Name: הכנה של הלב עכברוש מצמידים מאוד המיטוכונדריה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-23T17:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: למד שיטה לאיסולציה של מיטוכונדריות לב עכברוש טהורות ופעילות לחקר ביואנרגטיקה תאית. הפרוטוקול כולל הפרעה מכנית, סחיפה דיפרנציאלית ושמירה על טמפרטורה נמוכה לאיכות גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים פרופ &#39;וינוגרדוב וד&quot;ר ורה Grivennikova עבור המבוא של המחברים לתחום הביולוגיה המיטוכונדריה תובנות ועצות שימושיות רבות בהליך זה. המחברים מודים לגברת אמנדה McKintock ממשרד התקשורת מאוניברסיטת קווינס על העזרה בהכנת וידאו.

הקדמה המיטוכונדריה מהלב עכברוש הוא אחד הנפוצים ביותר ההכנות ללימודים בעבר ובהווה של חילוף החומרים התאי. הם ניתן להשיג במהירות ובאופן אמין בכמות גדולה מן סוג בר או עקום החוצה וחיות. הנוהל הכללי מורכב לעיכול רקמת על ידי חלוקה טריפסין, ו צנטריפוגה ההפרש. ישנם כמה תנאים שצריכים להישמר במהלך בידוד של המיטוכונדריה מרקמות שונות, כולל הלב (איור 1). <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת צריך להיות טחון היטב, שכן הוא משפיע ישירות על תשואה של המיטוכונדריה שהושגו. רקמת הלב עדיף לקצץ במספריים מעוגלים קטנים ניתן ואחריו להשתמש במטחנת רקמות Latapie או, אם מטחנת רקמה אינו זמין, עיתונאים שום בקוטר מוצא חורים בקוטר של כ 1.0 מ"מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה הכרחי כדי לשמור על טמפרטורה של פתרונות בכל שלב. לכן התהליך כולו צריך להתבצע בחדר קר, וכל המכשירים פתרונות להיות מוכן ומקורר מראש. אם תנאי הטמפרטורה לא נשמרים מספר מאפיינים יציבים של התכשיר ניתן לאיבוד. מבנה מיטוכונדריאלי רגיש מאוד הקפאת כך overfreezing של ההשעיה (למשל במהלך צנטריפוגה) אינה מותרת, במיוחד אם מחקרים התחבורה פעיל חשובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרמטר חשוב הוא הזמן הארוך של ההליך; הבידוד יש לבצע במהירות האפשרית והכנת שהושגו יש להשתמש מיד. לכן, כירורגית כלי נגינה, פתרונות ומוצרי צריכה להיות מוכנה מראש. </li></ul> חומרים ומכשירים מכשירים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספריים ההפעלה סטרייט, נקודה חדה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Curved מספריים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצבטים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת פטרי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משפך קטן + חתיכת ניילון המסנן (prewashed) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6 כוסות 50 מ"ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני stirrers מגנטי ושתי אמבטיות קרח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחת קרח גדול באמבטיה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 מוטות מגנטיים קטנים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ומדיות עבור גלולה גירוד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ Latapie רקמות (ניתן להחליף עם העיתונות השום) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טפלון זכוכית homogenisers 20ml ו 1-2ml </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פסולת כוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Eppendorf צינורות להשעיה המיטוכונדריה דגימות הסופי לקביעת חלבון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמבטיות קרח </li></ol> פתרונות (מחושב לפי 2 חולדות): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ כביסה: 0.3 סוכרוז M, 10 HEPES מ"מ (pH = 7.2), 0.2 mM EDTA (1000 מ"ל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ בידוד: 0.3 סוכרוז M, HEPES 10 מ"מ (pH = 7.4), 0.2 mM EDTA, 1 מ"ג / מ"ל ​​BSA (Sigma A6003) (100 מ"ל שהוכן למאגר כביסה). סרום אלבומין שור ניתן להחליף על ידי פחות יקר נטול חומצה אנלוגים שומן. המאגר זהה או וריאציות שלה איזוטוני יכול לשמש חיץ Resuspending. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טריפסין (Sigma T8003) פתרון: 2.5mg/ml ב 1mm HCl (0.5 מ"ל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעכבי טריפסין מסויה שעועית (Sigma T9128) mg/10 6.5 מ"ל של חיץ בידוד </li></ol> פרוטוקול התוכנית הכללית של ההליך מוצג באיור. 