Name: תא אל תא Macromolecular התחבורה Assay ב Planta ניצול ההפגזה Biolistic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-27T17:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: למדו לנתח תנועת חלבונים מסומנים בפלואורסצנציה בין תאים באפידרמיס צמחי באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקל. שיטת ההפגזה הביוליסטית מאפשרת ביטוי זמני ומעקב אחר תחבורה מולקולרית בצמחים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

העבודה שלנו היא נתמך על ידי מענקים NIH / NIGMS, NSF, USDA / NIFA, ובארד ל VC.

רקע תחבורה Symplastic של מקרומולקולות דרך קשרים צמח אינטר, plasmodesmata, הוא עניין פתולוגים צמחים ביולוגים רבים. לדוגמה, חלבונים נגיפיים כמה ידועים להסדיר plasmodesmal הדרה מגבלות גודל לאפשר תנועה ויראלי 1-3. כמו כן, כמה חלבונים אנדוגניים, ביניהם הרגולטורים התפתחותי חשוב, הם הניחו לעבור מתא לתא, ככל הנראה באמצעות plasmodesmata, לתפקד ללא תאים עצמאי 4. לפיכך, מתודולוגיה אמין לזהות לדמיין תחבורה macromolecular בין בתאי צמח מבוקש מאוד. 1) לגדל את הצמחים היעד לקבלת יעילות הטרנספורמציה גבוה, בריא, צמחים חזקים אמור לשמש. 1. ארבידופסיס צמחים לגדול אחד צמח ארבידופסיס על Pro-BX מערבבים בסיר (10 ס"מ X 10 ס"מ X 10 ס"מ) בתא סביבה מבוקרת עם photoperiod קצר (8 שעות של אור μE 130-150 מ 's -2 -1 ב 23 ° C/16 hr כהה 20 ° C) ו 40-65% לחות יחסית במשך 6 עד 8 ​​שבועות 5. לדשן אותם מדי פעם עם מוצרים זמינים מסחרית כמתואר 5. עלים עם גודל גדול יותר מאשר 15 מ"מ x 35 מ"מ (מדידת אורך כולל פטוטרת) נבחרו הניסויים. 2. נ benthamiana ונ tabacum לגדול אחד צמח ב Pro-BX מערבבים בסיר (20 ס"מ X 20 ס"מ X 20 ס"מ) בתא סביבה מבוקרת עם photoperiod ארוך (16 שעות של 130-150 μE אור מ -2 -1 s ב 23 ° C / 8 שעות חושך על 20 ° C) ו 40-65% לחות יחסית במשך 7 עד 10 שבועות. לדשן אותם מדי פעם עם מוצרים זמינים מסחרית כמו לתאר. עלים עם מ"מ גודל גדול יותר מאשר 50 מ"מ x 70 עבור נ benthamiana, או 100 מ"מ x 125 מ"מ נ tabacum (מדידות אלה אורך אינם כוללים פטוטרת) נבחרו הניסויים. 2) הכנת דיו Gene Gun עם ה-DNA מצופה זהב microparticles הפרוטוקול של שלב זה ניסיוני תוארה בפירוט בעבר 6. חשוב מאוד להשתמש DNA פלסמיד מטוהרים היטב בריכוזים גבוהים (~ 1 מיקרוגרם / μl) כדי להשיג את יעילות השינוי הגבוה ביותר להקל על ניתוח מיקרוסקופיה confocal בשלבים מאוחרים יותר של הניסוי. עבור assay זה, חשוב לוודא כי המחסנית אינה מוכנה להפוך שניים או יותר תאים סמוכים בעת ובעונה אחת בתדירות גבוהה, כי המספרים של תאים להתרועע עם מקבץ אות ניאון משמש כאינדיקטור של היקף התחבורה symplastic (כלומר , תא יחיד המכיל את האות מציין שאין תנועה, ואילו מקבץ אות multicell מציין תנועה). האיכות של כל מחסנית ניתן לבדוק על ידי ניתוח ביטוי הפגזה 16-20 חלבון שלאחר שעות. פרוטוקול שלנו 6 מייצרת מחסניות כי התשואה אשכולות multicell ביטוי רק 3% &lt;כל אירועי ביטוי במסגרת הזמן הזה, ולכן מתאים לניסוי זה. 3) משלוח Biolistic של DNA מצופה microparticles <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העלים של השלב ההתפתחותי אותו (כלומר עם אותו גודל וגיל אותו, ראה שלב 1) עם סכין גילוח חד ומיד למקם אותם עם הצדדים abaxial פונה כלפי מעלה על גבי משטח קלקר שטוחה. הצד abaxial של העלה מהווה מצע טוב יותר עבור הפגזה בשל צפיפות נמוכה שלה trichome ו לציפורן רזה. עלים ארבידופסיס, בגלל גודלו הקטן יחסית שלהם, צריך להיות מכוסה בחתיכת רשת המסך חלון, רשת מאובטחת אז עם נעצים על פני השטח קלקר. שמירה על עלים שטוחים מגדיל את היעילות של משלוח החלקיקים ממזער את הנזק לרקמות במהלך microbombardment. