בידוד של גזע תאים רשתית העין של העכבר

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד תאי גזע ברשתית מהאפיתל הריסי של העין. זה מושג על ידי ניקוי וחיתוך העין לשניים, החל מעצב הראייה, חיתוך דרך הקרנית ומפגש בחזרה לעצב הראייה, ולאחר מכן הסרת הרשתית העצבית והעדשה. השלב השני של ההליך הוא חיתוך האפיתל הריסי על ידי כריתת קשתית הקרנית ואפיתל פיגמנט הרשתית.

השלב השלישי של ההליך הוא טיפול אנזימטי באפיתל הריסי, הסרת הסקלרה ופירוק מכני של האפיתל לתאים בודדים. השלב האחרון של ההליך הוא השעיית התאים במדיה נטולת סרום וצלחת אותם בצלחות תרבית רקמה המכילות מדיה נטולת סרום עם גורמי גדילה. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות באופן פרוספקטיבי את מספר תאי הגזע הנמצאים באפיתל הריסי של העין דרך הכדור המשובט והיווצרות במבחנה.

היי, שמי ברנדה קולס. המעבדה שלנו הגיעה לראשונה לשיטה הזו כשחקרנו מאמרים על יכולות ההתחדשות של דו-חיים ודגים בעיניהם, ושיערנו שאולי יש תא בעין של יונקים עם אותן יכולות. בידוד תאי הגזע ברשתית מתבצע בחדר סטרילי ספציפי המוקדש לניסויי תרבית ראשוניים.

לפני שתתחיל בהליך זה, הגדר את מיקרוסקופ החיתוך ומקור האור הקר ולאחר מכן פרש את מכשירי החיתוך הסטריליים. לכל מכסה מנוע יש מעקר פעימות חמות לעיקור המכשירים בין השלבים. נבודד תאי גזע ברשתית מעיניים שהוכנסו מיד לצלחת פטרי סטרילית המכילה נוזל מוחי מלאכותי לאחר ההסרה מעכברים שהוקרבו על פי פרוטוקולי אתיקה מאושרים של בעלי חיים, ההיבט הקשה ביותר בהליך זה הוא ניתוח אובייקט עגול תחת המיקרוסקופ.

יש לנקוט בזהירות רבה כדי לא להרוס את הרקמה המעניינת תחת המיקרוסקופ המנתח, יש לנקות את העין בעזרת מלקחיים. היפטרו מהשיער ומהרקמה המחוברת המחוברת לגבול הקרנית. לאחר מכן העבירו את העין לכלי חדש עם CSF תוך החזקת העין נייחת עם מלקחיים משוננים.

השתמש במספריים לניתוח מיקרו בזווית כדי להסיר את שרירי העין. הסר גם את עצב הראייה אם הוא עדיין מחובר לעין, נסה לא למעוך את העין במהלך תהליך זה. העבירו את העיניים למנה חדשה עם CSF.

לאחר מכן השתמש במספריים מיקרו מנתחים מעוקלים כדי לחתוך את העין לשניים. התחל בעצב הראייה וחתך דרך אמצע הקרנית המפגש בחזרה לעצב הראייה שבו התחיל החתך. זה אידיאלי אם שני חלקי העין שווים בערך בגודלם מכיוון שזה יקל על הצעד הבא.

מחזיקים את הקרניות בעזרת שני מלקחיים, מקלפים בעדינות את שני חצאי העיניים זה מזה. הסר והשליך את העדשות, הקרביים והרשתית העצבית מקונכיות העיניים. מעבירים את הקליפות לכלי חדש עם A CSF.

כעת אנו מוכנים לבודד את האפיתל הריסי. כדי להתחיל, כוון את מעטפת העין כך שהקרנית תהיה מימינך והאפיתל הפיגמנטי ברשתית יהיה משמאלך. הצמידו בעדינות את מעטפת העין כלפי מטה בעזרת מלקחיים ישרים בצד ה-RPE.