1. לבבות צריך להיות מקורר לרחוץ כביסה, חיץ רקמות חדרית נכרת, טחון homogenised במהלך הטיפול photolytic עם טריפסין. ההשעיה היא centrifuged במהירות נמוכה ואת supernatant המתקבל centrifuged שוב במהירות גבוהה יותר כדי לאסוף את המיטוכונדריה. בהתאם הניסויים המתוכננת למאגר resuspending יכול להיות מוחלף על ידי כל פתרון איזוטוני אחרים. בעלי חיים הופסקה בהתאם בבריטניה "חיות (הליכים מדעיים) לחוק." על ידי נקע בצוואר הרחם בעקבות עריפת ראש. זה הכרחי כדי לחלץ את הלב מיד לאחר עריפת ראש של חיה, כך שאין עיכוב בין סיום החי מיצוי לב. אם הבידוד מקביל של הכבד המיטוכונדריה צפוי החולדות צריך להיות בצום לילה לפני הניסוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין שלושה כוסות המכילות 40 מ"ל של הצפת כביסה. מגניב אותם באמבט קרח מלח במשך 3-5 דקות לפני שתמשיך לשלב הבא. ודא שלא overfreeze אותם ולהשתמש מיד אחרי עננים של גבישי קרח מתחילים להופיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את בית החזה של עכברוש הכרות ולחלץ את הלב. ודא חתכים קטנים ומיד להעביר את הלב פתרון הקר כקרח בכוס הראשונה. חונק את הלב כדי להסיר דם והכניס אותו לתוך הכוס השנייה. חזור על פעולה זו עבור כל הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש את ליבם על הנייר את המסנן. הסר את כל הדם שומן קרוש, auricles ו fasciae ובריכת רקמת חדרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכך את הרקמה ונקווה במספריים מעוגלים קטנים על צלחת פטרי על קרח דק סביב 5 עד גודל החלקיקים הוא כ 1-2 מ"מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את רקמות טחון לתוך העיתונות רקמות לעבוראותה דרך. שים לב כי כמות משמעותית של החומר יכול להישאר בעיתונות כך לאסוף את כל רקמת לב מהקירות התחתונה של העיתונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת חומר לתוך כוס עם הצפת 50 מ"ל כביסה ומערבבים. ואז לסנן את ההשעיה דרך מסנן ניילון. שטפו את הרקמה טחון על 3 פעמים עם מסנן למאגר כביסה לבטל את תסנין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת רקמות נסחפו לתוך 20 מ"ל של הצפת כביסה ולמקם אותו באמבט קרח על stirrer המגנטי. הוסף 0.5 מ"ל של תמיסת טריפסין תחת בחישה מתמדת להפעיל את הטיימר. הכן עוד stirrer מגנטי, אמבט קרח וכוס second 50 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקה ה 4 homogenise בקצרה את החלק ההשעיה על ידי שימוש בחלק קטן מצויד באופן רופף זכוכית טפלון homogeniser (10-15 מ"ל) עם כמה משיכות מעלה ומטה כדי לפזר את ההשעיה. לאחר homogenisation להעביר את ההשעיה לתוך הכוס השנייה. חזור על נוהל על בדקה ה 9, כך שתוכל לבצע את homogenisation ההשעיה שתי פעמים בסך הכל. לאחר 15 דקות של דגירה, להוסיף 10 מ"ל של בידוד המכיל מאגר מעכב טריפסין ו דגירה דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את ההשעיה שוב דרך פילטר ניילון ולשמור את תסנין. איסוף החלקיקים חלק שמאל על לסנן homogenise דקות 1 ב 15-20 מ"ל של הצפת כביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את homogenate עם תסנין ו צנטריפוגות במשך 15 דקות ב 600g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לסנן את supernatant שנוצר לתוך צינור צנטריפוגות חדשות. הימנע זיהום על ידי גלולה ו צנטריפוגות שוב במשך 15 דקות ב 8500g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה במהירות גבוהה להתעלמות supernatant ולשטוף את 2-3 פעמים גלולה עם 1 מ"ל של השלכת למאגר שכבת לבנות ורכות שפת החיצונית. לשבור את גלולה עם המרית אלא למנוע את הכתם האדום של אריתרוציטים בתחתית. אם בתאי הדם יש לוס, להסיר את פיסות אדום ההשעיה לפני homogenisation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה עם homogeniser קטנה או לחילופין על ידי pipetting עדין. לדלל את ההשעיה עם Isolationbuffer יותר צנטריפוגות שוב במשך 15 דקות ב 8500g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, resuspend גלולה ב Resuspending הצפת (חיץ איזוטוני של בחירה) ו צנטריפוגות שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתוצאה מכך חום גלולה המכילה מיטוכונדריה שלם נשטף. Resuspend גלולה בנפח קטן מאוד של חיץ איזוטוני על פי בחירתך. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2202/2202fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. Scheme הוכחת צעד אחר צעד בהליך של בידוד של הלב חולדה המיטוכונדריה. חלק למעלה, שלבים 1-9: שיבוש רקמות, טיפול homogenisation טריפסין ו; החלק התחתון, בשלבים 10-15: צנטריפוגה ההפרש.

