.15 מיליון תאי CD 34 חיוביים לכל אחת מהבארות המצופות בנגיף, והדגר באינקובטור לח במטמפר של 37 °C עם 5% carbon dioxide למשך יומיים, כדי לקצור את התאים שעברו טרנסדוקציה בעדינות אך ביסודיות.שעלק את התאים מהצלחות של ה-virus floated וסנן את התוך-תלייה דרך מסנן תאים של 50 micron אל תוך מבחנה קונית. העבר 10 µL של תוך-תליית התאים למבחנה מיקרוצנטריפוגית. ערבב עם נפח שווה של תמיסת tripan blue וספור את התאים באמצעות המוציטומטר (hemo cytometer).שטפו כל באר עם 0.8 milliliter של HBSS קר עם 0.02%EDTA והעבירו לאותה מבחנה איסוף דרך מסנן תאים מסוג CEL Trix של 50 micron. השקיעו את התאים על ידי סבב צנטריפוגה ושטפו פעם אחת עם HBSS קר. השביו את משקע התאים הסופי ב-HBSS עם 1%BA ושמרו את התאים על קרח בחושך לצורך מיון תאים, המבוצע בדרך כלל במעבדת ליבה למיון תאים במהירות גבוהה בהתאם לתכנון הניסויי.הפשיתו את מספר המנות הנדרש של מדיום לבדיקת CFC, ערבבו בעוצמה באמצעות וורטקס (vortex) והניחו למבחנה לעמוד למשך חמש דקות לפחות כדי לאפשר לבועות לעלות לפני הוספת התאים. כעת, העבירו 3000 תאים ממוינים שעברו טרנסדוקציית נגיף למבחנה מיקרוסטרילית המכילה מדיום 2%F-B-S-I-M-D-M קר, והתאימו את נפח הסספנסיה הסופי ל-0.3 milliliters. השעו את התאים והעבירו את כל סספנסיית התאים למנה של three milliliters של מדיום גידול methyl cult.צור תרחיף תאים הומוגני על ידי ערבוב נמרץ במכשיר וורטקס (vortex). השאר את המבחנה ללא תנועה למשך שלוש דקות. לצורך זריעת התאים, חבר מחט בעלת קצה קהה במידה 16 למזרק של 3 milliliters ושאב 2.2 milliliters.תוך הקפדה על מניעת ספיגת בועות גדולות, העבירו 1.1 milliliter לכל אחת משתי צלחות תרבית רקמה לא מטופלות בקוטר 30 millimeter ופזרו את התערובת באופן שווה באמצעות סיבוב. הניחו את הצלחות הכפולות בתוך צלחת בקוטר 100 millimeter יחד עם כלי המכיל מים. המשיכו את תרבית המים הסטרילית במשך שבועיים. אפיינו ודרגו את המושבות בהתאם למורפולוגיה שלהן באמצעות מיקרוסקופ הפוך בהגדלה של 40x בצלחת תרבית המסומנת בסריג דירוג.על מנת לתעד את תוצאות התרביות, סרקו את כל פלטת ה-CFC באמצעות סורק רגיל ברזולוציה של 600 DPI וצלמו מיקרוגרפיות בהגדלה נמוכה של מושבות מייצגות באמצעות מיקרוסקופ הפוך המצויד במצלמה צבעונית לצורך ניתוח נוסף של התמיינות ופרוליפרציה. תאי ה-CFC מהפלטה כולה מאוספים על ידי השעיה במספר נפחים של 2%F-B-S-I-M-D-M בטמפרטורת החדר, נשטפים ונספרים לצורך ניתוחים מורפולוגיים. העבירו 30,000 תאים שאספו מפלטות ה-CFC לסלייד. באמצעות צנטריפוגת STOs spin, ייבשו את הסליידים באוויר למשך לילה כדי לאפשר צביעה יעילה של הסליידים.הכינו שורת הרכבה של תשעה כלי צביעה המכילים תמיסות בסדר הבא: מתנול מוחלט, תמיסת אם של Gemsa, בופר Gemsa, 50% מתנול ומים, שני כלי מים, בופר פוספט pH 6 ולבסוף שני כלי מים. הניחו את הפלואות בתוך נשא פלואות, טבלו אותן במתנול מוחלט למשך שתי דקות ונקזו את עודפי המתנול.טבול מיד את נשא השקופיות בתמיסת מלאי של Gemsa למשך חמש דקות. העבר את הנשא לבאפר Gemsa pH 6.4 והדגר למשך 10 דקות. טבול את הנשא פעמיים ב-50%methanol, 10 פעמים במים, 10 פעמים נוספות בכלי מים הבא, ולאחר מכן חמש פעמים בבאפר פוספט.pH 6.0. העבירו את הנשא אל תוך מים והדגירו למשך שתי דקות. חזרו על השטיפה בכלי המים האחרון.כעת יש להמתין לייבוש מלא של השקופיות באוויר בתוך הנשא. הוציאו כל שקופית ונגבו את גבה באמצעות נייר ניגוב מסוג Kim wipes ספוג במתנול כדי להסיר כתמים. טפטפו טיפה של cyto seal 60 והניחו זכוכית כיסוי לאיטום.בצעו ספירה דיפרנציאלית של 500 תאים עבור כל שקופית ששמרה במעבדה בשיטת GM באמצעות מיקרוסקופ. לצורך ניסוי זה, התאים מחולקים לחמש קטגוריות: תאים פרימיטיביים, תאי מיאלואיד ביניים, תאי מיאלואיד בוגרים, תאי אריתרואיד ביניים ותאי אריתרואיד בוגרים. לדוגמה, בהשוואה לביטוי השליטה של ה-98 hawks החדשים, אונקוגן תשעה הגביר את היווצרות של מושבות אריתרואיד אדומות.השפעה זו של האונקוגן על השוק ניכרת בבירור כאשר בוחנים את המושבות תחת הגדלה נמוכה. בדיקה מורפולוגית נוספת באמצעות GEM sustaining מספקת מידע על השושלת ועל מידת הבשלות של אוכלוסיית התאים. בדוגמה זו, הכנסת 98 Hawks חדשים, שגירם לעלייה כללית במספר התאים עם היפרפלזיה אריתרואידית ולעיכוב בבשלות אריתרואידית ומילואידית כאחד.ניתוח זה (SA) מספק תובנה לגבי בידול של תאי המטופוייז על ידי מדידת היכולת של תכשיר תאים מוזן להתרבות, להבדיל וליצור מושבות במצע חצי-מוצק.

