Name: בידוד של גזע תאים רשתית העין של העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: למדו לבודד תאי גזע רשתיתיים מקרומית העין של עכברים ולגדלם בתרבית כדי ליצור כדוריות רשתית קלונליות. שיטה זו מאפשרת חקר תכונות תאי הגזע כמו רענון עצמי ורב-פוטנציאליות לטיפול במחלות רשתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לורה קלארק סיוע שלא יסולא בפז שלה. עבודה זו נתמכת על ידי NCE: רשת לתאי גזע, CIHR ו-NIH.

1. הכן את פתרונות הביתור, פתרונות אנזימים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את נוזל השדרה מלאכותית מוחין (ACSF) ואת סרום ללא מדיה מראש ושומרים במקרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תשקלי את חומצה Kynurenic (0.2 מ"ג / מ"ל) ו להמיס 10 מ"ל של חילו ACSF ב 37 ° C waterbath מראש מאחר ואינה מוכנה לפרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תשקלי את טריפסין (1.33 מ"ג / מ"ל) ו Hyaluronidase (0.67 מ"ג / מ"ל) ומכניסים צינורית 15 מ"ל one ולשמור אותו ב -20 מעלות צלזיוס עד הצורך. מוסיפים את פתרון חומצה Kynurenic אל הצינור הזה מסנן באמצעות מזרק מסנן 22 מיקרומטר רק לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את מעכבי טריפסין (Ovamucoid: 1 מ"ג / מ"ל) ו להתמוסס סרום ללא מדיה חם מסנן באמצעות מסנן מזרק 22μm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את התקשורת ציפוי: סרום ללא מדיה המכילה FGF2 (10 ng / mL) ו הפרין (2 מיקרוגרם / מ"ל). </li></ol> 2. בידוד בתאי גזע רשתית העין של העכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של הרשתית מתאי גזע מתבצע בחדר סטרילי ספציפי המוקדש לתרבות ניסויים ראשוניים. לפני הפעלת פרוצדורה זו, להגדיר את המיקרוסקופ לנתח קר מקור אור, ולאחר מכן לפרוס את הכלים לנתח סטרילית. מכסה מנוע לכל אחד יש מעקר חרוז חם לעיקור המכשירים בין השלבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו לבודד בתאי גזע רשתית מהעיניים כי הונחו מיד בצלחת פטרי סטרילית המכילה מלאכותית נוזל השדרה מוחין (ACSF) לאחר ההסרה שלהם מעכברים הקריב על פי פרוטוקולים האתיקה אישרה בעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ הניתוחים, לנקות את העין עם מלקחיים: להיפטר משיער לבין רקמת החיבור המצורף הקרנית / גבול scleral. ואז להעביר את העין צלחת חדשה עם ACSF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד מחזיק את העין בעדינות נייח עם מלקחיים משונן, שימוש בזווית מיקרו לנתח מספריים כדי להסיר את שרירי העין. הסר את עצב הראייה גם אם היא עדיין מחוברת העין. נסו לא squish העין במהלך תהליך זה. העברת עיניים בצלחת חדשה עם ACSF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש הבא מעוקל מיקרו לנתח עם מספריים בכדי לחתוך את העין במחצית: להתחיל עצב הראייה ואת לחתוך באמצע הקרנית, פגישה בחזרה עצב הראייה שבו לחתוך יזם. הוא אידיאלי אם שני החלקים של העין שוות בערך בגודל כי זה יעשה את הצעד הבא קל יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזקת קרניות באמצעות שני מלקחיים, לקלף בעדינות עין שני חצאים בנפרד. הסר וזורקים את העדשה, הקרביים, ואת רשתית עצבית מן הפגזים העין. מעבירים את הקליפות על צלחת חדשה עם ACSF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו אנחנו מוכנים כדי לבודד את אפיתל ריסי. כדי להתחיל, לכוון את הקליפה העין כך הקרנית נמצא בצד ימין שלך ואת אפיתל פיגמנט הרשתית (הרשתית) הוא בצד שמאל. סיכה בעדינות את הקליפה עין למטה עם מלקחיים ישר בצד הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, להשתמש אזמל לחתוך את הקרנית ואת איריס הרחק אפיתל ריסי העין על ידי בעדינות דוחף את האזמל במקום להשתמש בתנועות ניסור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי זה, לחתוך את אפיתל ריסי מן הרשתית. השימוש הלא משונן מלקחיים להעביר את רצועת אפיתל ריסי על צלחת בגודל 35 מ"מ חדש המכיל ACSF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באותו אופן, לבודד את אפיתל ריסי פגז את העין השנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שתי רצועות אפיתל ריסי נאספו, להעביר את רצועות לתוך צלחת בגודל 35 מ"מ המכיל 2 מ"ל של Dispase. מניחים את המנה עם רצועות של 37 ° C בחממה במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10 דקות, להעביר את רצועות מתוך Dispase לתוך צלחת ובה 2 מ"ל של טריפסין מסונן, Hyaluronidase, וחומצה Kynurenic. מניחים את המנה על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו לחזור המיקרוסקופ לנתח. בעוד מחזיק את בלובן העין למטה עם מלקחיים ישר, השתמש התחתון של הלא משונן מלקחיים המעוגל בעדינות לגרד את אפיתל ריסי ממנו בלובן העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את בלובן העין מן המנה. כל זה יש להשאיר בצלחת עכשיו הם תאים עניין הפתרון האנזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אש מלוטש כותנה פקוק פיפטה, להעביר את הפתרון הזה לתוך צינור 14 מ"ל. Triturate פתרון זה 30 פעמים להתפרק לתאי האפיתל על ידי בעדינות לכפות פתרון בתוך ומחוץ פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור במשך 5 דקות ב 1500 סל"ד. כאשר צנטריפוגה נעשה, להסיר את הצינור מתוך צנטריפוגה בזהירות מאז התאים נוטים יורד התחתון של הצינור בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בעדינות מרבית supernatant בעזרת פיפטה אש מלוטש, ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של מעכבי טריפסין ב סרום ללא מדיה לתאים. השתמש כותנה פקוק קטן הקידוח פיפטה כדי triturate המדגם כ 50 פעמים עד שהוא השעיה תא בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור שוב במשך 5 דקות ב 1500 סל"ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולהחליפה 1 מ"ל של מדיום ציפוי שלך. Triturate בעדינות בעזרת פיפטה אש מלוטש זכוכית resuspend התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ספירתing התאים, צלחת אותם בצפיפות הרצויה בצלחת 24 באר. בדרך כלל אנחנו צלחת 10 תאים / μL ידי מילוי כל הבאר הראשונה עם בינוני ולאחר מכן להוסיף את ההשעיה התא כדי לקבל נפח סופי של 500 μL של התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת 37 ° C-CO 2 באינקובטור בו לא יועברו עד לספור את תחומי המתעוררות לאחר 7 ימים. </li></ol> 3. תוצאות של בידוד בתאי גזע רשתית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הליך זה מבוצע בהצלחה, התאים גזור אפיתל ריסי אמור להיראות כך לאחר הפרידו מצופה בצפיפות נמוכה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 7 ימים בתרבית, תאים ברשתית גזע תחומי שעולות נספרים. כדור צריך להיות מעל 75 מיקרומטר בקוטר חופשי צף להיות נחשב לתא גזע בתחום הנגזרים. (איור 2). עם זאת, תאים מסוימים תהיה מוגבלת התפשטות טופס spheroids שאינן עומדות בקריטריון הגודל לא ייספרו כתא גזע שמקורם התחומים; דוגמה spheroid כזה מוצג כאן (איור 2). </li></ol> 4. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2209/2209fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. <img src="/files/ftp_upload/2209/2209fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2.

