תא אל תא Macromolecular התחבורה Assay ב Planta ניצול ההפגזה Biolistic
27 באוגוסט 2010
הסחר בין Macromolecular בתאי צמח ניתן להעריך על ידי transiently לבטא חלבון fluorescently-tagged עניין וניתוח ההפצה התוך ואת אינטר שלה על ידי מיקרוסקופיה confocal.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לנתח את מידת התנועה של חלבון המסומן פלואורסצנטית מתא לתא באפידרמיס של צמחים. דבר זה מושג על ידי השגת חלקיקי זהב מצופים ב-DNA כדי לבטא באופן זמני את חלבון היתוך (fusion protein) הרלוונטי באפידרמיס של הצמח. כשלב שני, ה-DNA מועבר אל תוך אפידרמיס הצמח, מה שמאפשר את הביטוי והתנועה של חלבון היתוך הנבדק.
בשלב הבא, החלבון המהולל (fusion protein) שהובע נבחן תחת מיקרוסקופ קונפוקלי במטרה לעקוב אחר הביטוי והמיקום של החלבונים הנבדקים המסומנים בסימון פלואורסצנטי. התוצאות המתקבלות מראות את היקף ההובלה של החלבון המסומן פלואורסצנטית בין תאים, בהתבסס על ניתוח התפלגות האות הפלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. שלום, אני בן מאיירס מהמעבדה של KY במחלקה לביוכימיה וביולוגיה של התא באוניברסיטת מדינת ניו יורק בסטוני ברוק.
היום נדגים לכם פרוצדורה לניתוח היקף התנועה בין תאים של חלבון המסומן פלואורסצנטית באפידרמיס של צמחים. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את ההובלה בין תאים של חלבוני תנועה של נגיפי צמחים ברקעים צמחיים שונים, וכדי להשוות את הניידות בין תאים של סוגים שונים של חלבונים. אז בואו נתחיל.
כדי להתחיל בפרוטוקול זה, גדלו צמח arabidopsis אחד על Promix bx. בעציץ בגודל מתאים, השתמשו בתא עם בקרה סביבתית עם תקופת תאורה קצרה ו-40 עד 65% relative humidity. עבור צמחי nicotiana, hamana ו-nicotiana tobacco, גדלו כל צמח על Promix BX בעציץ גדול יותר. שוב, ספקו תא עם בקרה סביבתית עם תקופת תאורה ארוכה ו-40 עד 65% relative humidity.
יש לדשן את הצמח מדי פעם באמצעות מוצרים זמינים מסחרית כפי שתואר בעבר. לאחר גידול צמח ה-Opsis במשך שש עד שמונה שבועות, בחרו עבור הניסוי עלים שגודלם עולה על 15 millimeter על 35 millimeter, כאשר מדידת האורך כוללת את ה-peole. עבור צמחי n benanna ו-NAC, גדלו את הצמחים במשך שבעה עד 10 שבועות. לאחר מכן, בחרו עלים שגודלם עולה על 50 millimeter על 70 millimeter עבור end benanna ו-100 millimeter על 125 millimeter עבור nac.
במקרים אלו, מדידות האורך אינן כוללות את ה-peole. לפני תחילת ה-BIC של מיקרו-חלקיקים מצופים ב-DNA, יש להכין את מחסנית תותח הגנים עם מיקרו-חלקיקי זהב מצופים ב-DNA כפי שתואר בעבר בפירוט. לאחר מכן, יש להסיר את העלים מאותו שלב התפתחותי באמצעות להב תער חד, ולהניחם מיד על משטח קלקר שטוח כאשר צד ה-AAL פונה כלפי מעלה.
הצד ה-ABA של העלה מהווה מצע טוב יותר להפגזה בשל צפיפות הטרכיאות הנמוכה יותר והקוטיקולה הדקה יותר שלו. ניתן לקבע עלים קטנים, כגון אלו של *Raphanus sativus*, על ידי כיסוי עם פיסת רשת של רשת חלון וקיבוע הרשת באמצעות סיכות דחיפה למשטח הסטירופום. יש לשמור על העלים שטוחים כדי להגביר את יעילות העברת החלקיקים ולמזער את הנזק לרקמה במהלך המיקרו-הפגזה.
לאחר מכן, הכניסו למכשיר את המחסנית עם המיקרו-חלקיקים המצופים ב-DNA. עבור עין של ארנב, בצעו את הירי בלחצים של 140 עד 160 PSI עבור מיקרו-חלקיקים בגודל 0.6 micron.
בצע הפגזה של הדגימה באמצעות מחסנית אחת לכל עלה כדי לפזר את המיקרו-חלקיקים על שטח פנים בקוטר של 10 עד 12 מילימטרים. עבור end benanna ו-end baum. בצע את הירי בלחצים של 160 עד 180 PSI עבור מיקרו-חלקיקים של 0.6 מיקרון עם עלי end benanna ו-end tobacco גדולים יותר.