<ol><li>Jacobus, W. E., Saks, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creatine+kinase+of+heart+mitochondria%3A+changes+in+its+kinetic+properties+induced+by+coupling+to+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Creatine kinase of heart mitochondria: changes in its kinetic properties induced by coupling to oxidative phosphorylation.</a> Arch. Biochem. Biophys. 219, 167-178 (1982).</li>
<li>Gostimskaya, I. S., Grivennikova, V. G., Zharova, T. V., Bakeeva, L. E., Vinogradov, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+assay+of+the+intramitochondrial+enzymes%3A+use+of+alamethicin+for+permeabilization+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">In situ assay of the intramitochondrial enzymes: use of alamethicin for permeabilization of mitochondria.</a> Anal. Biochem. 313, 46-52 (2003).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול מהיר מפורטות הבידוד של המיטוכונדריה שלם עם רמה גבוהה של צימוד מתואר. הכנה שהושגו יכול לשמש למחקר פונקציונלי או מבניים על bioenergetics הסלולר, מחקרים proteomic או ניתוח הדנ&quot;א המיטוכונדרי ותוכן השומנים. מחקרים Biophysical תחבורה פעילה של יונים ביניים מטבולי ניתן גם לבצע. אפשר להמשיך בתהליך ההכנה המיטוכונדריה כדי לבודד את חלקיקי submitochondrial, הממברנה החיצונית או רכיבים נפרדים לטהר של זרחון חמצוני. השיטה המתוארת הוא שינוי של הפרוטוקול הסטנדרטי של בידוד על ידי יעקובוס ו סאקס 1. התשואה הצפויה של המיטוכונדריה מוכן הוא כ 10-15 מ&quot;ג של חלבון לכל המיטוכונדריה לב ויחס השליטה על הנשימה Malate / גלוטמט הכנה כזה נע בין 8-12 עם הנשימה IV מדינת סביב 0.12 μmol O 2 חלבון xmin xmg -1 -1 ב 23 ° C במדיום המהווים 0.25 סוכרוז M, 10 mM KCl, 0.2 mM EDTA, 5 mM אשלגן זרחתי (pH 8.0) עם 150 מיקרומטר ADP לנשימה חניכה III המדינה (על תנאי הניסוי ותוספות המדויק, לראות נ&quot;צ . 2). תשומת לב מיוחדת יש לתת פרטים טכניים אחדים לפני תחילת ההליך בבידוד. זה חיוני כדי להשתמש לנקות צינורות פוליפרופילן או פוליקרבונט צנטריפוגות, ולכן צינורות יש לשטוף ביסודיות עם מברשת נקייה ומים חמים, אולם הטיפול אבקת צריך להישמר לכל הפחות. כמו כן, עדיף לאסוף את כל כלי זכוכית וכלי הכרחי בחדר קר יום לפני הבידוד. במהלך הבידוד בעת העברת מאגרים של צלוחיות על כוסות, תשומת לב מיוחדת а יש לתת למנוע טיפות של מי קרח לתוך הפתרונות. כאשר הטיפול ברקמות יש להדגיש כי עקירת הלב צריך להתבצע בהקדם האפשרי מאז אפילו קצרת זמן העיכוב בין עריפת ראש של החיה וקירור רקמת תביא המיטוכונדריה זוגיים חלקית. קירור מהיר ושטיפת יסודית של לבבות להסיר חיונית כדי להשיג הכנה רגילה, ללא המוגלובין NADase כדורית אדומה. טריפסין משמש השפלה חלבונים החיבור להגדיל את הרגישות של הרקמות לכפות הגז במהלך homogenisation. חשיפה ממושכת של הרקמה כדי פרוטאז יש להימנע שכן התוצאות במיטוכונדריה של איכות נחותה. לאחר centrifugations מהירות גבוהה הקירות של צינורות צנטריפוגה יש לנגב עם נייר טישו כדי להסיר כל הפיקדונות של חומר השומן שהצטבר על הקירות. עבור resuspension הסופי עדיף להשתמש בנפח נמוך של המאגר הסופי על מנת למזער אובדן של פונקציות המיטוכונדריה במהלך האחסון (150-200 μl של המאגר בכל לב). עבור מחקרים של הובלה של קטיונים divalent לא סוכני chelating חייבים להיות נוכחים לקראת הגמר המיטוכונדריה ולכן יש לשטוף כמה פעמים עם המדיום EGTA ללא בשימוש בתוך השעות הראשונות לאחר בידוד.