<ol><li>Tropepe, V., Coles, B. L., Chiasson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells+in+the+adult+mammalian+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells in the adult mammalian eye.</a> Science. 287, 2032-2036 (2000).</li>
<li>Ahmad, I., Tang, L., Pham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neural+progenitors+in+the+adult+mammalian+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification of neural progenitors in the adult mammalian eye.</a> Biochem Biophys Res Commun. 270, 517-521 (2000).</li>
<li>Coles, B. L., Angenieux, B., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+isolation+and+the+characterization+of+human+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Facile isolation and the characterization of human retinal stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15772-15777 (2004).</li>
<li>Cicero, S. A., Johnson, D., Reyntjens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+previously+identified+as+retinal+stem+cells+are+pigmented+ciliary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 6685-6690 (2009).</li>
<li>Lamba, D., Karl, M., Reh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+regeneration+and+cell+replacement%3A+a+view+from+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neural regeneration and cell replacement: a view from the eye.</a> Cell Stem Cell. 2 (6), 538-549 (2008).</li>
<li>Coles, B. L., Horsford, D. J., McInnes, R. R., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+retinal+progenitor+cells+leads+to+an+increase+in+the+retinal+stem+cell+population+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Loss of retinal progenitor cells leads to an increase in the retinal stem cell population in vivo.</a> Eur J Neurosci. 23, 75-82 (2006).</li>
<li>Angénieux, B., Schorderet, F. D., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+is+a+neuronal+differentiation+factor+for+retinal+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor is a neuronal differentiation factor for retinal stem cells in vitro.</a> Stem Cells. 24 (3), 696-706 (2006).</li>
<li>Xu, S., Sunderland, M. E., Coles, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proliferation+and+expansion+of+retinal+stem+cells+require+functional+Pax6%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The proliferation and expansion of retinal stem cells require functional Pax6.</a> Dev Biol. 304, 713-721 (2007).</li>
<li>Canola, K., Angénieux, B., Tekaya, M., Quiambao, A., Naash, M. I., Munier, F. L., Schorderet, D. F., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells+transplanted+into+models+of+late+stages+of+retinitis+pigmentosa+preferentially+adopt+a+glial+or+a+retinal+ganglion+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells transplanted into models of late stages of retinitis pigmentosa preferentially adopt a glial or a retinal ganglion cell fate.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (1), 446-4454 (2007).</li>
<li>Canola, K., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cells+committed+towards+the+photoreceptor+fate+for+retinal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Generation of cells committed towards the photoreceptor fate for retinal transplantation.</a> Neuroreport. 18 (9), 851-855 (2007).</li>
<li>Djojosubroto, M. W., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells%3A+promising+candidates+for+retina+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells: promising candidates for retina transplantation.</a> Cell Tissue Res. 331 (1), 347-357 (2008).</li>
<li>Inoue, T., Coles, B. L., Dorval, K., Bremner, R., Bessho, Y., Kageyama, R., Hino, S., Matsuoka, M., Craft, C. M., McInnes, R. R., Tremblay, F., Prusky, G. T., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+functional+photoreceptor+differentiation+from+adult+human+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Maximizing functional photoreceptor differentiation from adult human retinal stem cells.</a> Stem Cells. 28 (3), 489-500 (2010).</li>
<li>Tropepe, V., Sibilia, M., Ciruna, B. G., Rossant, J., Wagner, E. F., Kooy, D. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+neural+stem+cells+proliferate+in+response+to+EGF+and+FGF+in+the+developing+mouse+telencephalon.+Dev+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev Biol.</a> , 208-201 (1999).</li>
<li>Coles-Takabe, B. L., Brain, I., Purpura, K. A., Karpowicz, P., Zandstra, P. W., Morshead, C. M., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Don%27t+look%3A+growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד בתאי גזע הרשתית מן האפיתל של ריסי העיניים העכבר 1-3. המתודולוגיה בשביל לבודד את רצועות של אפיתל ריסי יכול להשתנות, אולם אנזימים מתודולוגיה להשגת השעיה תא בודד מוטבו בפרוטוקול זה. חשוב גם כי רצועות של אפיתל ריסי שהיו מבודדים אינם מכילים כמויות גדולות של הרשתית או קרנית שכן אלה נראה שיש השפעה שלילית על המספר הכולל של הכדורים כי יכול להיות מבודד כל עין. בנוסף, סרום ללא התקשורת כי אנו עושים זאת גובשה במקור עבור המוח neurospheres 13, הוא אידיאלי לגידול תאים ברשתית תחומי גזע. כדאי גם לוודא כי התאים לא מוטרדים אחרי שהם כבר מצופה והניח בחממה כך הספירות גדל אינם מצטברים יחד 14. ברגע שתאי הגזע רשתית יצרו תחומי המשובטים, הם יכולים לסמוך כדי לקבל מספר פוטנציאלי של בתאי גזע לכל עין. הכדורים ואז לאחר מכן ניתן ניתק לתוך תאים בודדים passaged עצמית חידוש יכולות לקבוע או מובחן לתוך תאים מסוגים שונים של הרשתית הרשתית העצבית באמצעות שילובים שונים של גורמי גדילה ו / או חלבונים.