ניתן לבצע מספר הפצצות על אותו עלה, עם זאת, יש לבצען במיקומים סימטריים משני צידי העורק המרכזי כדי לטרגט אזורי עלה שנמצאים באותו שלב התפתחותי. האות הפלואורסצנטי של החלבונים המסומנים שהובעו באופן זמני ניתן להדמיה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי. יש להקפיד על מציאת הגדרות מיקרוסקופיה אופטימליות לזיהוי של כל חלבון שנבדק.
השתמש בעדשת אובייקטיב 40x כדי לצפות בחלבונים המראים הצטברות תוך-תאית מוגבלת עם עוצמות אות חלשות, כגון הלוקליזציה של חלבון התנועה של נגיף פסיפס הטבק, T-M-V-M-P, בממברנה הפלזמית. דבר זה מאפשר רזולוציה גבוהה יותר ורגישות מוגברת. עם זאת, ניתן להשתמש בעדשת אובייקטיב 10x עם פונקציית זום קונפוקאלית לצילום מהיר יותר של חלבונים המראים התפלגות ציטופלזמית עם עוצמות אות חזקות, כגון חלבון פלואורסצנטי צהוב חופשי או YFP. הובלה פשוטה נסמכת על הופעתם של מקבצי תאים רב-תאיים המכילים את האות הפלואורסצנטי.
מספר צבירים אלו ומספר התאים בכל צביר מעידים על היקף התובלה בין תא לתא. כדי להשיג נתונים מהימנים, רשמו לפחות 100 צבירי ביטוי למערכת ניסויית, והקפידו לבצע את הניסויים בו-זמנית.
בשלב זה תבוצעו השוואות. כאן, זוהה הובלה פשוטה של חלבונים המסומנים בסימון פלורסצנטי. מוצגות תמונות קונפוקליות טיפוסיות שהתקבלו לאחר הפצצה מיקרוסקופית (micro bombardment) של עלה של end hamana עם מבנה המבטא A TMV mp YFP.
תנועה פשוטה של TMV MP YFP נצפית על בסיס הופעתם של מקבצי תאים רב-תאיים של אות ה-YFP. עם זאת, לא כל TMV MP YFP שהובע באופן זמני מסוגל לנוע, כפי שמעיד אות של תא בודד בחלק מההפגזות המיקרוסקופיות.
מבחינה סטטיסטית, בפחות מ-40% מצבירי האותים שנספרו, TMV MP YFP אינו מסוגל לנוע בין תאים. לעומת זאת, ביותר מ-60% מהצבירים, החלבון נע בין שניים לחמישה תאים. כאשר התפשטות לשני תאים היא השכיחה ביותר, חלבונים בעלי גודל מולקולרי קטן יחסית ללא פעילות תנועה מולדת יכולים להתפשט דרך SMA של הפלזמה כדי לנוע מתא לתא.
לדוגמה, YFP חופשי או XYFP אחד מתפשטים בין מספר תאים ובמעל ל-30% מהצבירים שנספרו. לעומת זאת, דיפוזיה לא ספציפית זו אינה מתרחשת עבור דימר YFP תרגומי או שני XYFP, שגודלם דומה לחלבון היתוך TMV MP YFP והם בעלי אוטונומיה תאית מלאה. הרגע הדגמנו כיצד לנתח תנועה של חלבונים מתויגים פלואורסצנטית בין תאים באמצעות ביטוי זמני על ידי מערכת gene gun באפידרמיס של צמחים.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להכין צמחים בריאים וחזקים, חלקיקי זהב מצופים ב-DNA באיכות גבוהה להחדרת ה-DNA, ולנתח מספיק מקבצי ביטוי (expression clusters) כדי לקבל תוצאות מהימנות מבחינה סטטיסטית. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את התנועה מתא לתא של חלבון המסומן בתווית פלואורסצנטית באפידרמיס של צמחים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. הניסוי כולל ביטוי ארעי של חלבון ההיתוך כדי לנתח את התפלגותו בתוך תאים וביניהם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה של הצמח
- ביולוגיה של התא
- טכניקות מיקרוסקופיה
רקע
- הבנת תעבורת מקרו-מולקולות היא חיונית בביולוגיה של הצמחים.
- סימון פלואורסצנטי מאפשר ויזואליזציה של תנועת חלבונים.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית מספקת דימוי ברזולוציה גבוהה של מבנים תאיים.
- טכניקות לביטוי זמני משמשות באופן נפוץ לצורך אנליזה של חלבונים.
מטרת המחקר
- להערכת היקף ההובלה של חלבון מסומן פלואורסצנטית מתא לתא.
- שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית לניטור לוקליזציה של חלבונים.
- העמקת ההבנה של דינמיקת חלבונים בתאי צמחים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- חלקיקי זהב מצופים ב-DNA משמשים להחדרת חלבון ההיתוך.