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את מחסנית עם DNA מצופה microparticles (מוכן בשלב 1) לתוך האקדח. עבור ארבידופסיס, הירי מתבצע בלחצים של 80-110 psi עבור 1-מיקרומטר microparticles, ו 140-160 psi עבור 0.6-מיקרומטר microparticles. עבור נ benthamiana וטבק, הירי מתבצע בלחץ של 100-120 psi עבור 1-מיקרומטר microparticles, ו 160-180 psi עבור 0.6-מיקרומטר microparticles. עבור ארבידופסיס, אנחנו בדרך כלל לנצל מחסנית אחת לכל עלה, עלה כי לכל אחד יש שטח מספיק רק ירייה אחת microparticles המשתרע על פני שטח של 10-12 מ"מ קוטר. עם נ 'גדול יותר benthamiana ועלי טבק, הפגזות מרובות העלה אותו הם אפשריים, אך הם חייבים להיעשות עמדות סימטרית בכל צד של הצלע אמצע היעד באזורים עלה בשלב התפתחותי זהה (ראה דיון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העלים מעל פני קלקר ולמקם אותם אנילא צלחת פטרי על 3 שכבות של נייר סינון רטוב Whatman, לאטום את צלחת פטרי עם Parafilm ו דגירה אותו בטמפרטורת החדר למשך 36-48 שעות, כדי לאפשר ביטוי transgenes נמסר פוטנציאל התא אל התא התנועה של מוצרי החלבון שלהם . </li></ol> 4) הדמיה של ביטוי חלבון אות הניאון של החלבונים המתויגים הביע transiently הוא מדמיין על ידי מיקרוסקופיה confocal. יש להקפיד למצוא הגדרות אופטימליות במיקרוסקופ לצורך זיהוי של כל חלבון נבדק. לדוגמה, חלבונים להראות הצטברות תאיים מוגבל עם עוצמות אות חלש, כגון לוקליזציה plasmodesmal של חלבון פסיפס טבק תנועה וירוס (TMV MP) 1-3,6, יש לשים לב תחת עדשת אובייקטיבי 40X, אשר מאפשר רזולוציה גבוהה יותר רגישות, ואילו חלבונים להראות הפצה cytoplasmic עם עוצמות איתות חזק, כגון YFP בחינם, ניתן דמיינו תחת עדשת אובייקטיבי 10X עם פונקציית זום confocal הדמיה מהר יותר (ראה איור 1). תחבורה Symplastic הוא להסיק הופעתו של אשכולות multicell המכילים את האות ניאון. מספר אשכולות כאלה מספר התאים באשכול זה מעיד על היקף התחבורה התא אל התא. כדי לקבל נתונים אמינים, לפחות 100 אשכולות הביטוי צריך להיות לכל נרשם כל מערכת ניסיונית. לדוגמה, אם תנועת התא אל התא של חלבון בהשוואה בשני רקע גנטי שונה (למשל, סוג בר וצמחים מהונדס), של 200 אשכולות סך הביטוי צריך להיות מוקלט. חשוב לציין, ניסויים, תוצאות אשר יש לעומת זה, צריכים להתבצע בעת ובעונה אחת. 5. נציג תוצאות האיור שלהלן מדגים ניסויים נציג לצורך זיהוי של תחבורה symplastic של החלבונים המתויגים fluorescently. לוחות A ו-B להראות את התמונות confocal טיפוסי מתקבלים microbombardment הבאות של נ עלה benthamiana עם TMV MP-YFP-לבטא לבנות. בלוח תנועה, symplastic של TMV MP-YFP הוא ציין המבוססת על הופעתו של אשכולות multicell האות YFP. לא כל TMV הביע transiently MP-YFP הוא מסוגל לנוע כפי שמעידים אותות מתא בודד בחלק microbombardments (לוח ב '). סטטיסטית, ב &lt;40% אשכולות אותות ספרתי, TMV MP-YFP אינו מסוגל לנוע בין התאים ואילו&gt; 60% של אשכולות, החלבון נע בין 2-5 תאים, עם התפשטות שני תאים להיות השכיח ביותר (כ ~ 50% מהמקרים) (תרשים 1C). חלבונים בעלי גודל מולקולרי קטן יחסית ללא פעילות תנועת מולדת יכול לנטרל באמצעות פ"ד לעבור תא אל תא. לדוגמה, YFP חינם, או 1xYFP (בערך 27 kDa, לוח ד '), מתפשט בין תאים בכמה 30% של אשכולות ספרתי (לוחות ג). זו דיפוזיה הלא ספציפית אינו מתרחש עבור דימר YFP translational, או 2xYFP (54 kDa, פאנל E), אשר דומה בגודלו חלבון MP-YFP היתוך TMV (57 KDA), ואשר לחלוטין תאים אוטונומיים (איור 1C). <img src="/files/ftp_upload/2208/2208fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. תוצאות אופייניות שהתקבלו assay התחבורה symplastic ב נ benthamiana עלה רקמות. (A, B) ויזואליזציה של TMV MP-YFP. (ג) quantitation של אשכולות האות. 1xYFP ו 2xYFP, חינם YFP ו translational YFP דימר, בהתאמה. (ד) ויזואליזציה של 1xYFP. (ה) ויזואליזציה של 2xYFP. ב micrographs, לוחות שמאל להראות את האות YFP ואת לוחות הזכות להציג תמונות הממוזגת של YFP (בירוק) ואת autofluorescence הכלורופלסט (בלבן) אותות. תמונות קטעים confocal יחיד. כוכביות ב micrographs את ההצגה בתאי האפידרמיס מראה אות YFP. ברים = 50 מיקרומטר.