<table><tbody><tr><td>מיקרוסקופ Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מקור אור קר</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>KL1500</td><td>תאורה אופטית בעלת זרוע כפולה</td></tr><tr><td>מספרי Vannas מיני מעוקלים</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>מספרי Vannas זוויתיים</td><td>Fine Science Tools</td><td>15005-08</td><td></td></tr><tr><td>פינצטת Dumont #7</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-30</td><td>ללא שיניים</td></tr><tr><td>פינצטת Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>ישרה</td></tr><tr><td>פינצטה עדינה</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td>מעוקלת עם שיניים</td></tr><tr><td>ידית סכין מנתחים #3</td><td>Almedic</td><td>2586-M36-10</td><td></td></tr><tr><td>להבי סכין מנתחים #10</td><td>Almedic</td><td>2580-M90-10</td><td></td></tr><tr><td>סטריליזטור חרוזי חם</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>VWR international</td><td>CACB354235</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1005</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>Kynurenic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3375</td><td>1000 IU</td></tr><tr><td>מעכב Trypsin</td><td>Roche Group</td><td>10109878001</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות 35 mm</td><td>VWR international</td><td>CA354235</td><td></td></tr><tr><td>פלטת 24 בארות</td><td>VWR international</td><td>CA73521-004</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות עם פקק צמר</td><td>VWR international</td><td>14672-400</td><td>ליטוש באש</td></tr><tr><td>מבחנות 14 mL</td><td>Falcon BD</td><td>352057</td><td>Polystyrene</td></tr><tr><td>מצע ללא סרום</td><td></td><td></td><td>סימוכין #13 להרכב</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td>100 IU</td></tr></tbody></table>