הכנה של הלב עכברוש מצמידים מאוד המיטוכונדריה

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

הפונקציה של המיטוכונדריה בדור הסלולר של ה-ATP בתהליך של זרחון חמצוני זוכה להכרה רחבה. במהלך העשורים האחרונים חלו התקדמות משמעותית להבנתנו את הפונקציות של אחרים במיטוכונדריה מאשר הדור של אנרגיה. אלה כוללים את תפקידם אפופטוזיס, מתנהג כמו איתות האברונים, פיתוח יונקים ההזדקנות, כמו גם תרומתם תיאום בין מטבוליזם התא ובחלוקה של תאים. ההבנה שלנו של תהליכים ביולוגיים מווסתת על ידי המיטוכונדריה מבוסס על שיטות חזקים בידוד וטיפול של המיטוכונדריה שלם מרקמות של חיות מעבדה. המיטוכונדריה מהלב עכברוש הוא אחד הנפוצים ביותר ההכנות ללימודים בעבר ובהווה של חילוף חומרים התאי, כולל מחקרים על עקום החוצה וחיות. כאן אנו מתארים שיטה מהירה מפורט עבור בידוד של המיטוכונדריה שלם עם רמה גבוהה של צימוד. הכנה כזו של הלב חולדה המיטוכונדריה הוא אובייקט מצוין עבור מחקר תפקודית מבנית על bioenergetics הסלולר, הובלה של ביומולקולות, מחקרים proteomic וניתוח של דנ&quot;א, חלבונים ושומנים במיטוכונדריה.

אנו מתארים פרוטוקול а עבור בידוד של לב טהור בשילוב עכברוש מאוד המיטוכונדריה ללימודי פונקציונליים או מבניים של bioenergetics הסלולר, מדידות biophysical, proteomics או הדנ&quot;א המיטוכונדרי וניתוח שומנים.

תפקידם של המיטוכונדריה ביצירת ATP תאי בתהליך הפוספורילציה החמצונית מוכר רבות. במהלך העשורים האחרונים...