- חלבון ההיתוך מובע באופן זמני באפידרמיס של הצמח.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית משמשת לתצפית על התפלגות החלבון.
- אותות פלואורסצנציה מנותחים כדי לקבוע את היקף ההובלה.
תוצאות עיקריות
- התוצאות מעידות על תנועה משמעותית של החלבון המסומן פלואורסצנטית בין תאים.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשרת ויזואליזציה יעילה של מיקום החלבון.
- ניתוח ההתפלגות חושף תובנות לגבי מנגנוני ההובלה של החלבון.
- הממצאים תורמים להבנת התקשורת הבין-תאית בצמחים.
מסקנות
- המחקר מדגים בהצלחה את השימוש בתיוג פלואורסצנטי למעקב אחר תנועת חלבונים.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית מוכיחה את עצמה ככלי בעל ערך בביולוגיה של תאי צמחים.
- מחקרים עתידיים עשויים לבחון גורמים נוספים המשפיעים על הובלת חלבונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך המנהלים
הערכה כמותית של הובלה מקרו-מולקולרית מתא לתא במערכות צמחים היא קריטית להפחתת סיכונים במנגנונים ביולוגיים ותיקוף מטרות במסלולי פיתוח של ביוטכנולוגיה של צמחים. בדיקה זו מאפשרת ויזואליזציה ומדידה ישירה של ניידות חלבונים, ובכך תומכת בביטחון חיזוי בחקירת מסלולים ובתיקוף תפקודי. גישה זו ממוקמת במפגש שבין גילוי מוקדם למחקר תרגומי, ומספקת מידע לקבלת החלטות לגבי תיקי פיתוח במחקר ופיתוח מבוסס צמחים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה ישירה של ניידות חלבונים וקישוריות של מסלולים ברקמות צמחים.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבחנה בין חלבונים ניידים לחלבונים אוטונומיים לתא.
- מסייע בתיקוף תפקודי של מטרות באמצעות ניתוח כמותי של הובלה בין-תאית.
- מספק ביטחון חיזוי עבור אסטרטגיות של מודולציה גנטית או כימית בשלבים הבאים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ביסוס מערכות מאושרות של רקמות צמחים עבור בדיקות הובלה הניתנות לשחזור.
- תיקנון של קריאות כמותיות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית להשוואה איתנה בין מבנים גנטיים שונים.
- מתן אפשרות לסריקה ניתנת להרחבה של וריאנטים של חלבונים או מודולטורים של תנועה בהקשר מבוקר.
- תמיכה בהערכה מהימנה של חלבונים מועמדים לתפקודים הקשורים לניידות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם אסטרטגיות של סממנים ביולוגיים תרגומיים באמצעות כימות תנועת חלבונים במודלים צמחיים רלוונטיים למחלה.
- מבטיח רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של מנגנוני הובלה.
- מפחית סיכונים בקבלת החלטות על קידום המחקר באמצעות אספקת ראיות מנגנוניות לתעבורה בין-תאית.
- תומך במידול חזוי של הובלת מקרו-מולקולות במערכות צמחים מהונדסות.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
בדיקה זו משתלבת ברצף שבין שלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומגשרת בין מחקרים מכניסטיים מוקדמים לבין תיקוף תרגומי בתהליכי עבודה של ביוטכנולוגיה של צמחים.
- ביולוגיה של גילוי: מכמת תנועת חלבונים המונחית על ידי היפותזה ומבהיר קישוריות של מסלולים in planta.
- סריקה: מספקת נתוני הובלה כמותיים וניתנים לשחזור לצורך בחירת מועמדים ואופטימיזציה.
- אנליטיקה: מספקת פלטים סטטיסטיים על גודל ותדירות של צבירים (clusters) להשוואת ניידות חלבונים בין מבנים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר נתוני הובלה מכניסטיים לתוצאות תפקודיות במודלים צמחיים מהונדסים או רלוונטיים למחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה סטנדרטית וניתנת לשימוש חוזר למחקרי ניידות חלבונים שוטפים בתוכניות מו"פ.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי הובלה בצמחים.
- ערך תפעולי: מספק תהליכי עבודה סטנדרטיים, ניתנים להרחבה ולשחזור להערכת ניידות חלבונים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ומשפר את יעילות ההון על ידי הבהרת מנגנוני ההובלה בשלב מוקדם.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של נכסי מו"פ מבוססי צמחים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול ברקמות צמחים, בהעברה ביוליסטית ובמיקרוסקופיה קונפוקלית.
- נדרשת גישה למכשור של רובה גנים (gene gun) ותשתיות לדימות ברזולוציה גבוהה.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של תנאי הבדיקה ושל פרוטוקולי ניתוח הנתונים.
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמות עבור מיני צמחים או סוגי רקמות שונים, בהתאם לחומר המקור.
- המהימנות הסטטיסטית תלויה בדגימה מספקת ובביצוע סימולטני של הניסויים.