בידוד של גזע תאים רשתית העין של העכבר

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

עכבר בוגר לתא גזע הרשתית (RSC) הוא תא שקט נדיר נמצא בתוך אפיתל ריסי (CE) של העין יונקים 1,2,3. CE מורכבת של אי - פיגמנטציה בשכבות הפנימיות פיגמנט התא החיצונית, המושבות RSC המשובטים הנובעות תא פיגמנט אחד מן לספירה בנויים שני תאים פיגמנט ולא פיגמנט שיכול להיות מובחן כדי ליצור כל תא סוגים של הרשתית העצבית ואת הרשתית. אין מחלוקת לגבי השאלה אם כל התאים בתוך הספירות כולם מכילים לפחות חלק פיגמנט 4, אולם התאים עדיין מסוגלים להרכיב את סוגי תאים שונים נמצא בתוך הרשתית העצבית 1-3. בכמה מינים, כגון דו חיים ודגים, עיניהם מסוגלים התחדשות לאחר פציעה 5, לעומת זאת, את העין יונקים מראה שום תכונות ההתחדשות כאלה. אנו שואפים לזהות את תא גזע in vivo ו להבין את המנגנונים לשמור על בתאי יונקים גזע רשתית שקט 6-8, גם לאחר פציעה, כמו גם להשתמש בהם כמקור פוטנציאלי של תאים כדי לעזור לתקן מודלים פיזיים או הגנטי של פגיעה בעין באמצעות השתלת 9-12. כאן אנו מתארים כיצד לבודד את התאים אפיתל ריסי מן העין העכבר לגדל אותם בתרבית על מנת ליצור את המשובטים רשתית תא גזע התחומים. מכיוון שאין סמנים ידועים של התא גזע in vivo, בתחומים אלה הם הדרך היחידה הידועה פרוספקטיבית לזהות את האוכלוסייה בתאי גזע בתוך אפיתל ריסי העין.

בסרטון זה נדגים כיצד לבודד בתאי גזע הרשתית מן אפיתל ריסי העין העכבר לגדל אותם בתרבית כדי ליצור כדורים רשתית משובט. התחומים כי הם מבודדים להחזיק את המאפיינים העיקריים של בתאי גזע: התחדשות עצמית multipotentiality.