אני ד"ר סקה. היום אראה לכם כיצד לבודד מיטוכונדריה מלב אדום. השלבים המרכזיים בבידוד מיטוכונדריה מרקמות הם תחילה פירוק של הרקמה והתאים באמצעות טיפול מכני או אנזימטי.שנית, סבב צנטריפוגה דיפרנציאלית במהירות נמוכה להסרת פסולת, תאים שבורים וגרעינים. ושלישית, סבב צנטריפוגה במהירות גבוהה יותר לאיסוף המיטוכונדריה. המכשור והתמיסות הוכנו ואוחסנו בחדר הקירור מראש.יש להקפיד על מספר תנאים במהלך הבידוד. ראשית, ביצוע פירוק יסודי של הרקמה, שכן הדבר משפיע ישירות על תנובת המיטוכונדריה. שנית, שמירה על טמפרטורה נמוכה לאורך כל השלבים, אך יש להיזהר מקפיאה יתרה של התמיסות, במיוחד במהלך הסנטריפוגציה.שלישית, ככל שהפעולה תבוצע במהירות רבה יותר, כך תהיה איכות המיטוכונדריה המתקבלת גבוהה יותר. בעלי החיים הוקרבו בהתאם לחוק הפרוצדורות המדעיות בבעלי חיים של בריטניה (UK Animal Scientific Procedure Act) וכל הפעולות הבאות בוצעו בחדר קירור. הכינו שלוש כוסות כימית המכילות 40 mils של תמיסת שטיפה.קררו זאת באמבט קרח למשך שלוש עד חמש דקות לפני המעבר לשלב הבא. הקפידו לא להקפיא את הדגימות יתר על המידה והשתמשו בהן מיד לאחר שמתחילו להופיע עננים של גבישי קרח; פתחו במהירות את החזה של ה-red שעורו ראשו והוציאו את הלב. בצעו חתכים קטנים, ולאחר מכן העבירו מיד את הלב לתמיסה קרה מאוד.בכוס הכימית הראשונה, סחטו את הלב כדי להוציא את הדם והעבירו אותו לכוס הכימית השנייה. חזרו על פעולה זו עבור כל לב. קירור מהיר ושטיפה של הלבבות שהוצאו חיוניים לקבלת תכשיר סטנדרטי נקי מהמוגלובין, תאי דם אדומים (erythrocytes) ו-adas.ייבשו את הלבבות על נייר סינון. הסירו במהירות את כל השומן, קרישי הדם והעורק. משכו את רקמת הפרוקידיום.לאחר מכן, יש להפריד את הרקמה באמצעות מספריים קטנים ומעוקלים על גבי צלחת פטרי. במשך חמש דקות, יש להניח את הרקמה בתוך ה-MIT. לחץ אותה והעבר אותה דרך המכשיר. לאחר לחיצת הרקמה, העבר את החומר לכוס כימיות המכילה 50 mls של בופר שטיפה ובצע ערבוב.לאחר מכן, סננו את התמיה דרך מסנן אי (island filter). שטפו את רקמת הגבר על המסנן שלוש פעמים עם בופר השטיפה והשליכו את המסנן. העבירו את הרקמה השטופה ל-20 mils של בופר שטיפה והניחו אותה באמבט קרח על המגנט החיצוני.הוסיפו טיפות לתמיסה תחת ערבוב קבוע והפעילו את הטיימר בדקה הרביעית של הדגירה. הומוגניזו קצרות את התוך-תלייה חלק אחר חלק, בכמויות קטנות, באמצעות הומוגנייזר זכוכית עם ציפוי Teflon קטן שאינו הדוק. לאחר ההומוגניזציה, העבירו את התוך-תלייה לכלי כימי אחר על גבי מערבב שני.חזור על הפרוצדורה בדקה התשעית, כך שתבצע את ההומוגניזציה פעמיים בסך הכל לאחר ההומוגניזציה השנייה. בדקה ה-15 של האינקובציה, הוסף 10 mls של בופר בידוד המכיל מעכב טריפסין והדגריז לדקה אחת נוספת. סנן שוב את התוך תלויים דרך מסנן ניילון. אך במקרה זה, שמור את התסנין, העבר את שאר הרקמה למהומוגניזר ובצע הומוגניזציה.במשך דקה נוספת, ערבבו את ההומוגנאט עם התסנין בתוך מבחנת הצנטריפוגה. ודאו שהמבחנות מאוזנות באופן שווה, ובצעו סנטריפוגה במהירות נמוכה למשך 15 דקות. ב-600 G, סננו בזהירות את העלייה שנוצרה למבחנת צנטריפוגה חדשה.נסו להימנע מזיהום על ידי משקע וסובבו שוב במצנטריפוגה למשך 15 דקות ב-8,500 G. לאחר סבוב במהירות גבוהה, השליכו את הנוזל העליון ושטפו את המשקע עם בופר, תוך ניסיון להסיר את שכבת השוליים החיצונית הלבנה והספוגית. הוסיפו מיליליטר אחד של בופר בידוד. הטו את המבחנה מצד לצד והסירו את שארית הבופר.פרקו את המשקע באמצעות ה-ula תוך ניסיון להימנע מהכתם האדום של כדוריות הדם האדומות בתחתית, או לחילופין, השעו את המשקע באמצעות הומוגניזטור קטן או באופן עדין, דללו את התמיה עם תמיסת בידוד נוספת וסבבו שוב בצנטריפוגה למשך 15 דקות ב-8,500 G. השליכו את העלייה (supernatant). השעו את המשקע בתמיסת השעיה Resus וסבבו שוב בצנטריפוגה ב-8,500 G. המשקע החום שמתקבל מכיל מיטוכונדריה שלמות שנשטפו. השעו את המשקע בנפח קטן מאוד של תמיסת השעיה resus.ככל שהנפח שבו תשתמשו יהיה נמוך יותר, כך תהיה הכנת המיטוכונדריה יציבה יותר. בדרך כלל, 200 µL של הבופר ללב אחד מספיקים. התפוקה הצפויה של המיטוכונדריה המוכנות היא כ-10 עד 15 mg של חלבון מיטוכונדריאלי ללב.ויחס הבקרת הנשימה (respiratory control ratio) על סובסטראטים של קומפלקס 1 בהכנה זו צריך להיות בין 8 ל-12. בהצלחה עם ההכנה.