לאחר מכן, השתמשו באזמל כדי לחתוך את הקרנית והקשתית הרחק מהאפיתל הריסי של העין על ידי לחיצה עדינה כלפי מטה על האזמל במקום להשתמש בתנועות ניסור. לאחר מכן, חתוך את האפיתל הריסי הרחק מה- RPE. השתמש במלקחיים לא משוננים כדי להעביר את רצועת האפיתל הריסי לצלחת חדשה של 35 מילימטר המכילה CSF.

באותו אופן, בודד את האפיתל הריסי ממעטפת העין השנייה. לאחר איסוף רצועות האפיתל הריסי, העבירו את הרצועות לצלחת של 35 מילימטר המכילה שני מיליליטר של חלל דיס. מניחים את המנה עם הרצועות בחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

לאחר 10 דקות, העבירו את הרצועות מהחלל לכלי המכיל שני מיליליטר של טפטפות מסוננות ב-Halle your haase ו-kind reic acid. מניחים את המנה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. כעת חזור למיקרוסקופ הניתוח תוך החזקת הסקלרה כלפי מטה בעזרת מלקחיים ישרים.

השתמש בתחתית העקומה מלקחיים לא מדורגים כדי לגרד בעדינות את האפיתל הריסי הרחק מהסקלרה. מוציאים את הסקלרה מהצלחת. כל מה שצריך להשאיר בכלי.

עכשיו הם התאים המעניינים ותמיסת האנזים. בעזרת פיפטה סתומה מכותנה מלוטשת אש, העבירו את התמיסה לצינור של 14 ליטר. טרטר את התמיסה הזו 30 פעמים כדי לפרק את תאי האפיתל על ידי דחיפה עדינה של התמיסה פנימה והחוצה מצנטריפוגת הפיפטה של הצינור למשך חמש דקות ב-1500 סל"ד.

בסיום הצנטריפוגה, הסר את הצינור מהצנטריפוגה בזהירות. מכיוון שהתאים נוטים לרדת מתחתית הצינור. בשלב זה, שאפו בעדינות את רוב ה-SuperNet באמצעות פיפטה מלוטשת אש ולאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של מעכב טריפסין במדיה נטולת סרום לתאים.

השתמש בפיפטה קטנה מכותנה סתומה כדי למשוך את הדגימה כ-50 פעמים עד שהיא מתלה תא יחיד. צנטריפוגה שוב את הצינור למשך חמש דקות. ב-1500 סל"ד, הסר את הסופרנטנט והחלף במיליליטר אחד מהציפוי שלך.

מקררים בינוניים בעדינות באמצעות פיפטת זכוכית מלוטשת באש כדי להשעות מחדש את התאים. לאחר ספירת התאים צלחו אותם בצפיפות הרצויה. בצלחת של 24 בארות, אנו בדרך כלל לוחים 10 תאים למיקרוליטר על ידי מילוי כל באר תחילה במדיום, ולאחר מכן הוספת תרחיף התא כדי לקבל נפח סופי של 500 מיקרוליטר מדיה.

הנח את הצלחת בחממת פחמן דו חמצני של 37 מעלות צלזיוס, שם היא לא תועבר עד שתספור את הכדורים שמתעוררים לאחר שבעה ימים כאשר הליך זה מבוצע בהצלחה. תאי האפיתל הריסיים המנותחים אמורים להיראות כך לאחר ניתוק וציפוי בצפיפות נמוכה. לאחר שבעה ימים בתרבית, נספרים כדורי תאי הגזע ברשתית שמתעוררים.

כדור צריך להיות בקוטר של יותר מ-75 מיקרון וצף חופשי כדי להיספר ככדור שמקורו בתאי גזע. עם זאת, תאים מסוימים יהיו בעלי ריבוי מוגבל ויוצרים PHE שאינם עומדים בקריטריון הגודל ולא ייספרו ככדורים שמקורם בתאי גזע. דוגמה לאסטרואיד כזה מוצגת כאן לאחר פיתוחו.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי הראייה לבחון את האפשרות להשתמש בתאי גזע ברשתית לטיפול במחלות רשתית.