תא הגזע הרשתי (RSC) של עכבר בוגר הוא תא שקט נדיר הנמצא בתוך האפיתל הציליארי (CE) של עין היונקים1,2,3. ה-CE מורכב מ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד תאי גזע רטינליים מהאפיתל הציליארי של העין. זאת מושג תחילה על ידי ניקוי וחיתוך העין לחצי, החל מהעצב האופטי, חיתוך דרך הקרנית וחזרה לעצב האופטי, ולאחר מכן הסרת הרשתית העצבית והעדשה. השלב השני של ההליך הוא גזירת האפיתל הציליארי על ידי הסרת הקרנית, הקשת והאפיתל הפיגמנטרי של הרשתית.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא טיפול אנזימטי באפיתל הציליארי, הסרת הסקלרה ופירוק מכני של האפיתל לתאים בודדים. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא תליה מחדש של התאים במדיום נטול סרום וזריעתם בצלחות לתרבית רקמה המכילות מדיום נטול סרום עם גורמי גדילה. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות באופן פרוספקטיבי את מספר תאי הגזע שנמצאו באפיתל הציליארי של העין באמצעות יצירת ספירות קלונאליות in vitro.שלום, שמי ברנדה קולס. המעבדה שלנו פיתחה את השיטה הזו לראשונה כאשר חקרנו מאמרים על יכולות ההתחדשות של עיניו של דו-חיים ודגים, והשערנו כי אולי קיים תא בעין של יונקים בעל יכולות דומות. בידוד תאי הגזע של הרשתית מבוצע בחדר סטרילי ייעודי לניסויי תרבית ראשונית.לפני תחילת ההליך, הגדירו את מיקרוסקופ הדיסקציה ואת מקור האור הקר, ולאחר מכן פריסו את כלי הדיסקציה הסטריליים. בכל תא מטריס (hood) קיים סטריליזטור בחום גבוה לסטריליזציה של הכלים בין השלבים. נבודד תאי גזע של הרשתית מעיניים שהונחו מיד בצלחת פטרי סטרילית המכילה נוזל חוט שדרה מלאכותי, לאחר הסרה מעכברים שהוקרבו בהתאם לפרוטוקולי אתיקה מאושרים לבעלי חיים. ההיבט המאתגר ביותר בהליך זה הוא ביצוע דיסקציה לאובייקט עגול תחת המיקרוסקופ.יש לנהוג בזהירות רבה כדי לא להרוס את הרקמה הנחקרת. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, נקה את העין באמצעות פינצטה. הסר את השערות ואת הרקמה החיבורית המחוברת לגבול הסקלרה של הקרנית. לאחר מכן, העבר את העין לצלוחית חדשה עם A CSF תוך כדי החזקת העין ללא תזוזה באמצעות פינצטה משוננת.השתמשו במספרי מיקרו-דיסקציה זוויתיים כדי להסיר את שרירי העין. הסירו גם את העצב האופטי אם הוא עדיין מחובר לעין, והשתדלו לא למעוך את העין במהלך תהליך זה. העבירו את העיניים לצלחית חדשה עם CSF.בשלב הבא השתמש במספרי מיקרו-דיסקציה קמורים כדי לחתוך את העין לשני חצאים. התחל בעצב האופטי וחתור דרך מרכז הקרנית עד לחזרה לעצב האופטי, שבו החל החיתוך. עדיף ששני חלקי העין יהיו בגודל שווה בקירוב, שכן הדבר יקל על השלב הבא.החזיקו את הקרניות באמצעות שתי פינצטות וקלפו בעדינות את שני חצאי העין זה מזה. הסירו והשליכו את העדשות, הרקמות הפנימיות (viscera) ואת הרשתית העצבית מקליפות העין. העבירו את הקליפות לצלחית חדשה עם A CSF.כעת אנו מוכנים לבודד את אפיתל השריש (ciliary epithelium). כדי להתחיל, כוון את קליפת העין כך שהקרנית תהיה מימינך ואפיתל הרשת הפיגמנטרי (retinal pigmented epithelium) יהיה משמאלך. קיבע בעדינות את קליפת העין באמצעות פינצטה ישרה בצדו של ה-RPE.