<ol><li>Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ins+and+outs+of+non-destructive+cell-to-cell+and+systemic+movement+of+plant+viruses.+%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. </a> Crit Rev Plant Sci. 23, 195-250 (2004).</li>
<li>Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+viral+movement+proteins%3A+agents+for+cell-to-cell+trafficking+of+viral+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Plant viral movement proteins: agents for cell-to-cell trafficking of viral genomes.</a> Virology. 344, 169-184 (2006).</li>
<li>Epel, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+viruses+spread+by+diffusion+on+ER-associated+movement-protein-rafts+through+plasmodesmata+gated+by+viral+induced+host+beta-1%2C3-glucanases%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Plant viruses spread by diffusion on ER-associated movement-protein-rafts through plasmodesmata gated by viral induced host beta-1,3-glucanases.</a> Semin Cell Dev Biol. 20, 1074-1081 (2009).</li>
<li>Zambryski, P. C., Crawford, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata%3A+gatekeepers+for+cell-to-cell+transport+of+developmental+signals+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata: gatekeepers for cell-to-cell transport of developmental signals in plants.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 393-421 (2000).</li>
<li>Rivero-Lepinckas, L., Crist, D., Scholl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+plants+and+presercation+of+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth of plants and presercation of seeds.</a> Methods Mol Biol. 323, 3-12 (2006).</li>
<li>Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+transient+genetic+transformation+of+Arabidopsis+leaves+by+biolistic+bombardment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment.</a> Nat Protoc. 4, 71-77 (2009).</li>
<li>Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple%2C+but+not+branched%2C+plasmodesmata+allow+the+nonspecific+trafficking+of+proteins+in+developing+tobacco+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Simple, but not branched, plasmodesmata allow the nonspecific trafficking of proteins in developing tobacco leaves.</a> Cell. 97, 743-754 (1999).</li>
<li>Imlau, A., Truernit, E., Sauer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+and+long-distance+trafficking+of+the+green+fluorescent+protein+in+the+phloem+and+symplastic+unloading+of+the+protein+into+sink+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell and long-distance trafficking of the green fluorescent protein in the phloem and symplastic unloading of the protein into sink tissues.</a> Plant Cell. 11, 309-322 (1999).</li>
<li>Gisel, A., Barella, S., Hempel, F. D., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+regulation+of+symplastic+trafficking+during+development+in+Arabidopsis+thaliana+apices%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial regulation of symplastic trafficking during development in Arabidopsis thaliana apices.</a> Development. 126, 1879-1889 (1999).</li>
<li>Kim, I., Cho, E., Crawford, K. M., Hempel, F. D., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+movement+of+GFP+during+embryogenesis+and+early+seedling+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell movement of GFP during embryogenesis and early seedling development in Arabidopsis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 102, 2227-2231 (2005).</li>
<li>Crawford, K. M., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-targeted+and+targeted+protein+movement+through+plasmodesmata+in+leaves+in+different+developmental+and+physiological+states%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states.</a> Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).</li>
<li>Roberts, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+unloading+in+sink+leaves+of+Nicotiana+benthamiana%3A+comparison+of+a+fluorescent+solute+with+a+fluorescent+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Phloem unloading in sink leaves of Nicotiana benthamiana: comparison of a fluorescent solute with a fluorescent virus.</a> Plant Cell. 9, 1381-1396 (1997).</li>
<li>Guenoune-Gelbart, D., Elbaum, M., Sagi, G., Levy, A., Epel, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+mosaic+virus+%28TMV%29+replicase+and+movement+protein+function+synergistically+in+facilitating+TMV+spread+by+lateral+diffusion+in+the+plasmodesmal+desmotubule+of+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Tobacco mosaic virus (TMV) replicase and movement protein function synergistically in facilitating TMV spread by lateral diffusion in the plasmodesmal desmotubule of Nicotiana benthamiana.</a> Mol Plant Microbe Interact. 21, 335-345 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