preparation-of-highly-coupled-rat-heart-mitochondria

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

במאמר זה תיארנו את הדרך טיפוסי לבודד תרבות עכברוש מבוגר myocytes לב. Collagenase ו פרוטאז משמשים לעכל לבודד myocytes יחיד. Myocytes תרבותי לעקוב בפרוטוקול זה לעמוד בדרישות הניסוי ביותר.

תרבות ראשונית של הלב Myocytes למבוגרים עכברוש

פרוטוקול spectrofluorometric למדידת פתיחת מעבר המיטוכונדריה חדירות הנקבובית בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה מוצג כאן. הבדיקה כרוכה במדידה בו הזמנית של Ca...

מדידת פרמטר-Multi של הפתיחה הנקבובית מעבר החדירות בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה

שיטה לבידוד מהיר של המיטוכונדריה מביופסיות רקמות יונקים מתוארת. כבד חולדה או תכשירי שרירי שלד היה הומוגני עם Dissociator רקמה מסחרי ומיטוכונדריה היו מבודדת על ידי סינון ההפרש דרך מסנני רשת ניילון. זמן בידוד מיטוכונדריאלי הוא &lt;30 דקות בהשוואה ל60-100 דקות תוך שימוש בשיטות אלטרנטיביות.

בידוד מהיר וטיהור של מיטוכונדריה להשתלה על ידי דיסוציאציה רקמות ודיפרנציאל סינון

כמה פרוטוקולים פותחו ותיארו לבידוד של סוגי תאים לב שונים של הלב חולדה. כאן, פרוטוקול אופטימיזציה מתואר המאפשר בידוד של איכות גבוהה תאים מרכזיים של תאים לב (cardiomyocytes, תאים אנדותל, fibroblasts) מתוך הכנה אחת, הפחתת עלויות הניסוי.