colony-forming-cell-cfc-assay-for-human-hematopoietic-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

האנדותל להרכיב המושבה ובתאים (ECFCs) הם כלי מבטיח ללמוד הומאוסטזיס לתקן כלי הדם.

בידוד הרחבת בקנה מידה גדול של תאים אנושיים למבוגרים האנדותל המושבה יצירת אב

בתאי אנדותל היוצרים המושבה (ECFCs) מסתובבים לתאי אנדותל עם פוטנציאל חזק שגשוג משובט המוצגים...

אפיון פנוטיפי ופונקציונלי של תאים מושבה אנדותל יוצרי נגזר דם טבורי האדם קורד

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול של יחידת היווצרות מושבה מבוססת מתיל צלולוז או בדיקת CFU, המסייעת לזהות ולספור את מספר המושבות שנוצרו על ידי תאים לוקמיים בתגובה לטיפול בתרכובות אנטי-סרטניות.

בדיקת CFU מבוססת מתיל תאית: שיטה לקביעת ההשפעה של תרכובות אנטי-סרטניות על היווצרות מושבות בתאים לוקמיים

פרוטוקול זה מתאר אינדוקציה יעילה של אנדותל המוגני ואבות המטופויאטיים רב-פוטנציאליים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות ביטוי מאולץ של גורמי שעתוק.

אינדוקציה ישירה של Hemogenic האנדותל ודם על ידי יתר של גורמי שעתוק בתאי גזע pluripotent האדם

כאן, אנו מציגים pluripotent האנושי פרוטוקולים התרבות תאי גזע (hPSC), נהגו להבדיל hPSCs לתוך CD34+ אבות hematopoietic. שיטה זו משתמשת ספציפיות שלב מניפולציה של חגיגת הקנוני איתות לציין תאים באופן בלעדי לתוכנית או סופית או פרימיטיבי hematopoietic.

ביים הבידול של אבות Hematopoietic פרימיטיבי, מהווים הסופית מתאי גזע Pluripotent אנושי

כאן, אנו מתארים את פרוטוקולי האימות גנטי וכימי של c-פוס, Dusp1 כמטרה סמים בלוקמיה באמצעות העכבר גנטי, humanized במבחנה ויוו מודלים. בשיטה זו ניתן ליישם כל מטרה עבור אימות הגנטי ופיתוח טיפולית.

שיטות להערכת את התפקיד של c-פוס, Dusp1 התלות אונקוגן

מתאי הגזע האנושיים החזקים ביותר. במצב מזינה-ונטול-כאלה שיטה זו יהיו בעלי יישומים נרחבים במידול מחלות והקרנה לתרכובות טיפוליות.

הומוגניים אנדותל בידול מתאי גזע האדם Pluriפוטנטי במזין-ו-Xeno-תנאי מוגדר חינם

כאן אנו מתארים שיטה אמינה למדוד מסה מיטוכונדריאלי פוטנציאל קרום בתאי גזע vivo המטפאות לשעבר תאים T.

מדידת מיסת מיטוכונדריאלי ופוטנציאל ממברנה בתאי גזע ותאי T-תאים על ידי זרימה Cy,

כאן אנו מתארים שיטה ציטומטרית חדשנית לזרימה לבידוד פרוספקטיבי של אריתרואיד יחידה יוצרת התפרצות מוקדמת (BFU-e) ואריתרואיד יחידה יוצרת מושבה (CFU-e) ישירות ממח עצם וטחול טריים של עכבר. פרוטוקול זה, שפותח על סמך נתוני תעתיק חד-תאיים, הוא הראשון לבודד את כל אבות האריתרואידים של הרקמה בטוהר גבוה.

זיהוי ובידוד של יחידה יוצרת פרץ ויחידה יוצרת מושבה אבות אריתרואידים מרקמת עכבר על ידי ציטומטריה של זרימה

מוצגת כאן טכניקה מבוססת ציטומטריית זרימה המאפשרת למדוד בו זמנית את מספר חלוקות התא, פנוטיפ תאי פני השטח וקרבה תאית. ניתן לבדוק תכונות אלה באופן סטטיסטי באמצעות מסגרת מבוססת תמורות.

הערכה סימולטנית של קרבה, מספר חלוקה ופנוטיפ באמצעות ציטומטריית זרימה עבור תאי גזע המטופויטיים ותאי אב

למדו את פרוטוקול מבחן CFC להערכת התמיינות ותהליכי התרבות של תאי גזע המטופויטיים אנושיים. השיטה כוללת שתל רטרו-ויראלי של תאי CD34+, יצירת מושבות במתילצלולוזה וניתוח מורפולוגי.

יצירת המושבה Cell (CFC) Assay עבור תאים hematopoietic האדם

גלה סרטונים נוספים