המפתח להצלחה של assay התחבורה symplastic היא להשיג יעילות הטרנספורמציה גבוהה, המאפשרת ייצור של אשכולות אות מובהק סטטיסטית ו detectible בקלות. זו יכולה להיות מושגת באמצעות עלים שנקטפו מן, צמחים חזקים ובריאים, והכנת חלקיקי זהב מצופה על ידי הכנה דנ&quot;א טהור ומרוכז. שימוש עלים בשלב צמיחה זהה גם חיוני לאמינות assay. Plasmodesmal הצמצם ידוע להיות מוסדר באופן דיפרנציאלי, בהתאם לשלב ההתפתחותי של רקמת 7-11. ...

<table><tbody><tr><td>מיקרו-חלקיקי זהב, בקוטר 1.0 &amp;mu;m</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2262</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-חלקיקי זהב, בקוטר 0.6 &amp;mu;m</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2263</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0266-1G</td><td></td></tr><tr><td>צינורית Tefzel</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2441</td><td></td></tr><tr><td>תחנת הכנה למחסנית Helios</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2420</td><td></td></tr><tr><td>חותך צינוריות</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2422</td><td></td></tr><tr><td>רובה גנים Helios</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2432</td><td></td></tr><tr><td>ווסת גז הליום</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2413</td><td></td></tr></tbody></table>

תא אל תא macromolecular התחבורה assay ב planta ניצול ההפגזה biolistic

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

כאן, אנו מציגים פרוטוקול פשוטה ומהירה כדי לזהות ולהעריך את מידת התא אל התא תחבורה מולקולארית Planta. בפרוטוקול זה, fluorescently מתויג חלבון עניין מתבטא transiently ברקמות הצמח לאחר הלידה biolistic קידוד של ה-DNA שלה לבנות. הפצה התוך ואת אינטר של החלבון מתויג הוא ניתח מכן על ידי מיקרוסקופיה confocal. אנו מתארים את הטכנולוגיה הזו בפירוט, מתן צעד אחר צעד הפרוטוקולים assay ולהעריך את היקף התחבורה חלבון symplastic בשלושה מיני צמחים, thaliana ארבידופסיס, ניקוטיאנה benthamiana ונ tabacum (טבק).