בידוד סימולטני של Cardiomyocytes באיכות גבוהה, תאים אנדותל, ו Fibroblasts של לב עכברוש מבוגר

כאן, אנו מציגים שני פרוטוקולים עבור המידה של Ca2 + זרם מיטוכונדריאלי המיטוכונדריה מבודד, תאים בתרבית. עבור המיטוכונדריה מבודד, אנחנו פירוט של צלחת המבוסס על הקורא Ca2 + ייבוא assay באמצעות של Ca2 + רגיש לצבוע סידן ירוק-5N. עבור תאים בתרבית, אנו מתארים שיטה מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות Ca2 + לצבוע רוד-2/AM.

ניתוחים של סידן מיטוכונדריאלי זרם המיטוכונדריה מבודד, תאים בתרבית

כאן, אנו מתארים הליך ממוטבת, המבוססים על Langendorff על בידודו של תא בודד cardiomyocytes פרפור ממודל עכברוש מטבוליות הקשורות תסמונת באי ספיקת לב עם שבריר פליטה משומר. תקנה ידנית בלחץ intraluminal של חללים לב מיושם להניב המתאימים עירור-התכווצות-מצמד לימודי תקין מבחינה פונקציונלית נייטרלים.

בידוד של פרפור Cardiomyocytes ממודל עכברוש מטבוליות הקשורות תסמונת באי ספיקת לב עם שבריר פליטה משומר

הכנת דגימות מועשרות במיטוכונדריה מרקמות מוצקות שהוקפאו בעבר בארכיון אפשרה לחוקרים לבצע הערכות פונקציונליות ואנליטיות של המיטוכונדריה במודלים ניסיוניים שונים. מחקר זה מדגים כיצד להכין תכשירים מועשרים במיטוכונדריה מרקמת לב קפואה ולבצע הערכות אנליטיות של המיטוכונדריה.

מדידת מתחמי העברת אלקטרונים מיטוכונדריאליים ברקמת לב קפואה בעבר מצאצאי החזירה: מודל להערכת שינויים ביו-אנרגטית מיטוכונדריאליים הנגרמים על ידי פעילות גופנית

כאן, אנו מתארים שיטה מפורטת לבידוד המיטוכונדריה משריר השלד של העכבר ואת הניתוח הבא של נשימה על ידי שיעור צריכת חמצן (OCR) באמצעות בדיקות respirometric מבוססות מיקרופלט. צינור זה יכול להיות מיושם כדי לחקור את ההשפעות של התערבויות סביבתיות או גנטיות מרובות על חילוף החומרים המיטוכונדריאלי.

בידוד המיטוכונדריה משריר שלד העכבר לבדיקות ספירומטריות

שיטה זו מנצלת את התרומה של נקבובית המעבר לחדירות המיטוכונדרית לדליפת פרוטונים בהולכה נמוכה כדי לקבוע את סף המתח לפתיחת נקבוביות בעכברי תסמונת X שבירים בילודים עם תכולת קו-אנזים Q מיטוכונדריאלית מוגברת של קרדיומיוציטים בהשוואה לבקרת wildtype.

הערכה של הסתברות פתוחה של נקבוביית מעבר החדירות המיטוכונדרית בהגדרה של עודף קו-אנזים Q

מחקרים ביואנרגטיים ומטבוליים על מיטוכונדריה חשפו את תפקידם הרב-גוני במחלות רבות, אך שיטות הבידוד של אברונים אלה משתנות. השיטה המפורטת כאן מסוגלת לטהר מיטוכונדריה באיכות גבוהה ממקורות רקמה מרובים. האיכות נקבעת על ידי יחסי בקרת נשימה ומדדים אחרים המוערכים עם רספירומטריה ברזולוציה גבוהה.

בידוד מיטוכונדריאלי חזק מרקמת לב מכרסם 

למד שיטה לאיסולציה של מיטוכונדריות לב עכברוש טהורות ופעילות לחקר ביואנרגטיקה תאית. הפרוטוקול כולל הפרעה מכנית, סחיפה דיפרנציאלית ושמירה על טמפרטורה נמוכה לאיכות גבוהה.

הכנה של הלב עכברוש מצמידים מאוד המיטוכונדריה

גלה סרטונים נוספים