בשלב הבא, השתמש בסקאלפל כדי לחתוך את הקרנית ואת הקשתית מהאפיתל הציליארי של העין, על ידי לחיצה עדינה כלפי מטה עם הסקאלפל במקום תנועות מסור. לאחר מכן, חתוך את האפיתל הציליארי מה-RPE. השתמש בפינצטה ללא שיניים כדי להעביר את רצועת האפיתל הציליארי לצלוחית חדשה של 35 millimeter המכילה A CSF.באותו אופן, בודדו את האפיתליום השרישי מהקליפה של העין השנייה. לאחר איסוף רצועות האפיתליום השרישי, העבירו את הרצועות לכלי השתילה בנפח 35 מילימטר המכיל שני מיליליטר של dis space. הניחו את הכלי עם הרצועות באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.לאחר 10 דקות, העבירו את הרצועות מהחלל למנה containing שתי מיליליטר של drips מסוננים ב-Halle ur haase ו-kind reic acid. הניחו את המנה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 10 דקות. כעת חזרו למיקרוסקופ הדיסקציה תוך כדי לחיצה על הסקלרה בעזרת פינצטה ישרה.השתמש בקצה התחתון של הפינצטה בעלת העקומה הלא-משוננת כדי לגרד בעדינות את האפיתל הציליארי מהסקלרה. הוצא את הסקלרה מהצלחת. כל שיישאר בצלחת.כעת נכין את התאים הרלוונטיים ואת תמיסת האנזימים. בעזרת פיפט עם פקק צמר שעבר היתוך בלהבה, העבירו את התמיסה למבחנה של 14 ליטר. בצעו טריטורציה לתמיסה זו 30 פעמים כדי לפרק את התאים האפיתליאליים על ידי דחיפה עדינה של התמיסה פנימה והחוצה מהפיפט, ולאחר מכן סובבו את המבחנה בצנטריפוגה במשך חמש דקות במהירות של 1500 RPM.בסיום הסבוב במצנטריפוגה, הוצא את המבחנה מהמצנטריפוגה בזהירות, מכיוון שהתאים נוטים להינתק מהקרקעית של המבחנה. בשלב זה, שאב בעדינות את רוב ה-SuperNet באמצעות פיפט שעבר ליטוש באש, ולאחר מכן הוסף לתאים 1 mL של מעכב טריפסין במצע ללא סרום.השתמשו בפיפט עם פקק כותנה וחור קטן כדי לטרטוט את הדגימה כ-50 פעמים עד לקבלת תרחיף של תאים בודדים. סבבו את המבחנה שוב בצנטריפוגה למשך חמש דקות, במהירות של 1500 RPM, הסירו את הנוזל העליון והחליפו אותו במיליליטר אחד של תמיסת הפריסה שלכם.יש לערבב בעדינות את המדיום באמצעות פיפטת זכוכית מלוטשת באש כדי להחזיר את התאים לתליה. לאחר ספירת התאים, יש לזרוע אותם בצפיפות הרצויה. בפלטה של 24 בארות, אנו זורעים בדרך כלל 10 תאים למיקרוליטר על ידי מילוי כל בארה תחילה במדיום, ולאחר מכן הוספת ת сусפנזיית התאים כדי להגיע לנפח סופי של 500 microliters של מדיום.הניחו את הצלחת באינקובטור פחמן דו-חמצני בטמפרטורה של 37 °C, שם היא תישאר ללא תזוזה עד לספירת הספירות שנוצרות לאחר שבעה ימים, במידה והפרוצדורה בוצעה בהצלחה. תאי אפיתל הריסון שפורקו אמורים להיראות כך לאחר שבוצע להם דיסוציאציה והם נזרעו בצפיפות נמוכה. לאחר שבעה ימים בתרבית, סופרות ספירות תאי הגזע של הרשתית שנוצרו.כדור צריך להיות בקוטר של מעל 75 microns ולהצוף בחופשי כדי להיספר ככדור המופק מתאי גזע. עם זאת, לחלק מהתאים תהיה התרבות מוגבלת והם יצרו PHE שאינם עומדים בקריטריון הגודל ולא ייספרו ככדורים המופקים מתאי גזע. דוגמה לאסטרואיד כזה מוצגת כאן לאחר התפתחותו.טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום מדעי הראייה לבחון את האפשרות של שימוש בתאי גזע רטינליים לטיפול במחלות רשתית.