הסחר בין Macromolecular בתאי צמח ניתן להעריך על ידי transiently לבטא חלבון fluorescently-tagged עניין וניתוח ההפצה התוך ואת אינטר שלה על ידי מיקרוסקופיה confocal.

תא אל תא Macromolecular התחבורה Assay ב Planta ניצול ההפגזה Biolistic

כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט ומהיר לזיהוי ולהערכת היקף התובלה של מקרו-מולקולות בין תאים in planta. בפרוטוקול זה, ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לנתח את מידת התנועה של חלבון המסומן פלואורסצנטית מתא לתא באפידרמיס של צמחים. דבר זה מושג על ידי השגת חלקיקי זהב מצופים ב-DNA כדי לבטא באופן זמני את חלבון היתוך (fusion protein) הרלוונטי באפידרמיס של הצמח. כשלב שני, ה-DNA מועבר אל תוך אפידרמיס הצמח, מה שמאפשר את הביטוי והתנועה של חלבון היתוך הנבדק.בשלב הבא, החלבון המהולל (fusion protein) שהובע נבחן תחת מיקרוסקופ קונפוקלי במטרה לעקוב אחר הביטוי והמיקום של החלבונים הנבדקים המסומנים בסימון פלואורסצנטי. התוצאות המתקבלות מראות את היקף ההובלה של החלבון המסומן פלואורסצנטית בין תאים, בהתבסס על ניתוח התפלגות האות הפלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. שלום, אני בן מאיירס מהמעבדה של KY במחלקה לביוכימיה וביולוגיה של התא באוניברסיטת מדינת ניו יורק בסטוני ברוק.היום נדגים לכם פרוצדורה לניתוח היקף התנועה בין תאים של חלבון המסומן פלואורסצנטית באפידרמיס של צמחים. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את ההובלה בין תאים של חלבוני תנועה של נגיפי צמחים ברקעים צמחיים שונים, וכדי להשוות את הניידות בין תאים של סוגים שונים של חלבונים. אז בואו נתחיל.כדי להתחיל בפרוטוקול זה, גדלו צמח arabidopsis אחד על Promix bx. בעציץ בגודל מתאים, השתמשו בתא עם בקרה סביבתית עם תקופת תאורה קצרה ו-40 עד 65% relative humidity. עבור

a-cell-to-cell-macromolecular-transport-assay-planta-utilizing

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פיתחנו טכניקה כדי לבדוק חלבונים אינטראקציות במפעל. חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) מחולק לשני קטעים שאינן חופפות. שבר כל משובטים בתוך מסגרת של גן ריבית באמצעות מערכת Gateway, המאפשר ביטוי של חלבונים היתוך. הכינון של האות YFP מתרחשת רק כאשר החלבונים החקירה אינטראקציה.

איתור של אינטראקציות חלבון הצמח באמצעות bimolecular תואם Gateway הקרינה השלמה (BiFC) מערכת

אנו מתארים שיטה למעקב אחר קרע endomembrane שהושרו על ידי החיידקים תוך...

מידות תא יחיד של קרע vacuolar נגרמים על ידי פתוגנים תאיים

פירוק חלבונים ממוקד מייצג מנגנון רגולציה עיקרי לתפקוד תא. היא מתרחשת באמצעות מסלול היוביקוויטין-proteasome נשמרים, אשר מייחס רשתות polyubiquitin לחלבון המטרה שלאחר מכן ישמש "תגים" מולקולריים להפרוטאזום 26S. כאן, אנו מתארים assay תא ללא פשוט ואמין לשפלת proteasomal של חלבונים.