isolation-of-retinal-stem-cells-from-the-mouse-eye

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים את ההליך לבידוד תאי גנגליון רשתית ראשוניים (RGCs) באמצעות ציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת מחקר עתידי של RGCs, במטרה להבין טוב יותר את הירידה הגדולה בחדות הראייה הנובעת מאובדן RGCs פונקציונליים במחלות נוירודגנרטיביות.

בידוד תאי גנגליון רשתית מורין באמצעות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות

מיליוני אנשים סובלים ממחלות ניוונית של הרשתית הגורמות עיוורון בלתי הפיך. מרכיב נפוץ של רבים ממחלות אלה הוא אובדן תאי הגנגליון ברשתית (RGCs). פרוטוקול מפורט זה מתאר את הבידוד של RGCs Murine העיקרי על ידי בחירה חיובית ושלילית עם cytometry הזרימה.

בידוד של תאים ראשיים Murine הרשתית גנגליון (RGCs) על ידי זרימת cytometry

אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) הוא אפיתל רב תפקודי של העין. כאן אנו מציגים פרוטוקול ליצירת תרביות תאים ראשי נגזר RPE מאתר...

התא העיקרי של אפיתל הפיגמנט ברשתית העכבר תרבויות

כתב יד זה מתאר פרוטוקול פשוטה עבור בידודו של רבים מן הרשתית עכברוש יכול לשמש אלקטרופיזיולוגיות, סידן הדמיה ואת הלחץ myography מחקרים.

בידוד של רבים ברשתית ללימודי פיזיולוגיה של התא Vivo לשעבר

פרוטוקול זה מציג שתי טכניקות לבודד את התאים התת-תאיים של קולטני מוט מורין לניתוח חלבונים. השיטה הראשונה משתמשת בשרשתית חיה ונייר סינון תאית כדי להפריד מקטעים חיצוניים מוט, ואילו השני משתמש ברשתית ליופילית וקלטת דבק כדי לקלף שכבות מגזר פנימיות וחיצוניות מוט.

שתי שיטות פילינג לבידוד תאי קולטני אור ברשתית העכבר לניתוח חלבונים

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד תאי אנדותל רשתית לאחר הלידה הממוטבת לתפוקת התאים, טוהר וכדאיות. תאים אלה מתאימים לגישות ריצוף מהדור הבא.

בידוד תאי אנדותל רשתית מורין לריצוף הדור הבא

כתב יד זה מתאר פרוטוקול פשוט לבידוד תאי אפיתל פיגמנטציה ברשתית (RPE) מעיני עכבר באופן מדורג. הפרוטוקול כולל אנוקליזציה ונתיחה של עיני עכבר, ולאחר מכן בידוד, זריעה והתרבות של תאי RPE.

בידוד של תאי אפיתל פיגמנטים ברשתית של עכברים ראשוניים

אנו מתארים שיטה פשוטה ויעילה לבידוד תאים של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) מעיניהם של שרקנים צעירים בעלי פיגמנט. הליך זה מאפשר מעקב אחר מחקרי ביולוגיה מולקולרית על RPE המבודד, כולל ניתוח ביטוי גנים.

בידוד תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעיני חזיר גינאה

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט לבידוד תאי גליית הרשתית מעיני עכבר. הפרוטוקול מתחיל באינקולציה ודיסקציה של עיני עכבר, ואחריו בידוד, זריעה וטיפוח של תאי מולר.

בידוד תאי גליית גליה ראשוניים ברשתית העכבר

אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE) פועל כמחסום מכריע בין הכורואיד לרשתית, ומקדם את בריאותם ותפקודם של סוגי תאי רשתית, כגון פוטורצפטורים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול פשוט ויעיל לבידוד וטיפוח RPE של מורין בוגר.

שיטה פשוטה לבידוד ותרבית של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעכברים בוגרים

כאן, אנו מספקים מתודולוגיה מפורטת לבידוד הרשתית מעין העכבר לניסויים ממושכים ex vivo . פרוטוקול זה מדגיש את הנגשת הגישה התובענית מבחינה טכנית לחוקרים המעוניינים לנצל את דרכי המחקר הניתנות על ידי שמירה על גליה ברשתית באתרה ברקמה חיה.

מודל ex vivo explant לחקר אינטראקציות גליה ברשתית העכבר

למדו לבודד תאי גזע רשתיתיים מקרומית העין של עכברים ולגדלם בתרבית כדי ליצור כדוריות רשתית קלונליות. שיטה זו מאפשרת חקר תכונות תאי הגזע כמו רענון עצמי ורב-פוטנציאליות לטיפול במחלות רשתית.

בידוד של גזע תאים רשתית העין של העכבר

גלה סרטונים נוספים