מנסה לאמוד השפלה proteasomal במערכת תא ללא בצמחים

היווצרות של קומפלקסי חלבוני in vivo ניתן דמיינו ידי שלמת הקרינה bimolecular. שותפי אינטראקציה הם התמזגו לחלקי משלימים של תגי ניאון והביעו transiently בי טבק, וכתוצאה מכך אות ניאון מחדש על סמיכות של שני חלבונים.

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

כימות צמיחת פתוגנים הוא כלי רב עוצמה לאפיון תגובות חיסוניות שונות של Arabidopsis thaliana (להלן: Arabidopsis). השיטה המתוארת כאן מציגה בדיקת חדירת מזרק אופטימלית לכימות Pseudomonas syringae pv. מקוליקולה גידול ES4326 בעלים בוגרים של Arabidopsis.

חיידקי עלה הסתננות Assay עבור אפיון פיין של תגובות הצמחים ביטחון באמצעות<em&gt; Thaliana-Pseudomonas ארבידופסיס syringae</em&gt; Pathosystem

ברמה התת-תאית, אירועי איתות מווסתים באופן דינמי על ידי רמזים התפתחותיים וסביבתיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול המשתמש במערכת הביטוי החולפת של הטבק כדי לנטר אינטראקציה דינמית של חלבון-חלבון ולחשוף ארגון מרחבי של העברת אותות בתאי צמחים.

הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות MAPK שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק

לשיטות הקיימות לשינוי צמחים יש ישימות מוגבלת. הטכנולוגיה החדשנית שמקורה בפפטיד המוצעת כאן מבטיחה הן פשטות והן יעילות בהחדרת חלבון או גנים אקסוגניים לתאים התוך-תאיים הרצויים של צמחים שלמים.

פפטיד הנגזרות שיטה לתחבורה גנים וחלבונים מעבר נייד מחסומי Organellar בצמחים

צמח חיבורי המערכת, plasmodesmata (Pd), ממלאים תפקידים מרכזי במפעל אינטראקציות פיזיולוגיה של הצמח-וירוס. קריטי להעביר Pd המיון מתבצע אותות ישיר חלבונים לתחנת משטרה. עם זאת, הידע שלנו על רצפי אלה הוא עדיין בחיתוליו. אנו מתארים אסטרטגיה כדי לזהות Pd אותות לוקליזציה בחלבונים Pd, ממוקדות.

זיהוי של לוקליזציה Plasmodesmal רצפי חלבונים ב הפיסקו

פרוטוקול משופרת מוצג עבור המידה של ביטוי גנים ארעי מן הכתב בונה בתאים aleurone שעורה לאחר הפגזה של חלקיקים. השילוב של תבואה אוטומטיות שיוף עם צלחת 96-ובכן אנזים מבחני מספק תפוקה גבוהה עבור ההליך.

מדידת ביטוי גנים בשכבות Aleurone שעורה מופגז עם תפוקה מוגברת

פיתחנו שיטה לביטוי בשיתוף מספר חלבונים chimeric פיוז'ן פלורסנט בצמחים כדי להתגבר על הקשיים של שיטות קונבנציונליות. זה לוקח את היתרון שבשימוש של פלסמיד ביטוי יחיד המכיל מספר חלבון פונקציונלית עצמאית המבטאת קלטות כדי להשיג חלבון ביטוי משותף.

ביטוי משותף של מספר חלבונים Chimeric פיוז'ן פלורסנט בדרך יעילה בצמחים

פרוטוקול זה מתאר גישה בעלת תפוקה גבוהה להערכת דליפת יוני צמחים, פעילות פרוקסידאז וייצור קלוז באותה דגימה.

הערכת תגובות עלים למטבוליטים משניים מיקרוביאליים באמצעות פורמט בעל תפוקה גבוהה

למדו לנתח תנועת חלבונים מסומנים בפלואורסצנציה בין תאים באפידרמיס צמחי באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקל. שיטת ההפגזה הביוליסטית מאפשרת ביטוי זמני ומעקב אחר תחבורה מולקולרית בצמחים.

תא אל תא Macromolecular התחבורה Assay ב Planta ניצול ההפגזה Biolistic

גלה סרטונים נוספים